XI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Влияние пищевых добавок на основе лектинов на процесс регенерации Danio rerio
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в Казахстане остро стоит вопрос развития сельского хозяйства в общем, и рыбного хозяйства, в частности. Искусственное разведение особо ценных пород рыб имеет важное значение для обеспечения народонаселения местной продукцией. Однако при транспортировке производителей из маточного стада, икры и молоди рыб на хозяйства для последующего разведения и подращивания до товарной массы повышается смертность за счет проникновения патогенных микроорганизмов в организмы рыбы через поврежденные плавники и чешую. Известно, что представители семейства карповых обладают способностью быстро восстанавливать утраченные плавники и заживлять раны, но регенерация, как и любой другой физиологический процесс, не может изучаться без учета факторов окружающей среды, которые могут как ускорять восстановление рыбы, так и ингибировать его.
Главной проблемой, с которой сталкиваются все рыбоводы, является невозможность создания стерильной среды для рыб, в которой можно контролировать рост и размножение вредных микроорганизмов, а используемые антибиотики подавляют жизнедеятельность не только патогенной микробиоты, но и полезных для рыб бактерий. Следовательно, необходимо найти другой способ борьбы с бактериями, которые, ослабляя иммунитет рыбы, ухудшают регенеративные процессы и зачастую приводят к гибели всей популяции.
На сегодняшний день не существует единого мнения о пользе или вреде растительных лектинов, которые признаны антипитательными веществами и защищают растения от преждевременного выедания их травоядными животными. Некоторые авторы утверждают, что лектины в больших концентрациях, потребляемые с пищей, вызывают перфорацию кишечника, другие же, напротив, считают, что лектины, обладая способностью связываться с углеводами на поверхности клеточной стенки бактерий и одноклеточных паразитов и разрушать ее, могут использоваться в качестве аналога современным антибиотикам. Для проверки обеих гипотез нами была выбрана фасоль обыкновенная (Phaseolusvulgaris), которая, согласно литературным данным содержит максимальное количество лектинов в плодах.
В качестве объекта исследования был выбран модельный организм полосатый данио (Daniorerio), который, также относясь к семейству карповых, обладает исключительной способностью регенерировать утраченные ткани и органы, но является значительно более удобным видом для проведения лабораторных исследований: они демонстрируют неприхотливость к температурным условиям, достигают половой зрелости в течение 3-4 месяцев, низкая стоимость и простота в использовании. Для упрощения экспериментальной части, в качестве регенерирующей структурынами был выбран хвостовой плавник, как наиболее удобный орган для проведения процедуры элиминации и последующей оценки скорости и качества регенерации.
Целью данного исследования было изучение влияния биологически активной добавки, полученной на основе растительных лектинов фасоли обыкновенной на скорость и эффективность регенерации хвостового плавника у рыб Danio rerio.
Задачи исследования:
1. Обзор литературных источников и дизайн эксперимента;
2. Выделение, очистка и количественная оценка лектинов;
3. Проведение процедуры элиминации хвостового плавника;
4. Измерение скорости восстановления хвостового плавника;
5. Оценка двигательной активности рыб с помощью программного обеспечения “DanioGo”;
6. Получение фотографий хвостового плавника;
7. Статистическая обработка данных по методу Стьюдента для независимых выборок с помощью программного обеспечения Excel.
Для выполнения поставленных задач нами были использованыклассические методы получения и очистки лектинов. Все стадии экспериментов, включающие работу с модельными организмами, проводились в строгом соответствии с общепринятыми протоколами по этичному обращению с животными. Для фотографирования препаратов использовался микроскоп Motic и программное обеспечение Motic Image Plus 3.0
ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЧАСТЬ
1. Обзор литературных данных
1.1. Daniorerioкак модельный объект
Полосатый данио Danio rerio– представитель семейства карповых, на данный момент является одним из самых популярных модельных организмов, используемых для проведения исследований в биотехнологии, биомедицине, биологии развития, токсикологии и эволюционной биологии. Рак, ожирение, хронический стресс, инсулинозависимый диабет, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания (в том числе болезнь Альцгеймера и Паркинсона) – эти и многие другие патологии изучаются на примере полосатого данио [1-3].
Как модельный организм полосатый данио стал использоваться еще в начале прошлого века: Джейн Оппенгеймер доказала, что эмбриогенез рыб схож с ранним развитием наземных позвоночным [4]. В 1934 году исследователь из Университета Уэйна Чарльз Крейзер опублковал статью, где также доказал, что полосатый данио может быть идеальным модельным организмом для изучения сравнительной эмбриологии. В конце 1960-х ученый Джордж Стрейзингер из Орегонского Университета стал использовать популяцию данио для изучения нейрогенеза у эмбрионов [5]. В1995 году ученые из Орегонского Университета Чарльз Киммел и Уильям Баллард нашли и описали 7 периодов эмбриогенеза этих рыб: морула, бластула, гаструла, сегментация, фарингула, стадия выхода и икринка [6]. В 2003 году был полностью секвенирован геном данио [7]. Немецкий биолог Кристиан Нюсслейн-Волхард из Тюбингенского университета проверила более 4 000 мутантных особей, что помогло им выявить гены, участвующие в эмбриогенезе человека [8].
