XI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Цито- и генотоксические эффекты цинка в Allium тесте

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Габышев И.В. 1

---

1Муниципальное образовательное бюджетное учреждение Средняя образовательная школа № 26 городского округа "Город Якутск" (с углубленным изучением отдельных предметов)

Рыкова Т.Г. 1Филиппова Г.В. 2

---

1Муниципальное образовательное бюджетное учреждение, Средняя образовательная школа № 26 городского округа "Город Якутск" (с углубленным изучением отдельных предметов)

2Институт биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения Российской Академии Наук

Работа в формате PDF

388 KB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителяСвидетельство руководителя

Введение

Актуальность. Загрязнение водных ресурсов, вызванное интенсификацией техногенного и антропогенного воздействия на гидросферу, является глобальной проблемой во всем мире. К группе опасных загрязняющих веществ в экотоксикологии относят тяжелые металлы (ТМ), что обусловлено их высокой токсичностью и значительным поступлением в окружающую среду в результате природных и, в большей степени, антропогенных процессов [12]. Особенную важность приобретают вопросы, связанные с освоением северных территорий в части активно развивающихся отраслей направленных на добычу полезных ископаемых и влияния хозяйственной деятельности на природные экосистемы, которые отличаются ввиду суровых климатических особенностей, низкой продуктивностью и чрезвычайной ранимостью [4]. По данным мониторинговых исследований большое количество водных объектов, расположенных, например, на территории Якутии, по степени загрязненности воды относятся к 3 и 4 классу, «очень загрязненной» и «грязной» разрядов, соответственно. Наиболее характерными загрязняющими веществами для рек этого региона, из числа ТМ, являются соединения железа, меди, цинка, марганца и ртути. Причем, самые высокие концентрации, превышающие предельно допустимые концентрации в 20 и 29.4 раз зафиксированы для соединений цинка в реке Яна, вблизи поселка Батагай [1]. Известно, что загрязнение водоемов ТМ сопряженное сложными пищевыми связями несет негативные последствия структурным и функциональным показателям биоценозов [5], а также может стать источником угроз здоровью населения, особенно при потреблении воды в качестве питьевого назначения. В этих условиях наряду с контролем над состоянием природной среды и своевременным выявлением неблагоприятных факторов, остро возникает необходимость в определении потенциальных рисков при воздействии экотоксикантов на живые системы.

Рабочая гипотеза – высокие концентрации цинка оказывают негативный эффект на развитие корней растительного тест-объекта Allium cepa L.

Цель настоящей работы - в модельном эксперименте провести оценку изменчивости ростовых процессов, митотического индекса, хромосомных аберраций, стабильности ядерной ДНК в корешках луковиц Alliumcepa L. в зависимости от содержания цинка в инкубационных растворах.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Определить влияние цинка в диапазоне концентраций 0.5-20 мг/л на рост корней луковиц сорта Штутгартен. 2. Провести оценку митотического индекса в соматических клетках апикальной меристемы корней при действии цинка. 3. С использованием ана-телофазного метода анализа определить число хромосомных аберраций в зависимости от концентрации цинка. 4. С помощью метода ДНК-комет установить генотоксические эффекты тестируемых концентраций цинка.

Объектом исследования служили луковицы сорта Штутгартен Ризен (A. cepa L.).

Предмет исследования – изучениеизменений, происходящих в апикальной меристеме корней луковиц под влиянием раствора сульфата цинка в диапазоне концентраций от 0 до 50 мг Zn/л.

Этапы работы. 1 этап - подготовка и отбор луковиц (сорт Штутгартен Ризен). 2 этап - приготовление растворов сульфата цинка с концентрацией 0,5-50 мг/л. 3 этап - проращивание луковиц в течение 72 часов и получение корней. 4 этап - получение микроскопических препаратов, их фотодокументирование. 5 этап – обработка полученных слайдов, включая использование специализированной программы. 6 этап - статистическая обработка результативности эксперимента. Экспериментальная часть исследования и обработка полученных результатов проводились в течении 6 месяцев.

