ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ

I Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ

Синичкина А.А. 1
1МБОУ лицей №40 г. Нижний Новгород
Автор работы награжден дипломом победителя I степени
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

 


ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ: актуальность, научная гипотеза, цель и задачи исследования

3

1.1. Значимость работы для оценки возможного экологического риска

4

1.2. Практическая значимость

4

2.1. Характеристика объекта и районов исследования

4

2.2. Микроядерный тест

5

2.3. Статистический анализ

6

3.1. Анализ цитогенетических показателей зеленых лягушек

6

Заключение

9

Список литературы

10

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и новизна работы. Антропогенное загрязнение окружающей среды способствует росту мутационного груза и, как следствие, приводит к изменению некоторых генетических параметров в популяциях человека (например, врожденных пороков развития). В настоящее время, в связи с организацией эколого-генетического мониторинга человека, наряду с отслеживанием мутагенных факторов среды параллельно осуществляется мониторинг за популяциями организмов, территориально сосуществующих рядом с людьми, в том числе, амфибиями. Имеется достаточно фактов свидетельствующих о росте генетических уродств и аномалий развития лягушек в условиях химического и радиационного заражения территории (Вершинин, 2004; Максимов, 2010), что определяет повышенное внимание исследователей к выявлению загрязнений среды обитания мутагенными факторами различной природы. Актуальность работы обусловлена необходимостью выявления цитологических особенностей живых организмов в условиях промышленного загрязнения окружающей среды различными химическими веществами.

Озерные лягушки имеют 26 мелких хромосом, что значительно затрудняет анализ генетических изменений в клетках стандартным метафазным методом (Ильинских и др., 1998). Одним из новых методов оценки мутагенного действия агентов разной природы на организм является микроядерный тест. Микроядра в клетках образуются при нарушении процессов митоза или образовании ацентрических хромосомных фрагментов вследствие мутаций (Das et al., 1994).

Научная гипотеза. Изучение цитогенетической изменчивости популяций организмов, сосуществующих рядом с человеком, позволит выявить и определить уже на ранних этапах характер, специфику и механизмы воздействия мутагенных факторов среды на генетический материал клеток, что необходимо для обоснования решений в природоохранной деятельности.

Цель работы: дифференцированная оценка видов микроядер в эритроцитах крови популяций лягушек рода Pelophylax (озёрных и прудовых) водоёмов заречной части г. Нижнего Новгорода.

Задачи:

1. Провести дифференцированный подсчет доли клеток с микроядрами в периферической крови зеленых лягушек рода Pelophylax.

2. Провести анализ зависимости цитогенетических показателей периферической крови зеленых лягушек от содержания в водоеме химических элементов природного и техногенного происхождения.

1.1. Значимость работы для оценки возможного экологического риска. На основе результатов цитогенетического анализа дана оценка степени антропогенной нагрузки на водные экосистемы и выявлено эколого-генетическое неблагополучие водоемов, находящихся в качественно неблагоприятных условиях среды, что представляет угрозу для жизнедеятельности живых организмов.

1.2. Практическая значимость. Применение цитогенетического подхода для оценки состояния природных популяций расширяет методологическую базу биоиндикационных исследований и позволяет адекватно оценить качество среды обитания. Полученные экспериментальные данные могут быть представлены органам местного самоуправления, государственным и общественным организациям для принятия решения по охране и восстановления водных объектов и прилегающих территорий.

2.1. Характеристика объекта и районов исследования

В Нижегородской области обитает три вида зеленых лягушек этого рода (Амфибии и рептилии Нижегородской области…, 2001): озерная (Pelophylaxridibundus Pallas, 1771); прудовая (Pelophylaxlessonae Camerano, 1882) и съедобная (Pelophylaxesculentus Linnaeus,1758).