Благодаря небольшим размерам, высокой плодовитости, неприхотливости, крупной видимой икре и невысокой стоимости, полосатый данио прочно вошел в список наиболее перспективных модельных организмов.
Исходным ареалом обитания Daniorerio являются пресноводные озера и реки Индии, Пакистана, Мьянмы, Бангладеша, Непала и Бутана. Длина взрослых особей составляет 4-6,5 см, ширина – 1-1,5 см. Вдоль сплющенного с боков тела от конца жаберных крышек и до оконечностей лучей хвостового плавника тянутся хорошо пигментированные полоски, за счет которых полосатый данио и получил свое название. Рострум располагается сверху, от которого отходит пара направленных вниз маленьких усиков. Анальный, грудные, брюшные и спинные плавники не окрашены. Хвостовой плавник гомоцеркальный, состоит из 16-18 сегментированных хвостовых лучей, анальный – из 10-12 лучей, грудные плавники – из 11-12 лучей, брюшные плавники – из 6 лучей. Самки, в отличие от самцов, имеют полное, скругленное книзу брюшко [9].
Danio rerio толерантны к перепадам температуры и могут жить в диапазоне от 15 ˚С до 30 ˚С. Кормить их можно живыми (трубочник, мотыль), сухими (артемия, дафния) и коммерческими кормами. Оптимальный уровень pH варьируется от 5,9 до 8,1 Фотопериодичность 12Д:12Н [10,11].
Данио являются стайными неагрессивными животными и плохо переносят одиночество, поэтому рекомендуется их содержать группами, включающими как самцов, так и самок, из расчета 1 особь на 5 л воды [12].
При поддержании оптимальных условий среды половозрелой молодь данио становится по достижении 3-4 месяцев, продолжительности жизни составляет 5-6 лет. Достигнув половой зрелости, самка за один нерест самка откладывает около 100-300 крупных икринок [13].
Отличительной особенность полосатого данио, как и большинства рыб, принадлежащих к семейству Карповых, является способность регенерировать утраченные ткани и органы без потери их функциональности [14].
1.2 Регенерация Daniorerio
Млекопитающие, в отличие от рыб, амфибий и рептилий, сохраняющих личиночную стадию в течение жизни, не могут регенерировать конечности. Хотя ключевые гены, которые отвечают за регенерацию конечностей и индуцируют дедифференциацию, пролиферацию и дифференциацию соматических и стволовых клеток, похожи друг на друга как у анамний, так и у амниот, у млекопитающих они не активируются после ампутации [15].
Обычно у амниот место ампутации покрыто рубцом, который не может заменить удаленную конечность и защитить основные жизненно важные органы так же хорошо, как нормально функционирующая кожа [16]. В отличие от них, полосатый данио, принадлежащий амниотам, представляют собой идеальную модель для изучения эпиморфного типа регенерации, когда клетки-предшественники мобилизуются, мигрируют, образуют недифференцированную клеточную массу, пролиферируют, дифференцируются и в конечном итоге полностью восстанавливают размер, форму и функцию ампутированного органа. Даже серия повторных ампутаций не снижает регенерационную способность рыбок данио. Только в ограниченном числе случаев регенерация может быть временно остановлена из-за аномально высокой температуры, а затем запущена заново [17].
По степени выраженности регенерационных процессов ткани и органы позвоночных животных делятся на:
1) постоянно обновляющиеся (кровь, эпителий);
2) способные почти полностью восстанавливаться после повреждений (печень, скелетные мышцы и кости);
3) неспособные восстанавливаться после повреждений (почки, сердце, поджелудочная железа и нервная ткань).
Danio rerio наряду с другими костистыми рыбами и хвостатыми амфибиями обладают способностью к почти полной регенерации всех типов тканей и органов.
Для изучения процесса регенерации исследователи часто выбирают хвостовой плавник благодаря следующим характеристикам:
крупный размер, позволяющий проводить манипуляции без дополнительного дорогостоящего оборудования (микроскоп, микроскальпель);
простота строения, отсутствие мышц;
проксимальное расположение, что делает его доступным для манипуляций;
для полной регенерации требуется 14-21 день;
лучи восстанавливаются независимо друг от друга, представляя собой независимые регенеративные единицы;
временная утрата хвостового плавника никак не влияет на физиологические процессы организма и не приводит к летальному исходу.
