IV Международный конкурс
научно-исследовательских и творческих работ учащихся
«СТАРТ В НАУКЕ»
 
     

ВЫРАЩИВАНИЕ КОЛОВРАТОК BRACHIONUS PLICATILIS НА МИКРОВОДОРОСЛЯХ РАЗНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП
Кваша А.В.
Текст научной работы размещён без изображений и формул.
Полная версия научной работы доступна в формате PDF


Введение

Проблема кормов относится к числу важнейших проблем морской аквакультуры. При выращивании водных животных в искусственных условиях используемые корма должны полностью удовлетворять потребности организма рыб или беспозвоночных в питательных веществах (белках, жирах и углеводах), минеральных солях, микроэлементах и витаминах. На разных этапах развития гидробионтов пища должна быть соответствующего размера и формы [3]. Особенно остро в аквариумистике стоит вопрос о кормлении мальков рыб и мелких беспозвоночных животных. Например, кораллы, у которых нет симбиотических водорослей зооксантелл, должны получать корм извне, а поскольку в аквариумах обычно развивается небольшое количество зоопланктона, то в отсутствие дополнительного корма они находятся в угнетенном состоянии (рис.1, А и Б). Для поддержания нормального, здорового состояния коралла, его нужно кормить искусственно минимум раз в неделю [1, 2].

Рисунок 1. А) Голодная и очень слабая тубастрея в отсаднике на откорме.

Б) Сильная сытая тубастрея на постоянном месте в аквариуме.

Еще одна проблема – это выращивание мальков, в частности их выкармливание. Важным этапом в жизни многих водных животных становится переход к самостоятельному питанию. Оказывается, что рыбы и ракообразные особенно требовательны к кормам именно на ранних этапах онтогенеза. Установлено, что для нормального развития и оптимального роста личинок и молоди культивируемых гидробионтов предпочтительны живые корма. В морской аквакультуре используются те кормовые организмы, которые можно выращивать в необходимом количестве в искусственных условиях [3]. Солоноватоводные коловратки - традиционный начальный живой корм для личинок морских рыб и беспозвоночных в условиях искусственного выращивания. По размерно-морфологическим характеристикам они подходят большинству личинок морских организмов в качестве стартового живого кормового организма при переходе на внешнее питание (Рис. 2) [11, 13, 15].

Рисунок 2. Использование микроводорослей в аквакультуре

С точки зрения затрат эффективное культивирование коловраток опирается на дешевые питательные источники, поэтому пекарские дрожжи были и остаются основным компонентом питательных эмульсий для их кормления. Однако хорошо известно, что на дрожжевом рационе коловратки испытывают недостаток незаменимых жирных кислот, необходимых для высоких показателей роста рыб и беспозвоночных [6]. Но многие исследователи считают, что культивирование коловраток как корма для морских гидробионтов необходимо проводить на одноклеточных микроводорослях. Одноклеточные водоросли удовлетворяют требованиям массового культивирования коловраток по множественным параметрам. В отличие от дрожжей они: 1) более питательны, и коловратки, питающиеся ими, соответствуют по биохимическому составу потребностям личинкам морских рыб для нормального роста и развития (табл. 1); 2) находятся в толще воды в подвижном состоянии, а не оседают на дно, как дрожжи; 3) в связи с этим, в отличие от последних, не создают благоприятные условия для развития простейших, весьма нежелательных при массовом культивировании коловраток, ибо их токсины отрицательно воздействуют на рост культуры, а сами они являются пищевыми конкурентами коловраток и создают дефицит кислорода; 4) улучшают гидрохимический фон среды, включая в свой метаболизм отходы жизнедеятельности организмов в форме как неорганических, так и органических соединений [15].

Таблица 1

Максимальное содержание (% от сухого веса) белка, углеводов, липидов в кормовых микроводорослях и их суммарная калорийность (ккал/г СВ).

Вид водорослей

Белок

Углеводы

Липиды

Суммарная калорийность

Phaeodactylum tricornutum [15]

40,7

20,8

20,0

4,77

Tetraselmis suecica [15]

40,35

21,32

27,0

4,17

Isochrysis galbana [15]

49,8

28,4

25,6

6,24

Chlorella sp.[7]

40 - 55

35

5 - 10

4,15

В Севастопольском морском Аквариуме-музее огромное количество гидробионтов, содержащихся в искусственных экосистемах. Это не только рыбы, но и многие представители беспозвоночных. В связи с необходимостью обеспечения их качественным живым кормом, возникла необходимость освоения методов культивирования морского зоопланктона, в частности, солоноватоводной коловратки Brachionus plicatilis.