Вклад автора в решении проблемы. При выполнении данной работы автор получил первичные навыки работы с лабораторным химическим, цитологическим оборудованием и специализированной научной литературой. Также была освоена техника приготовления препаратов, включая фиксацию и окрашивание растительного материала. Автор получил первичные навыки работы с электрофорезными камерами, работы с микроскопом в проходящем свете и флуоресценции. Приобрел навыки обработки данных с помощью специализированной программы анализа и обсчета ДНК-комет, а также навыки статистической обработки данных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Растительный материал и тестовые растворы. В исследовании использовали луковицы сорта Штутгартен Ризен (A. cepa L., 2n = 16) массой 10–20 г, диаметром 1.5–2 см. На каждую концентрацию и контроль формировали группу из 5 луковиц, у которых непосредственно перед проращиванием удаляли поверхностные чешуи. Для приготовления тестируемых растворов использовали 7-водный сульфат цинка и дистиллированную воду. Полученные растворы соответствовали концентрациям в пересчете на цинк 0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 5.0, 10.0, 25.0 и 50.0 мг Zn/л.

Анализ роста корней. Луковицы помещали в стеклянные цилиндры с растворами, контролем служила дистиллированная вода. Проращивание проводили в течение 72 ч при t = 23 ± 1°С и фотопериодичности – 16 ч свет/8 ч темнота. В конце эксперимента от каждой луковицы изолировали по десять корней и определяли их линейные размеры (длина, см).

Митотический индекс (МИ) и хромосомные аберрации (ХА). Для проведения цитологических исследований по три корня от каждой луковицы фиксировали в уксусном алкоголе (спирт и ледяная уксусная кислота, 3:1) в течение 48 ч при t = 4 °С, дальнейшее хранение осуществляли в 70% этаноле. Окрашивание проводили 2% ацетоорсеином, содержащим одну часть 1 н. НCl. Время окрашивания составляло 12 ч. Окрашенные в темный цвет кончики корней размером 2-3 мм готовили методом давленых препаратов в капле 45% уксусной кислоты [3]. Препараты просматривали под световым микроскопом (“ЛабМед-2Л”, Россия). Для определения активности деления клеток использовали показатель МИ, выраженным в %. МИ определяли отношением числа клеток, находящихся в митозе от общего числа проанализированных клеток, не менее 5000 клеток на каждую концентрацию. Аберрации хромосом (мосты и фрагменты) и нарушения клеточных делений (забегание и отставание хромосом, аберрантные митозы) учитывали ана-телофазным методом. ХА (%) рассчитывали отношением общего количества аберрантных клеток к общему числу проанализированных клеток в ана- и телофазах, не менее 300 клеток.

Метод ДНК-комет. Степень фрагментации ДНК в клетках корней определяли с помощью щелочной версии метода ДНК-комет (одноклеточный гель-электрофорез) с некоторыми модификациями [6], позволяющего количественно измерить повреждения ДНК, включая однонитевые, двунитевые разрывы, щелочелабильные сайты (пуриновые и пиримидиновые) [13]. Все операции по выделению изолированных ядер клеток проводили под тусклым желтым светом. Корни помещали в чашке Петри (60 мм) на льду, затем заливали 250 мкл холодного 400 мМ трис буфера, рН 7.5. Кончики корешков с апикальной меристемой отсекали и удаляли. С помощью острого лезвия бритвы корни были аккуратно нарезаны. На срезы автоматической пипеткой капельно наносили буфер. Чашки держали наклоненными во льду, таким образом, чтобы изолированные ядра концентрировались в буфере. Затем суспензию клеток (60 мкл) вносили в пробирки с 240 мкл 1% раствора легкоплавкой агарозы и наносили на предварительно покрытые тугоплавкой агарозой предметные стекла. После затвердевания агарозы при t = 4 °С, микропрепараты помещали в щелочной буфер для электрофореза (300 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА, pH>13) на 20 мин для денатурации ДНК и реализации щелочелабильных сайтов в однонитевые разрывы. Электрофорез проводили в течение 20 минут при напряженности поля 1В/см и силе тока ~300 мА, после чего препараты промывали 400 мкМ трис буфером, рН 7.5 и фиксировали в 70%-ном растворе этанола и высушивали. Непосредственно перед микроскопированием препараты окрашивали флуоресцирующим красителем SYBR Green I (20 мкг/мл) в течение 30 мин. Анализ проводили на флуоресцентном микроскопе (“ЛабМед-2Л”, Россия), используя возбуждающий и отсекающий светофильтры на 490, 530 нм, соответственно. Полученные с микропрепаратов изображения «ДНК-комет» анализировали с использованием программного обеспечения «CASP 1.2.2.». В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте «комет» (% ДНК в хвосте от общего количества ДНК в «комете»; рис. 1а). Атипичные ДНК-кометы, характеризующиеся отсутствующей или практически отсутствующей головой и широким диффузным хвостом (рис.1б), выделяли в отдельную категорию и подсчитывали (%) на каждые 100 шт. «ДНК- комет» [2].