Хвостовой плавник представляет собой не содержащую мышц кожную складку, которая стабилизируется 16-18 главными сегментированными лучами. Двудольность плавника является результатом большего числа сегментов в боковых лучах в сравнении с центральными лучами. Разность между самым длинным и самым коротким лучами составляет примерно 4 сегмента. Так как рыба способна расти на протяжении всей жизни, лучи тоже растут посредством добавления новых сегментов к концам.
Жесткость плавника зависит от коллагенового костного матрикса, который формируется остеобластами под эпидермисом. Большая часть проксимальных сегментов лучей поддерживается минерализованным костным матриксом, а 3-4 наиболее отдаленных сегмента остаются не минерализованными. Конечный сегмент каждого луча не имеет костного матрикса на конце, вместо этого он поддерживается щеткообразным пучком тонких игл [18]. Лучи содержат артерии и нервы. В межлучевом пространстве отсутствуют скелетные элементы, вены встроены в мезенхимальную ткань [19].
Регенерация плавников у рыб представляет собой эпиморфный тип регенерации: дедифференциация взрослых тканей в поврежденной области приводит к формированию недифференцированной клеточной массы – бластемы. Процесс регенерации плавника делится на 4 стадии:
1. Зарастание места ампутации раневым эпидермисом, формирование апикальной эпидермальной шапочки, образующейся за счет миграции непролиферирующих эпителиальных клеток к месту повреждения.
2. Беловатая полоса образуется на месте ампутированного плавника в течение 1-2 дней, которая затем увеличивается в размере на 3-4 день. Формирование бластемы происходит благодаря пролиферации и дедифференциации мезенхимальных клеток под раневым эпидермисом. Бластема подразделяется на проксимальную и дистальную в зависимости от скорости пролиферации и экспрессии генов.
3. Регенеративное отрастание начинается на 5-6 день после повреждения которое характеризуется активной пролиферацией клеток проксимальной бластемы. Проксимальная часть начинает дифференцироваться во взрослую плавниковую складку и приобретает пигментацию.
4. Спустя примерно две недели плавник полностью регенерируется, восстанавливая свою форму и размер.
Таким образом, плавник обладает большим набором тканей, которые должны быть скоординированы во время регенерации таким образом, чтобы процессы восстановления протекали совместно, чтобы восстановить изначальные форму и размер.
1.3 Биологические свойства лектинов
Термин лектин первоначально произошел от латинского глагола legere, означающего «выбирать» или «выбирать» и данного Уильямом Бойдом [20]. Этот термин был обобщен для охвата всех сахароспецифичных агглютининов неиммунного происхождения, независимо от источника и специфичности группы крови [21]. Как правило, лектины представляют собой белки или гликопротеины, которые обратимо связываются со специфическими моно- или олигосахаридами без изменения структуры связанного лиганда. Они могут присоединяться к углеводным остаткам на поверхности эритроцитов и / или агглютинирующих эритроцитах без изменения свойств углеводов. Первоначально лектины были обнаружены и описаны в растениях, но в последующие годы множественные лектины были выделены как у микроорганизмов, так и у животных [21]. Индуцированная лектином клеточная агглютинация изначально служила наиболее распространенным методом определения и количественной оценки активности лектина у различных организмов [22,23].
В растениях концентрация лектинов варьируется от 50 до 90% от общей массы белка. Возможно, это объясняется тем, что не все лектины играют первостепенную роль в иммунной системе растений. Они были обнаружены во многих группах растений, включая однодольные и двудольные, съедобные плоды (банан и помидор), луковицы (лук, чеснок, лук-шалот), клубни картофеля и семена бобовых (соя, арахис, конские бобы, нут, фасоль, люпин, горох и др.) [24-26], в различных тканях, таких как кора, листья, сок флоэмы, корневища, корни, стебли, цветы культур тканей и завязи. У них разная клеточная локализация и молекулярные свойства. Например, содержание лектина в некоторых частях растений выше, например, из 100 г клубней Remusatia vivipara [27] и корней Astragalus mongholicus [28] было извлечено 390 и 75 мг очищенного лектина соответственно. Лектины также содержатся в семенах. Содержание лектина в небобовых растениях низкое, например, 3,3 мг лектина из 100 г семян Hibiscus mutabilis [29]. Лектины в изобилии содержатся в семенах бобовых. Наиболее известные лектины содержатся в семенах бобовых, которые составляют около 15% от общего количества белков. Лектины фасоли агглютинируют эритроциты из-за их способности связываться с гликопротеинами и гликолипидами клеточной поверхности. Хотя точная функция лектинов в бобах неизвестна, считается, что они обеспечивают защиту растений. Поскольку лектины токсичны, они вызывают беспокойство с точки зрения питания. Лектины содержатся во фракциях альбумина и глобулина. Некоторые сорта фасоли не содержат лектинов. Когда лектины присутствуют, они составляют 6–12% от общего белка. Помимо агглютинирующей активности многие лектины бобовых культур обладают митогенной активностью.