Объектом исследований являлись половозрелые особи зеленых лягушек: озерной - Pelophylaxridibundus Pallas, 1771 и прудовой -Pelophylaxlessonae Camerano, 1882 отловленные с помощью сачка в течение полевого сезона 2015 года в трех водоемах заречной части города Нижнего Новгорода: 10 озерных лягушек в оз. Лунское, 10 озерных лягушек в оз. Сормовской ТЭЦ и 10 прудовых лягушек в оз. Вторчермет.

2.2. Микроядерный тест. Для оценки цитогенетического гомеостаза озерных лягушек использовали микроядерный тест, основанный на подсчете эритроцитов с микроядрами (Жулева, Дубинин, 1994). Готовые мазки крови (окрашенные краской Романовского – Гимзы в течение 15-20 мин.).

Учет микроядер производили с помощью светового микроскопа Meiji Techno, с камерой Vision CAM, при общем увеличении 1350 с иммерсией. У каждой особи был произведен забор крови и приготовлены мазки крови (по два препарата на каждую особь). В каждом препарате подсчитывалось количество клеток, содержащих микроядра, в расчете на 1000 эритроцитов.

В приготовленных мазках крови дифференцировали следующие виды микроядер (рис. 1):

Рис. 1. Виды микроядер

  1. Стандартные – небольшого размера, имеют четкий контур, не связаны с ядром, а располагаются вблизи него.

  2. Поверхностные – небольшие ядерные образования, находятся на поверхности ядра эритроцита.

  3. М-а с нуклеосомным мостиком – ядерные образования, соединённые с ядром хроматиновой нитью и лежащие вблизи него.

  4. Палочковидные – удлинённые ядерные образования, по форме напоминающие палочки, располагаются вблизи ядра.

  5. Клубочковидные – неоформленный ядерный материал, результат слияния нескольких «палочек».

  6. Крупные м-а – разрыхлённый ядерный материал больших размеров.

Число микроядер выражали в o/oo к общему количеству просмотренных клеток.

2.3. Статистический анализ. Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с расчетом непараметрических критериев: Крускала-Уоллеса (при множественном сравнении групп), Данна (при попарном сравнении групп), коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при исследовании связи признаков), реализованных в пакете прикладных программ Statistica v.10.0. За величину статистической значимости принимали p = 0,05.

3.1. Анализ цитогенетических показателей озерных и прудовых лягушек рода Pelophylax

У всех лягушек, обитающих в исследованных водоемах, были обнаружены клетки, содержащие микроядра. Оба вида лягушек (озерные и прудовые) обнаружили высокое суммарное содержание микроядер в эритроцитах периферической крови: оз. Лунское (11.57±0.70)‰, оз. Сормовской ТЭЦ (10.15±0.44)‰, оз. Вторчермет (13.15±1.08)‰. При этом у популяции озерных лягушек, обитающей в оз. Лунское, выявлены наиболее низкое содержание палочковидных (0.37±0.14)‰ и наиболее высокое содержание поверхностных микроядер (5.47±0.52)‰, по сравнению с другими популяциями. При сравнении доли клеток микроядрами разных видов показано, что у популяции оз. Лунского 47% от всех видов микроядер составляли поверхностные микроядра, у популяции оз. Сормовской ТЭЦ 35% палочковидные ядра, у прудовых лягушек оз. Вторчермет максимальную долю (32%) составляли поверхностные микроядра (рис. 2).

Рис. 2. Доля клеток с микроядрами (%) в эритроцитах крови прудовых лягушек

оз. Вторчермет

Дифференцированный учет микроядер по видам выявил значимые расхождения по количеству палочковидных и поверхностных микроядер в периферической крови двух видов зеленых лягушек. Доли микроядер стандартного типа в популяциях трех водоемов: оз. Лунское, оз. Вторчермет и озера рядом с Сормовской ТЭЦ статистически значимо не различались между собой, что подтверждалось как критерием множественного сравнения Крускала Уоллеса (Н=0.89, р=0.64), так и попарным критерием Данна (Z1-3 = 0.46, p = 1.0; Z1-2 = 0.92, p = 1.0; Z2-3 = 0.47, p = 1.0).