Статистическая обработка результатов. Все измерения были выполнены на свежих образцах в 4-5 биологических и 3 аналитических повторностях. Результаты экспериментов представлены в виде средней арифметической величины и ее стандартной ошибки. Сравнение средних значений выборок проводили методом ANOVA. Значимость отличий от контроля определяли, используя критерий Даннета для множественных сравнений при уровне p < 0.05. Расчеты проводили с помощью пакета AnalystSoft, StatPlus (программа статистического анализа, v. 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тяжелые металлы включая эссенциальные, в определенных концентрациях, обычно больших, могут способствовать развитию различных патологических состояний в живых системах. Общепринятой системой при биоанализе воздействия различных химических веществ, признана растительная цитогенетическая тест-система с использованием A. cepa, результаты которой сопоставимы с результатами, полученными с использованием ряда других тест-объектов [7-10; 14]. Основными критериями, используемыми в анализе митотоксического и мутагенного действия, считаются ростовые показатели, деление клеток апикальной меристемы корня и уровень ХА. Нами показана обратная корреляционная зависимость (r = -0.85; p = 0.008) длины корня от концентрации цинка в растворе (рис.2). Начальное достоверное снижение длины корней на 26 % отмечено при 1.5 мг/л цинка, а при максимальной концентрации (50 мг/л), длина снижалась на 74 % относительно контроля.

Нарушения ростовых процессов корней прямо сопряжено с пролиферативной способностью на уровне клеток [11]. Анализ митотической активности клеток апикальной меристемы корней показал, что выраженное митотоксическое действие начинается при 5 мг/л, а с увеличением концентрации до 25 мг/л усиливается и, наконец, при 50 мг/л приводит к полной остановке деления (табл. 1). Сравнение относительной длительности каждой фазы митоза позволило сделать предположение о характере дозозависимого действия цинка на митоз. В интервале концентраций 1.5-2.5 мг/л отмечено увеличение в 1.2-1.3 раз метафазного индекса по сравнению с контролем, что может быть вызвано изменениями в функционировании веретена деления. Увеличение профазного индекса на 11-33 %, выявленного при 5-25 мг/л свидетельствует о затрудненном прохождении профазы вследствие возможного нарушения надмолекулярной структуры хромосом.

Анализ зависимости доза–эффект мутагенной активности цинка проводили, основываясь на полученных значениях хромосомных аберраций (табл. 2). В диапазоне концентраций 1.0-25 мг/л отмечено повышение в 2.2-7.0 раз частоты образования патологических ана- и телофаз по сравнению с контролем, что указывает на мутагенный эффект цинка (табл. 2). Основными типами нарушений были – забегание и отставание хромосом, одиночные (хроматидные дицентрики) и двойные мосты (хромосомные асимметричные обмены), одиночные фрагменты (хроматидные делеции) (рис. 3). Причем, в контроле и при 0.5-1.5 мг/л фиксировали только забегающие хромосомы, а при более высоких концентрациях отмечали появление отстающих хромосом, фрагментов и/или мостов (табл. 2).

Генотоксические эффекты цинка оценивали с помощью щелочной версии метода ДНК-комет. Выявлено, что при концентрациях цинка 1.0 – 50 мг/л степень повреждения ядерной ДНК (% ДНК в хвосте кометы) была в 1.2-4.9 раза выше по сравнению с контролем (рис. 4). В диапазоне концентрации 0,5-2,5 мг Zn/л степень повреждения ядерной ДНК составляла 30%, при концентрации 5,0-50 мг Zn/л степень повреждения увеличивалась практически в 2 раза и составляла 50-62%.

Также отмечено увеличение количества атипичных комет. В контрольном образце встречаемость атипичных комет составляла 2%. При концентрациях 0,5-2,5 мг Zn/л выявлен прирост данной аномалии до 20%, при более высоких концентрациях (5,0-50,0 мг Zn/л) происходит резкое повышение количества атипичных комет, которое составляет 70 и более процентов (рис. 4).

Таблица 1. Митотический индекс и фазы митоза в меристематических

клетках корней луковиц A. cepa в зависимости от концентрации цинка

Таблица 2. Хромосомные аберрации в меристематических клетках

корней A.cepaпри действии различных концентраций цинка.