Phaseolus vulgaris или фасоль обыкновенная, является однолетним травянистым растением, широко культивируемом во всем мире из-за бобов, которые содержат большое количество как заменимых, как и незаменимых аминокислот. Большинство лектинов бобовых имеют субъединицу с молекулярной массой 29 000–36 500 Да с изоэлектрическим значением pH в диапазоне 4,9–7,9 (большинство из них находится в диапазоне pH 5–6). Большинство природных лектинов имеют тетрамерную природу (молекулярная масса 100 000–150 000), хотя некоторые (например, бобы лимские) имеют димерную природу. Лектины очень устойчивы к нормальным пищеварительным протеазам и медленно гидролизуются in vitro даже после интенсивной денатурации, что сохраняет их токсичность для животных организмов, связываясь с гликокаликсом мембран клеток кишечника.
Токсичность лектинов в больших концентрациях хорошо задокументирована в ходе многочисленных исследований, оценивающих возможные риски для здоровья сельскохозяйственных животных, грызунов и человека лектинов в сырых растениях, продуктах питания и кормах, однако практически не существует исследований, проводившихся для изучения роли биологически активных добавок на основе лектинов на регенерацию карповых рыб.
2. Материалы и методы
Объект исследования
В качестве объекта исследования были использованы самцы и самки Daniorerio, достигшие 8-месячного возраста. В качестве активного агента были использованы экстракты лектинов, выделенные из фасоли обыкновенной Phaseolusvulgaris.
. Методы исследования
Содержание контрольных и экспериментальных групп
Все эксперименты были проведены на базе кафедры молекулярной биологии и генетики факультета биологии и биотехнологии Казахского Национального Университета имени аль-Фараби. Все эксперименты проводились строго в соответствии с международными протоколами по этичному обращению с лабораторными животными. Все эксперименты были проведены в трех повторностях, что исключает наличие влияния на организмы каких-либо факторов среды, кроме биологически активной добавки в пищу на основе растительных лектинов.
Для эксперимента были отобраны самцы и самки Daniorerio, не имеющих морфозизиологических отклонений от нормы, признаков заболеваний, травм, паразитарных инвазий и патологий поведения. Все особи в случайном порядке были разделены на контрольную и опытную субпопуляции, измерены и помещены в регулярные аквариумы объемом 200 литров (t=29 °C, pH 7.0 ± 0.1, сатурация 90%, фотопериод 12Д: 12Н). В качестве базового корма использовалась смесь трубочника (Tubifex tubifex), дафнии (Daphnia magna) и бокоплава (Gammarus pulex) в соотношении 8:1:1. Контрольная группа получала только живой корм, а экспериментальная – живой корм и биологически активную добавку на основе растительных лектинов. Кормление производилось один раз в день. Каждую неделю проводились промеры как длины хвостового плавника (LCF), так и общей длины рыбы (TL). Кроме того, производилась визуальная оценка двигательного рефлекса и исследовательского поведения.
Выделение и очистка лектинов
Лектины из семян фасоли обыкновенной выделяли в следующей последовательности: экстракция, высаливание 70%-ым сульфатом аммония, фильтрация. Для экстракции лектинов бралась навеска в 10 г семян красной фасоли (американский сорт “Камелия”), замачивалась на сутки в теплой воде, затем гомогенизировалась в электрическом блендере до состояния однородной массы и высаливалась в 400 мл NaCl (1:8) в течение 48 часов при температуре 4° C. Полученную смесь пропускали через фильтровальную бумагу (Whatman, №3), супернатант центрифугировали при скорости 10 000 оборотов в минуту в течение 30 минут и фракционно осаждали сульфатом аммония (NH4)2SO4 в концентрации 1M (25%), 1.6М (40%), 2.4М (60%), 3.2М (80%) при комнатной температуре. Выпавший в виде осадка белок смешивали и растворяли в минимальной объеме дистиллированной воды.
2.2.3. Количественное определение лектинов
Количественное определение лектинов определяли спектрофотометрически с помощью реактива Бредфорда и бычьего альбумина в качестве стандарта при длине волны λ=280 нм.