Поэтому, целью данной научно-исследовательской работы было получение количественных характеристик процесса выращивания коловраток Brachionus plicatilis на микроводорослях разных таксономических групп, рекомендуемых для этих целей: Isochrysis galbana, Chlorella sp., Phaeodactylum tricornutum и Tetraselmis suecica [4, 12, 13]. Для достижения поставленной цели следовало решить ряд задач:

  1. Ознакомиться с литературой по теме исследования;

  2. Изучить теоретические основы культивирования микроводорослей и коловраток;

  3. Подготовить посуду и необходимое оборудование;

  4. Освоить микроскопию с использованием микроскопов БИОЛАМ и МБС с различным увеличением;

  5. Приготовить среду Уолна для культивирования микроводорослей;

  6. Освоить методы подсчета микроводорослей (в камере Горяева) и коловраток (в камере Богорова);

  7. Произвести посев микроводорослей в подготовленную среду;

  8. Вести ежедневный подсчет количества клеток водорослей в накопительной культуре;

  9. Произвести высев культуры коловраток в емкости с накопительными культурами микроводорослей;

  10. Вести ежедневный количественный учет клеток водорослей и коловраток;

  11. Свести все полученные данные в таблицы, произвести необходимые расчеты, построить графики;

  12. Рассчитать стоимость проекта по получению живых кормов;

  13. Сделать выводы.

Материалы и методы

В качестве пищевых объектов в экспериментальных исследованиях коловраток были использованы следующие микроводоросли (табл. 2) [11]:

Таблица 2

Размерные характеристики и объемы клеток микроводорослей

Вид микроводорослей

Длина клетки (мкм)

Объем клетки (мкм3)

Класс

Isochrysis galbana

3 – 5

39,19

Prymnesiophyceae

Chlorella sp.

2 – 4

14,14

Trebouxiophyceae

Phaeodactylum tricornutum

4 – 5

113,0

Bacillariophyceae

Tetraselmis suecica

7 - 14

505,3

Prasinophyceae

Источником моновидовых накопительных культур этих микроводорослей служили линии микроводорослей, выращенные группой культивирования рыб отдела аквакультуры и морской фармакологии ИМБИ РАН, исходно полученные из музея-коллекции живых культур морских микроводорослей ИМБИ РАН (ранее ИнБЮМ).

Isochrysis galbana – золотистая микроводоросль. Клетки сферические подвижные, с двумя равными жгутиками [16].

Tetraselmis suecica - зеленая микроводоросль. Клетки зеленые, овальные. Клетки подвижные с 4 жгутиками длиной 7,5 мкм. Имеют мягкую оболочку. Обладают высокой скоростью размножения, до 4 делений в сутки [16].

Рhaeodactylum tricornutum - одноклеточные диатомовые водоросли [17].

Chlorella sp.- микроскопическая зеленая водоросль [8].

Рисунок 2. Схема подготовки питательной среды и массового культивирования микроводорослей.

Использованные в экспериментах микроводоросли выращивали в накопительном режиме на основе стерилизованной черноморской воды обогащенной средой Уолна [9], при температуре 23 ± 1.5 ºС. Круглосуточное освещение интенсивностью 900 lux осуществляли с помощью люминесцентных ламп для растений FLUORA L18W/77 (рис. 2).

Brachionusplicatilis Muller - солоноватоводная (диапазон солености 9-32‰) планктонная коловратка со слабовыраженной пищевой избирательностью, предпочитающая клетки 1-15 м в диаметре, питающаяся бактериями, дрожжами, одноклеточными водорослями [15].

Малые размеры, невысокая подвижность и толерантность к аутоингибированию при высоких плотностях определяют их технологичность при выращивании в массовых культурах. При искусственном культивировании используют обычно партеногенетические клоны коловраток Brachionus plicatilis, которые состоят из диплоидных самок, воспроизводящих себе подобных, полностью идентичных дочерних особей с диплоидным набором хромосом. Эти клоны очень технологичны в эксплуатации, так как их продукционные показатели значительно выше циклично партеногенетических культур коловраток [11].