Рис. 1. Вид ДНК-кометы (а), атипичные кометы (б).

Рис. 2. Длина корней луковиц в зависимости от концентрации цинка

Рис. 3. Хромосомные аберрации: (a-c) - забегающие хромосомы, (d) – микроядра, (e) - одиночные мосты, (f) - двойные мосты, (g) – фрагмент, (h) – трехполюстность и отстающие хромосомы

Рис. 4. Влияние различных концентраций цинка на

генотоксичность в клетках корней лука

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования нами была подтверждена гипотеза о том, что цинк в определенных концентрациях оказывает негативный эффект на развитие растительного тест-объекта Allium. Данный эффект проявляется в задержке ростовых процессов, увеличении количества хромосомных аберраций и повреждении ядерной ДНК. На основе полученных результатов можно рекомендовать метод ДНК комет в качестве наиболее чувствительного метода для проведения работ по цито- и генотоксическим исследованиям. Полученные данные могут быть использованы при подготовке студентов экологов.

Список литературы

1. Государственный доклад «О состоянии и охране окружающей среды Республики Саха (Якутия) в 2017 году» [электронный ресурс]. – Режим доступа: https://minpriroda.sakha.gov.ru/doklady-o-sostojanii-okruzhajuschej-sredy, дата обращения 02.10.2020.

2. Жанатаев А.К., Никитина В.А., Воронина Е.С., Дурнев А. Д. Методические аспекты оценки ДНК-повреждений методом ДНК-комет // Прикладная токсикология. - 2011. - Т. 2, № 4. - С. 28–37.

3. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Колос, 1974. - 288 с.

4. Телятников М.Ю., Банаев Е.В., Онучин А.А., Шишикин А.С. Характеристика природных экосистем и основных дестабилизирующих факторов севера Центральной Сибири // Сибирский экологический журнал. - 2014. - № 6. - С. 803–806. (doi: 10.1134/S199542551406016X).

5. Шилова Н.А. Влияние тяжелых металлов на представителей пресноводного фито- и зоопланктона в условиях засоления. Авторефератдисс. насоисканиеканд. биол. наук. Саратов. - 2014. - 113 с.

6. Gichner T., Patkova Z., Szakova J., Demnerova K. Cadmium induces DNA damage in tobacco roots, but no DNA damage, somatic mutations or homologous recombination in tobacco leaves // Mutation Research. - 2004. - V. 559. - P. 49–57.

7. Firbas P., Amon T. Chromosome damage studies in the onion plant Allium cepa L. // Caryologia. - 2014. - 67 (1). - Pp. 25-35.

8. Fiskesjö G. The Allium test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. - 1985. - 102 (1). - PP. 99-112.

9. Kumar D., Rajesh Wari A., Jadon P.S., Chaudhuri G., Mukherjee A., Chandrasekaran N., Mukherjee A. Cytogenetic studies of chromium (III) oxide nanoparticles on Allium cepa root tip cells // J. Environ. Sci. - 2015. - 38. - Pp. 150-157.

10. Liman R., Ciğerci İ.H., Öztürk N.S. Determination of genotoxic effects of Imazethapyr herbicide in Allium cepa root cells by mitotic activity, chromosome aberration, and comet assay // Pestic. Biochem. Physiol. - 2015. - 118. - Pp. 38-42.

11. Liman R., Ciğerci I. H., Gökçe S. Cytogenetic and genotoxic effects of Rosmaniric Acid on Allium cepa L. root meristem cells // Food and Chemical Toxicology. - 2018. - 121.- Pp. 444-449 (doi.org/10.1016/j.fct.2018.09.022.)

12. Morkunas I., Woźniak A., Mai V. Ch., Rucińska-Sobkowiak R., Jeandet Ph. The Role of Heavy Metals in Plant Response to Biotic Stress // Molecules. - 2018. - 23(9): 2320. (doi: 10.3390/molecules23092320).

13. Tice R.R., Agurell E., Anderson D. et al. Single cell gel/Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing // Environ. Mol. Mutag. - 2000. - V. 35. - P. 206–221.

14. Türkoğlu S. Evaluation of genotoxic effects of five flavour enhancers (glutamates) on the root meristem cells of Allium cepa // Toxicol. Ind. Health. - 2015. - 31 (9). - Pp. 792-801.