2.2.4. Элиминация хвостового плавника и измерения основныхихтиологических параметров
Для минимизирования болевого шока все рыбы предварительно помещались в раствор лидокаина в концентрации 1 мл активного вещества на 100 мл воды на 30 минут. Элиминация хвостового плавника производилась острым лезвием до 3-5 сегментов лучей во избежания кровотечения и гибели рыб. С помощью штангенциркуля измерялась длина тела рыбы от начала рострума до окончания самого длинного луча хвостового плавника (TL) и от окончания хвостового стебля до окончания хвостового луча (LCF). Учитывая кумулятивный эффект лидокаина при последующих измерениях для иммобилизации рыб использовалась холодная вода (t=5 °C), в которую рыбы помещались на 3-5 секунд.
2.2.5. Оценка поведенческих рефлексов
Оценка плавательных рефлексов рыб производилась до ампутации, сразу после ампутации и через час после ампутации с помощью программного обеспечения DanioGo. Для этого по одной рыбе помещалось в емкость, наполненную 1 л хорошо аэрированной теплой водой, и в течение 5 минут записывалось ее поведение. Кроме того, велись наблюдения за поведением рыб в аквариуме, скоростью выедания корма, поисковым и исследовательским поведением, реакцией на свет и на механические раздражители.
2.2.6.Статистическая обработка данных
Статистическая обработка данных производилась в программе Microsoft Excel по методу Стьюдента (t-test). Схемы и диаграммы производились в программе Microsoft Excel.
2.2.7. Фотографирование объектов
Для определения струтуры хвостового плавника был использован микроскоп Motic DM143 Series, фотографирование было произведено с помощью программного обеспечения Motic Images Plus 3.0.
3. Результаты и обсуждения
Перед началом эксперимента было необходимо статистически доказать однородность (гомогенность) популяций, т.к. размеры рыб влияют на скорость выедания корма и, следовательно, на набор массы и регенерацию. Т.е. меньшие по длине рыбы получают меньше корма, тогда как большие по длине рыбы, соперничающие за кормовой ресурс, демонстрируют лучшую выедаемость и имеют возможность быстрее восстановить утраченный плавник. Мы измерили длину всех рыб, которая в контроле составила 2,65±0,22 см, в эксперименте - 2,62±0,27 см.
Исходная длина плавника составляла 0,55±0,34 см в контроле и 0,56±0,3 см в эксперименте (temp 0,135<tcrit 2,650 (p=0,01, df=68), что свидетельствует об однородности длин плавников в популяции (рис. 1 Приложение). Минимальная длина плавника составила 0,3 см в экспериментальной группе и 0,4 см в контрольной, максимальная – 0,7 см в экспериментальной и 0,7 в контрольной, соответственно. Длина большинства особей в обеих группах варьировалась от 0,5 до 0,6 см. Полученные данные свидетельствуют об однородности длин в популяции. После ампутации длина хвостового плавника была принята за 0 см.
Чтобы удостовериться, что потеря хвостового плавника не приводит к хроническому стрессу и повышенной концентрации глюкокортикоидов, угнетающих все биохимические, физиологические и поведенческие процессы организма, мы протестировали рыб на способность активно плавать и исследовать весь объем аквариума (т.е. инициировать так называемое “исследовательское поведение”, служащее доказательством здоровья рыбы). Такой тест помогает определить общее расстояние, которое рыба проплывает за определенный период времени, скорость и то, насколько полно исследуется весь объем аквариума. Нахождение в течение долгого времени в одном месте свидетельствует об угнетенном состоянии рыбы, что, безусловно негативно влияет на регенерацию хвостового плавника. Для этого мы брали по одной рыбе из каждой популяции и помещали ее в пластиковый контейнер (24 см*16 см*5 см), заполненной 1 л теплой, хорошо аэрированной водой, фиксировали ее движения с помощью видеокамеры в течение 5 минут и обрабатывали получившиеся записи с помощью программного обеспечения DanioGo, созданной на базе кафедры молекулярной биологии и генетики факультета биологии и биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби (рис. 2 Приложение).
На рисунке (рис. 3 Приложение ) видно, что рыба до ампутации исследует весь объем аквариума, не прижимается ко дну, не пытается выпрыгнуть наружу, что свидетельствует о том, что ее двигательные паттерны не нарушены.
Сразу после ампутации особи из контрольной и экспериментальной групп снова помещались в емкость с водой и в течение 5 минут велись наблюдения за их двигательной активностью (рис.4 Приложение).
Как видно из рисунка (рис.4) двигательная активность рыб сразу после ампутации хвостового плавника частично угнеталась. Рыбы исследовали не весь объем аквариума, а только часть, больше времени проводили на дне, не совершая никаких движений. Через час мы снова проверили их двигательную активность (рис.5 Приложение).
Полученные данные свидетельствуют о том, что двигательная активность ампутантов восстановилась практически полностью, следовательно, они способны брать корм и конкурировать за него с другими рыбами и, следовательно, не имеют физических препятствий для регенерации плавника.