Культура коловраток Brachionus plicatilis была добавлена в культуры микроводорослей, находящихся в стадии экспоненциального роста, которые считаются более качественным кормом.

Партеногенетическая культура коловраток Brachionusplicatilis Mulleri – из коллекции живых культур планктона группы культивирования рыб отдела аквакультуры и морской фармакологии ИМБИ РАН.

Определение плотности (численности) клеток водорослей методом прямого подсчета в камере Горяева [10]. Содержимое колбы с водорослями перемешивали вручную, затем пипеткой отбирали суспензию водорослей (аликвоту) и наносили по одной капле на верхнюю и нижнюю части сетки счетной камеры Горяева. Затем камеру накрывали покровным стеклом, которое притирали по бокам до появления колец интерференции. Капли суспензии водорослей наносили не подряд из одной пипетки, а при двукратном взятии суспензии в пипетку из одной и той же колбы.Через 1-2 мин после оседания клеток водорослей камеру Горяева помещали под объектив бинокулярного микроскопа БИОЛАМ ЛОМО с фазовым контрастом КФ-4 и подсчитывали количество клеток водорослей во всех 25 больших квадратах сетки.Плотность (численность) клеток водорослей в 1 см суспензии водорослей рассчитывали по формуле:

,

где m – суммарное количество клеток водорослей в учтенных больших квадратах сетки;

104 – коэффициент пересчета кубических миллиметров в кубические сантиметры.Плотность (численность) клеток водорослей подсчитывают в каждой колбе, отбирая по две аликвоты.

Биомасса водорослей. Принимая удельный вес клетки пресноводных и солоноватоводных видов равным единице, биомассу водорослей вычисляли по формуле [5]:

(мкг/мл), где

– биомасса, – объем клетки, ρ – удельный вес

Численность коловраток Brachionus plicatilis определяли прямым подсчетом в камере Богорова [14].

Удельную скорость роста (μср.) за определенный промежуток времени определяли по формуле:

(сут-1), где

X1 и X0 – биомасса организмов соответственно в начале и конце роста;

t1 – t0– время роста [4, 5].

Обсуждение полученных результатов

Наиболее энергосберегающий способ культивирования - накопительный - широко применяется в марикультуре из-за простоты и гибкости в обращении [11].

В первый день эксперимента была произведена инокуляция клеток 4 культур микроводорослей Phaeodactylum tricornutum,Tetraselmis suecica, Isochrysis galbana иChlorella sp. в емкости, содержащие стерильную морскую воду и питательную среду. Далее, мы наблюдали рост культур и просчитывали численность микроводорослей (рис. 3).

Рисунок 3. Динамика численности микроводорослей в накопительных культурах.

Из рисунка видно, что за время эксперимента максимальных значений численности достигли Chlorella sp. и Isochrysis galbana - 39,85 ∙ 106 кл/мл и 38,18 ∙ 106 кл/мл.

Рисунок 4. Средняя удельная скорость роста микроводорослей за время эксперимента, сут-1

Максимальная удельная скорость роста клеток была отмечена в накопительной культуре микроводоросли Isochrysis galbana и составила 0,62 сут-1 (рис. 4).

При достижении культурами достаточно высоких концентраций – на 8 сутки эксперимента – в емкости с микроводорослями была добавлена культура коловраток Brachionus plicatilis. Эксперимент был продолжен до тех пор, пока количество клеток водорослей в экспериментальных емкостях не снизилось до минимальных значений.

На рисунке 5 представлена динамика численности коловраток и изменение количества клеток водорослей, а на рисунке 6 – только динамика численности коловраток на различных культурах микроводорослей. Из графиков видно, что количество Brachionus plicatilis на всех культурах водорослей достигали практически одинаковых значений – 350-380 кол/мл.

Рисунок 5. Изменение численности микроводорослей (10⁴ кл/мл) и коловраток (кол/мл)

Рисунок 6. Динамика численности Br. plicatilisна микроводорослях, кол/мл

Средняя удельная скорость роста численности коловраток была максимальна в емкостях с культурой Isochrysis galbana – 1.035 сут-1 (рис. 7).