Высокое содержание поверхностных микроядер выявлено в периферической популяции озерных лягушек оз. Лунское (5.47±0.52) и популяции прудовых лягушек оз. Вторчермет (4.25±0.66), превосходящее долю микроядер аналогичного типа в периферической крови популяции озерных лягушек оз. Сормовской ТЭЦ (Z1-2 = 4.86, p = 0.000003; Z2-3 = 3.37, p = 0.002) в 4.05 раза и 3.1 раза, соответственно.

Известно, что наличие в клетках микроядер этих видов является результатом цитогенетического нарушения, произошедшего в организме лягушек под воздействием мутагенов окружающей среды (Ильинских и др., 1992; Жулева, Дубинин, 1994 и др.). По размерам микроядер можно судить об изменениях, произошедшем в хромосомном наборе клеток. Появление клеток с мелкими микроядрами вызвано преимущественно структурными аберрациями хромосом, а более крупных связано с нарушениями веретена деления, что приводит к отставанию хромосом в анафазе (Ильин, 2006). Для определения в среде обитания веществ, индицирующих образование микроядер, был проведен количественный химический анализ воды исследованных водоемов в Отделе мониторинга за состоянием окружающей среды (нач. отдела к.х.н. Губанов Д.Л.).

Рис. 3. График корреляции доли клубочковидных микроядер (‰)в крови зеленых лягушек и содержания цинка (мг/л) в водоемах г. Нижнего Новгорода

Химический анализ качества воды исследуемых водоемов показал значительное превышение ПДК химических элементов природного и техногенного происхождения в воде оз. Сормовской ТЭЦ и оз Вторчермет. Менее загрязненным следует считать оз. Лунское, в котором отмечено превышение ПДК для двух показателей: содержание нефтепродуктов (в 8,2 раза), цинка (в 3,2 раза) для рыбохозяйственного норматива. Корреляционный анализ выявил положительную сильную взаимосвязь интенсивности образования клубочковидных микроядер (образование которых связано преимущественно структурными аберрациями хромосом) от содержания в воде тяжелых металлов: меди (мг/л): (r = 0.99, p = 0.009) и цинка (мг/л): (r = 0.99, p =0.0032) (рис. 3).

Заключение

Выявлено высокое содержание микроядер в эритроцитах крови двух популяций (оз. Лунское, оз. Сормовской ТЭЦ) озерных (Pelophylaxridibundus Pallas, 1771) и прудовых (Pelophylaxlessonae Camerano, 1882) лягушек (оз. Вторчермет), свидетельствующее о схожей цитогенетической стабильности изученных видов. Выявлено преобладание поверхностных микроядер у популяции озерных лягушек оз. Лунского (47%) и прудовых лягушек оз. Вторчермет (32%). У популяции оз. Сормовской ТЭЦ 35% приходилось на палочковидные микроядра. Установлена сильная положительная взаимосвязь интенсивности образования клубочковидных микроядер (образование которых связано преимущественно структурными аберрациями хромосом) и содержания в воде тяжелых металлов: меди (мг/л): (r = 0.99, p = 0.009) и цинка (мг/л): (r = 0.99, p = 0.0082).

Постоянное существование в условиях повышенного загрязнения приводит к выработке у животных защитных механизмов адаптации, позволяющих им выживать и размножаться. Для меди и цинка описано несколько механизмов их обезвреживания при поступлении в организм: образование комплексов с хелаторами (Sanjaya et al., 2008), синтез стрессовых белков (Clemens, 2001), синтез металлотионеонов (Zhigang et al., 2006, DalCorso et al., 2008) и др.

Проведенный дифференцированный подсчет микроядер в крови зеленых лягушек свидетельствует об уровне трансформации природных сообществ и нарушении цитогенетической стабильности организмов, обитающих в условиях повышенного загрязнения среды. Полученные результаты диктуют необходимость комплексных исследований, с использованием цитогенетических характеристик живых организмов, для получения более объективной информации о состоянии природных экосистем.