С помощью микроскопа Motic и стандартного программного обеспечения MoticPlus 3.0 были получены invivo фотографии хвостового плавника до и сразу после ампутации (рис.6 Приложение). На рисунке хорошо видны гомоцеркальные лопасти, хвостовые лучи, бифуркация лучей и их сегменты. Хвостовой плавник не имеет видимых повреждений, кромка среза ровная, кровотечения не наблюдается.
По стандартной методике нами были выделены и очищены лектины и определена их концентрация. 100 г сырой массы семян фасоли обыкновенной содержат 960 мг лектинов. Эти данные не противоречат ранее опубликованным другими авторами. Полученный экстракт был растворен в минимальной концентрации воды и добавлен в живой корм (Artemiasalina, Tubifextubifex, Daphniamagna). Кормление обеих групп производилось раз в сутки. Во избежание загнивание корма и загрязнения водной среды продуктами распада, несъеденные остатки удалялись через 10 минут после начала кормления.
Так как первые дни после ампутации считаются критическими для формирования раневого эпидермиса и бластемы, от которых зависит дедиффренциация, миграция и дифференциация клеток-прогениторов, отвечающих за формирование denovo костных цилиндров лучей плавников и соединительной ткани, нами велись наблюдения в течение трех дней после начала эксперимента.
На рисунке (рис.7 Приложение) мы видим разницу в размере бластемы у контрольной и экспериментальной групп. В экспериментальной группе заметно начало формирование лучей хвостового плавника, тогда как в контроле видна только недифференцированная клеточная бластемальная масса. Данные различия дают основание предположить, что биологически активная добавка к пище на основе лектинов дала прирост в длине бластемы.
Через неделю после начала эксперимента была зафиксирована значительная разница между группами: в контроле длина плавника составила 0,21±0,1 см, в эксперименте – 0,31±0,07 (temp5>tcrit2,650 (p=0,01, df=68) (рис. 8 Приложение).
Диаграмма “ящик с усами” показывает дисперсию в длине хвостового плавника контрольной и экспериментальной групп. Нижний экстрим составляет 0,2 и 0,1 см, верхний – 0,4 и 0,3 см в эксперименте и контроле, соответственно. Первый квартиль составляет 0,3 и 0,1 см, третий квартиль 0,4 и 0,2 см, медиана – 0,31 см и 0,19 см, соответственно. Данная статистически достоверная разница подтверждает ранее полученные данные о том, что антипитательные вещества стимулируют регенерацию хвостового плавника, ускоряя его рост и развитие.
Через 14 дней данные параметры составили 0,45±0,13 см в контроле и 0,6±0,11 см в эксперименте (temp5,23> tcrit2,650 (p=0,01, df=68) (рис. 9 Приложение). Нижний экстрим составляет 0,4 и 0,3 см, верхний эстрим – 0,8 и 0,6 см, первый квартиль – 0,5 и 0,375 см, третий квартиль – 0,7 и 0,5 см, медиана – 0,6 и 0,44 см в эксперименте и контроле, соответственно. Так же в контроле наблюдается единичный выброс – 0,1 см.
Через 21 день длина хвостового плавника в контроле составила 0,46±0,11 см, в эксперименте показатели не изменились и составили 0,6±0,18 (temp3,78> tcrit2,667 (p=0,01, df=56) (рис. 10 Приложение). Данная статистически достоверная разница свидетельствует о том, что биологически активная добавка на основе лектинов, выделенных из фасоли обыкновенной, значимо улучшает регенеративные процессы Daniorerio.
Заключение
Поиск агентов, ускоряющих регенерацию, полученную при транспортировке карповых рыб на хозяйства, является важной задачей современного сельского хозяйства. Одними из таких агентов являются растительные лектины, способные, связываясь с мембранным гликокаликсом, разрушать клеточную мембрану инвазивных патогенных бактерий, проникающих в организм травмированной рыбы и вызывающих заражение.
Для определения роли лектинов в регенерации были выбраны рыбки полосатого данио Daniorerio, относящиеся, как и множество ценных пород рыб, к семейству карповых. Благодаря способности полностью восстанавливать утраченные конечности, нейроны, сердечные и скелетные мышцы, глаза и почки, полосатый данио является перспективным модельным организмом для изучения invivo процесса регенерации.
Для проверки нашей гипотезы, мы отобрали рыб без видимых повреждений чешуи, плавников и позвоночника, и в случайном порядке разделили их на контрольную и опытную популяции. Во избежание ошибок при интерпретации результатов, мы замерили длину тела и длину хвостового плавника в обеих группах, и доказали их гомогенность. Исходная длина плавника составляла 0,55±0,34 см в контроле и 0,56±0,3 см в эксперименте (temp0,135<tcrit2,650 (p=0,01, df=68). После ампутации длина была принята за 0 см.