Рисунок 7. Удельная скорость роста коловраток на микроводорослях (сут-1)

Расчет затрат на реализацию проекта

Запущенный процесс бесперебойного культивирования коловраток на культуре водоросли Isochrysis galbana (объем культуры был увеличен до 10 л), позволил с успехом кормить всех беспозвоночных и молодь рыб, содержащихся в Севастопольском Аквариуме-музее (рис. 8, 9).

Рисунок 8. Этапы получения культуры коловратокBr. plicatilisна микроводорослях

Рисунок 9. Кормление беспозвоночных коловратками в Аквариуме

Чтобы обеспечить прирост биомассы микроводорослей и бесперебойное получение живого корма для гидробионтов Аквариума был составлен перечень необходимого оборудования и расходных материалов (табл. 3 и 4).

Таблица 3

Стоимость реактивов для приготовления среды Уолна (на 104 л стерильной морской воды)

Реактив

Цена за кг, руб.

Потребность, г

Стоимость, руб.

1

NaNO3

120.00

1000

120.00

2

NaH2PO4∙2H2o

140.00

200

28.00

3

H3BO3

80.00

346

27.68

4

MnCl2

100.00

3.6

0.36

5

ТРИЛОН Б (ЭДТА)

230.00

450

103.50

6

FeCl3∙6H2O

65.00

13

0.85

7

CuSO4

150.00

200

30.00

8

CoCl2∙6H2O

750.00

20

15.00

9

(NH4)6∙MoO2∙4H2O

1700.00

90

153.00

10

Витамин B1

1689/500мг

0.003

5.00

11

Витамин B12

980/1000мкг

0.0006

1.00

ИТОГО: 484.40

Расход на 10 л среды/неделю – 0.50 руб.

Таблица 4

Стоимость расходных материалов

Расходный материал

Цена, руб.

Потребность в год

Стоимость, руб.

1

Фильтр мембранный ФМАЦ-0,45, 90 мм, размер пор 0,45 мкм

2 400/50 шт.

50 шт.

2 400

2

П/э пакеты 60 х 80, толщина 90 мкм

1 620/100 шт.

100 шт.

1 620

3

Лампа люминесцентная OSRAM FLUORA L 18W/77

585

4 шт.

2 340

4

Спирт медицинский, 96%

300

1 л

300

5

Электроэнергия

3,40 за кВт.ч

643кВт.ч

2 185

ИТОГО: 8 785

Всего затрат – 8 810 руб./год

Заключение

Таким образом, в результате исследования получены следующие результаты:

  1. Для культивирования микроводорослей нами был использован накопительный режим, который позволил в течение 8 суток получить высокие численности микроводорослей: начальная концентрация водорослей составляла 74 ∙ 104 , 61,75 ∙ 104, 225,8 ∙ 104, 560 ∙ 104 кл/мл для микроводорослей Tetraselmis suecica, Isochrysis galbana, Phaeodactylum tricornutum и Chlorella sp. соответственно. В процессе роста микроводорослей произошло увеличение концентрации клеток до следующей плотности, соответственно 395,83 ∙ 104,3818,33 ∙ 104,3466,67 ∙ 104,3985 ∙ 104 кл/мл для Tetraselmis suecica, Isochrysis galbana, Phaeodactylum tricornutum и Chlorella sp. Биомасса Tetraselmis suecica увеличилась с 0,037 мг/мл до 0,2 мг/мл, Isochrysis galbana – с 0,002 до 0,149 мг/мл, Phaeodactylum tricornutum – с 0,026 до 0,392 мг/мл, Chlorella sp. – с 0,008 до 0,056 мг/л. То есть, все 4 культуры микроводорослей Isochrysis galbana, Chlorella sp., Phaeodactylum tricornutum и Tetraselmis suecica могут быть использованы для получения накопительных культур высокой плотности.

  2. Максимальную удельную скорость роста показала культура микроводоросли Isochrysis galbana – 0,62 сут-1.