Список литературы

  1. Булгаков, Н.Г. Индикация состояния природных экосистем и нормирование факторов окружающей среды: обхор существующих подходов – Успехи современной биологии, 2002 – т. 122. №2. С. 115-135

  2. Гелашвили, Д.Б. Экологическое состояние водных объектов Нижнего Новгорода / Д.Б. Гелашвили, А.Г. Охапкин, А.И. Доронина, В.И. Колкутин, Е.Ф. Иванов. – Н.Новгород, изд-во ННГУ, 2012. – 524 с.

  3. Жулева, Л.Ю. Анализ микроядер и других аномалий ядра в клетках слизистой оболочки ротовой полости женщин, подвергающихся действию экотоксикантов, содержащих диоксины / Л.Ю. Жулева, Н.В. Умнова // Цитология. – Санкт-Петербург. – 2000. – №3. – 281 с.

  4. Жулева, Л.Ю., Использование микроядерного теста для оценки экологической обстановки в районах Астраханской области / Л.Ю. Жулева, Н.П. Дубинин // Генетика, 1994. – Т. 30. – № 7. – С. 999 – 1004.

  5. Ильин, Д.А. Аспекты формирования микроядер / Д.А. Ильин // Сборник науч. тр. Естествознание и гуманизм. Новосибирск, 2006. – Т. 3. – Вып. 3. – С. 43–65.

  6. Ильинских, Н. Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность / Н. Н. Ильинских, В. В. Новицкий, Н. Н. Ванчугова, И.Н. Ильинских. – Томск: Изд-во ТГУ. – 1992. -270 с.

  7. Кузьмин С. Л. Земноводные бывшего СССР. — М.: Товарищество научных изданий КМК, 2012. — 2-е изд. — 370 с.

  8. Леонтьева О.А., Семенов Д. В. Земноводные как биоиндикаторы антропогенных изменений среды // Успехи современной биологии. 1997. Т.117, №6. С. 726 – 736.

  9. Лягушка озёрная [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://mr-1.ru/PHOTO/AMPHIBIAS/rana_ridibunda.htm

  10. Логинов, В. В. Фенотипическая изменчивость и цитогенетические характеристики природных популяций зеленых и бурых лягушек, обитающих на антропогенно-трансформированных и заповедных территориях: автореф. дис. канд. биол. наук / В. В. Логинов. – Н.Н.:ННГУ. – 2004. – 23 с.

  11. Монахова, М. Я. Цитогенетический мониторинг на Звенигородской биостанции. [Электронный ресурс] – М.:1998. – режим доступа: URL: http://herba.msu.ru/russian/biostantion/tezis/54.html

  12. Романова, Е.Б. Мониторинг состояния иммунной системы зелёных лягушек рода Rana в условиях антропогенной трансформации городской среды / Е.Б. Романова // Вестник ННГУ, 2010. – Вып. 1. – С. 128–131.

  13. Романова, Е.Б. Оценка качества среды водных объектов урбанизированной территории по стабильности развития амфибий / Е.Б. Романова, Е.А. Южина, М.И. Тихонова // Проблемы региональной экологии. – 2013. №2. – С. 82-87

  14. Фраш, В.Н. Микроядерный тест как краткосрочный метод выявления потенциальной онкогенности различных групп химических веществ / В.Н. Фраш, Н.Н. Ванчугова // Экспериментальная онкология. 1991. – Т.9. – №2. – С. 8–14.

  15. Fournier, M. Immunotoxicology of amphibians / M. Fournier, J. Robert, H. Salo, C. Dautremepuits, P. Brousseau // Applied herpetology. – 2005. – №2. – P. 297-309.

  16. Pawitan, J.A. Sensitivity and specificity of the micronucleus test in hypotonic swollen mononuclear leukocytes compared to the micronucleus test in binucleated lymphocytes to assess chromosomal breaks / J.A. Pawitan, I.A. Suryono // Anal. Quant. Cytol. Histol. 2006. – № 3. – Р. 175–180.

Просмотров работы: 834