Для снижения болевого шока всех рыб перед ампутацией помещали в раствор лидокаина, а после острым скальпелем проводили элиминацию хвостового плавника. Чтобы исключить негативное воздействие хронического стресса, являющегося естественным лимитирующим фактором всех физиологических процессов, мы вели наблюдения за двигательной активностью рыб до ампутации, сразу после и через час. Полученные результаты обрабатывали в программе “DanioGo”. Данные показали, что двигательная активность рыб полностью восстанавливается за час и статистически значимо не отличается от исходных показателей.
В качестве источника лектинов была выбрана фасоль обыкновенная Phaseolusvulgaris. Экстракцию, очистку и качественное определение лектинов мы проводили по стандартным методикам. Концентрация лектинов составила 960 мг на 100 г, что не противоречит ранее опубликованным данным. Чистый экстракт лектинов добавлялся в 100 г кормовой смеси, состоящей из Artemia salina, Tubifex tubifex и Daphnia magna. Контрольная группа получала корм без добавок.
Через три дня после ампутации визуальна была видна разница между размерами бластемы в контрольной и экспериментальной группах. Учитывая, что бластема начинается формироваться после зарастания места ампутации раневым эпидермисом, можно предположить, что заживление раны шло активнее в эксперименте за счет агглютинирующей активности лектинов.
Через семь дней после ампутации была зафиксирована значительная разница между группами: в контроле длина плавника составила 0,21±0,1 см, в эксперименте – 0,31±0,07 (temp5>tcrit2,650 (p=0,01, df=68). Через 14 дней данные параметры составили 0,45±0,13 см в контроле и 0,6±0,11 см в эксперименте (temp5,23> tcrit2,650 (p=0,01, df=68). Через 21 день длина хвостового плавника в контроле составила 0,46±0,11 см, в эксперименте показатели не изменились и составили 0,6±0,18 (temp3,78> tcrit2,667 (p=0,01, df=56). Т.е. экспериментальная группа, ежедневно получавшая корм с добавлением очищенных лектинов восстановила утраченный плавник на 2 недели, тогда как контрольная даже через три недели восстановила его не полностью. Учитывая, что обе группы содержались в абсолютно одинаковых условиях, можно утверждать, что на регенерацию влияли кормовые добавки на основе лектинов.
Данная работа является пилотной, однако ее результаты могут быть использованы для формирования кормов как ценных, так и декоративных пород рыб.
По результатам работы был опубликован 1 тезис в материалах международной научно-практической конференции “Фараби Әлемі”.
Список литературных источников
1. Bradford YM, Toro S, Ramachandran S, Ruzicka L, Howe DG, Eagle A et al. Zebrafish Models of Human Disease: Gaining Insight into Human Disease at ZFIN. ILAR J. 2017 Jul 1;58(1):4-16. doi: 10.1093/ilar/ilw040.
2. Bambino K, Chu J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Curr Top Dev Biol. 2017;124:331–367. doi:10.1016/bs.ctdb.2016.10.007
3. Tian S, Teng M, Meng Z, Yan S, Jia M, Li R et al. Toxicity effects in zebrafish embryos (Danio rerio) induced by prothioconazole. Environ Pollut. 2019 Dec;255(Pt 2):113269. doi: 10.1016/j.envpol.2019.113269.
4. Oppenheimer J. Structures Developed in Amphibians by Implantation of Living Fish Organizer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 1936;34 (4): 461-463
5. Streisinger G, Okada Y, Emrich J, Newton J, Tsugita A, Terzaghi E et al. Frameshift mutations and the genetic code. This paper is dedicated to Professor Theodosius Dobzhansky on the occasion of his 66th birthday. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1966;31:77-84.
6. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 1995 Jul;203(3):253-310.
7. Howe K, Clark MD, Torroja CF, Torrance J, Berthelot C, Muffato M et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 2013 Apr 25;496(7446):498-503. doi: 10.1038/nature12111
8. Knaut H, Werz C, Geisler R, Nüsslein-Volhard C; Tübingen 2000 Screen Consortium. A zebrafish homologue of the chemokine receptor Cxcr4 is a germ-cell guidance receptor. Nature. 2003 Jan 16;421(6920):279-82.
9. Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. Zebrafish in the wild: a review of natural history and new notes from the field. Zebrafish. 2007 Spring;4(1):21-40.
10. Brand, M., Granato, M. & Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish’ in Nüsslein-Volhard & Dahm. Zebrafish -A Practical Approach ; Oxford University Press, Oxford, UK.
11. Lawrence C, Mason T. Zebrafish housing systems: a review of basic operating principles and considerations for design and functionality. ILAR J. 2012;53(2):179-91.