  3. На 8 сутки эксперимента в емкости с культурами микроводорослей были добавлены коловратки Brachionus plicatilis в следующих количествах: 6 кол/мл к водорослям Tetraselmis suecica и Isochrysis galbana, 9 кол/мл – к водорослям Phaeodactylum tricornutum и Chlorella. В конце эксперимента, на 13 сутки, количество коловраток увеличилось до следующих значений: 350 кол/мл в емкостях с водорослями Tetraselmis suecica, Isochrysis galbana и Chlorella sp, 380 кол/мл - с Phaeodactylum tricornutum. Таким образом, все культуры микроводорослей могут быть использованы практически с равным успехом для выращивания коловраток Brachionus plicatilis и получения живого корма для кормления гидробионтов, содержащихся в искусственных экосистемах Севастопольского морского Аквариума-музея.

  4. Максимальное значение удельной скорости роста коловраток было получено для микроводоросли Isochrysis galbana и составило1,035 сут-1. Таким образом, эта микроводоросль наиболее предпочтительна для получения полноценного живого корма с наименьшими временными затратами.

  5. Расчет проекта и его успешная апробация по получению коловраток в лаборатории Севастопольского морского Аквариума-музея показали, что расход денежных средств составит около 9 000 руб./год.

Список использованных источников и литературы

  1. Акропора – морской коралл. Условия выращивания коралла Акропора в аквариуме. http://domznaniy.info/akropora-morskoj-korall.html.

  2. Безрук А.Кормление кораллов http://aqualog.ru/topic/5533-kormlenie-korallov/.

  3. Виноградов А. К. Как пополнить кладовые Нептуна! - М.: «Пищевая промышленность», 1978. – 208 с.

  4. Галковская Г. А. Эколого-биологические основы массового культивирования коловраток / Г. А. Галковская, И. Ф. Митянина, В. А. Головчиц. – Минск: Наука и техника, 1988. - 143 с.

  5. Заика В. Е. Сравнительная продуктивность гидробионтов / В. Е. Заика; АН УССР, Ин-т биологии юж. морей им. А. О. Ковалевского. – К. : Наук. думка, 1983. – 208 с.

  6. Культивирование коловраток в Европе. http://aquavitro.org/2013/05/21/kultivirovanie-kolovratok-brachionus-plicatilis-v-evrope/

  7. Куницын М.В. Хлорелла – будущее птицеводства / Журнал «Птицеводство», №4, М: ООО «Авиан», 2009. – С. 11 – 13.

  8. Маллаалиева А. Хлорелла - это... Водоросль хлорелла http://fb.ru/article/239139/hlorella.

  9. Микулин А.Е. Живые корма. М: "Дельфин", 1994. - 104 с.

  10. Национальный стандарт Российской Федерации. Вода - ГОСТ Р 54496-2011.

  11. Рауэн Т.В. Дисс. на соискание науч. степени канд. биол. наук. Взаимодействие живых компонентов в системе искусственного воспроизводства черноморского калкана. – Севастополь, ИнБЮМ им А.О. Ковалевского, 2014. – 130 с.

  12. Рауэн Т. В. Влияние микроводорослей и их фильтратов на численность бактерий в среде выращивания камбалы калкана / Т. В. Рауэн, А. Н. Ханайченко, В. С. Муханов // Мор. экол. журн. – 2011. – Т.10, № 3. – С. 48–56.

  13. Рауэн Т.В., Муханов В.С., Ханайченко А.Н. Продукционные показатели коловраток BrachionusPlicatilis при питании микроводорослями разных таксономических групп / «Морской экологический журнал», том 11, №3. – Севастополь: ИнБЮМ им. А.О. Ковалевского, 2012. - с. 89 – 97.

  14. Руководство по гидробиологическому мониторингу пресноводных экосистем / Под ред. Абакумова В.А.- СПб.: Гидрометеоиздат, 1992. - 318 с.

  15. Ханайченко А. Н. Питание и продуцирование коловраток в экспериментальных популяциях при комбинированном воздействии температуры и трофических условий (на примере Brachionus plicatilis Muller, 1786): автореф. дис. на соискание науч. степени канд. биол. наук: спец. 03.00.17 «Гидробиология» / А. Н. Ханайченко. – Минск; Севастополь, 1988. – 24 с.

  16. Холодов В.И., Пиркова А.В., Ладыгина Л.В. Выращивание мидий и устриц вЧерном море / под. ред. В.Н. Еремеева; Национальная академия наук Украины,Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского. – Севастополь, 2010. - 422 с.

  17. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Phaeodactylum_tricornutum.