12. Andrews, C. Freshwater fish in The UFAW Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 7th Edition, Volume 2 -Amphibious and Aquatic Vertebrates and Advanced Invertebrates’ eds Poole & English: Blackwell Science Ltd, Oxford
13. Matthews, M., Trevarrow, B. & Matthews, J. A virtual tour of the Guide for zebrafish users' Lab Animal 31(3), p34-40.
14. González-Rosa JM, Burns CE, Burns CG. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxford, England). 2017 Jun;4(3):105-123. DOI: 10.1002/reg2.83.
15. Alibardi L. Review: Limb regeneration in humans: Dream or reality? Ann Anat. 2018 May;217:1-6. doi: 10.1016/j.aanat.2017.12.008
16. Takeo M, Lee W, Ito M. Wound healing and skin regeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015 Jan 5;5(1):a023267. doi: 10.1101/cshperspect.a023267.
17. Azevedo AS, Grotek B, Jacinto A, Weidinger G, Saúde L. The regenerative capacity of the zebrafish caudal fin is not affected by repeated amputations. PLoS One. 2011;6(7):e22820. doi: 10.1371/journal.pone.0022820.
18. Anne-Gaëlle, Rolland-Lagan, Mathieu Paquette, Valerie Tweedle, Marie-Andree Akimenko. 2012. “Morphogen-based simulation model of ray growth and joint patterning during fin development and regeneration.” Development 139:1188-1197;
19. Zhang J, Wagh P, Guay D, Sanchez-Pulido L, Padhi BK, Korzh V, Andrade-Navarro MA, Akimenko MA. 2010. “Loss of fish actinotrichia proteins and the fin-to-limb transition.” Nature (July) 8;466(7303):234-7.
20. https://www.medicalnewstoday.com/articles/319593.php
21. Boyd WC. Lectins. Ann N Y Acad Sci. 1970 Feb 13;169(1):168-90.
22.Bies et al., 2014 - Bies C., Lehr CM., WoodleyJF. Lectin-mediated drug targeting: history and applications. Adv Drug Deliv Rev.2014; 56: 425– 435
23.Vlodavsky I., and Sachs I. Lectin receptors on the cell surface membrane and the kinetics of lectin-induced cell agglutination. Exp. Cell res. 1975; 93(1):111-9
24. Zhang G., Sun J., Wang H., Ng TB. First isolation and characterization of a novel lectin with potent antitumor activity from a Russula mushroom. Phytomedicine. 2010; 17:775–781.
25. Ana C. Ribeiro, Sara V. Monteiro, Belmira M. Carrapiço, Ricardo B. Ferreira. Are Vicilins Another Major Class of Legume Lectins // Molecules, 2014. Vol. 19. Pp. 20350–20373.
26. Van Dame J.M., Peumans W.J., Pustai A., Bardocz S. Handbook of plant lectins: properties and biomedical applica- tions. Chichester etc.: John Willey and Sons, 1998. P. 451.
27. Rüdiger H., Gabius H., Review J. Plant lectins: Occurrence, biochemistry, functions and applications // Glycoconjugate. 2001. Vol. 18. Pp. 589–613.
28. Bhat GG., Shetty KN., Nagre NN., Neekhra VV., Lingaraju S., Bhat RS., Inamdar SR., Suguna K., Swamy BM. Purification, characterization and molecular cloning of a monocot mannose binding lectin from Remusatia vivipara with nematicidal activity. Glycoconj J. 2016; 27:309–320.
29. Yan Q., Jiang Z., Yang S., Deng W., Han L. A novel homodimeric lectin from Astragalus mongholicus with antifungal activity. Arch Biochem Biophys, 2015; 442:72–81.
Приложение
Рисунок 1. Исходные длины хвостовых плавников
Рисунок 2. Детекция плавательной активности Danio rerio в программном обеспечении DanioGo.
а)
б)
Рисунок 3. а) двигательная активность до ампутации в контрольной группе, б) двигательная активность до ампутации в экспериментальной группе.
а)
б)
Рисунок 4. а) двигательная активность сразу после ампутации в контрольной группе, б) двигательная активность сразу после ампутации в экспериментальной группе.
а)
б)
Рисунок 5. а) двигательная активность через час после ампутации в контрольной группе, б) двигательная активность через час после ампутации в экспериментальной группе.
а) б)
Рисунок 6. а) хвостовой плавник до и сразу после ампутации в контрольной группе; б) хвостовой плавник до и сразу после ампутации в экспериментальной группе
а) б)
Рисунок 7. а) бластема в контрольной группе через 3 дня после ампутации; б) бластема в экспериментальной группе через 3 дня после ампутации.
Рисунок 8. Длины хвостовых плавников через 7 дней после ампутации
Рисунок 9. Длины хвостовых плавников через 14 дней после ампутации
Рисунок 10. Длины хвостовых плавников через 21 день после ампут