XI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Антимикробная активность микрокапсулированных соков Allium sativum и Allium сера на микробных моделях
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Необходимость обеспечения населения Республики Казахстан собственными лекарственными препаратами обоснована в рамках реализации «Государственной программы индустриально-инновационного развития Республики Казахстан на 2015-2019 год». В связи с этим одной из актуальных задач современной медицинской биотехнологии является разработка новых лекарственных препаратов на основе растительных ресурсов Республики Казахстан [1]. Важным направлением мировой фармацевтической промышленности является создание близких по структуре к природе, сравнительно безопасных, достаточно полезных для здоровья человека доступных лекарственных средств [2].
Появление и широкое распространение бактерий с множественной лекарственной устойчивостью рассматриваются как серьезная проблема общественного здравоохранения. Устойчивость почти 70% бактерий к антибиотикам приводит к затяжным не излечимым заболеваниям и смертности пациентов. Бактериальные биопленкиStaphylococcus aureus и Escherichiacoli, устойчивые к антибиотикам, создают дополнительные трудности во время лечения, в связи с этим на сегодняшний актуальной проблемой является поиск антимикробного биопрепарата широкого спектра действия [3].
Чеснок рода Allium sativum из Центральной Азии на сегодняшний день культивируется по всему миру. Интересно отметить, что лекарственное эффективность чеснока широко известна и используется более 5000 лет.
Рисунок 1 - Чеснок Allium sativum
Чеснок является как профилактическим так и терапевтическим средством. Согласно записям, в Библии и другой литературы, в том числе китайской, египетской, греческой, Индийской, израильской, чеснок использовался для леченияширокого спектра заболеваний в древние времена, в том числе проказы, диареи, запора, астмы, лихорадки и многих других инфекций [4].
Благодаря его антимикробной активности во время Второй мировой войны чеснок применялся для лечения ран солдат. Совсем недавно эпидемиологические, экспериментальные и клинические данные показали, что чеснок и его препараты обладают широким спектром иммуномодулирующих свойств, таких как снижение уровня липидов в крови и кровяного давления и ингибирования роста микробов (вирусных, грибковых и бактериальных) [2, 4].
Чеснок укрепляет иммунитет, делая организм более устойчивым к простудам и прочим заболеваниям; нормализует уровень холестерина; оказывает благотворное влияние на ЖКТ;комплексное оздоровительное действие на сердечно-сосудистую систему;антибактериальное и противопаразитное (антигельминтное) воздействия, предотвращая процессы брожения и гниения в кишечнике; является мощным антиоксидантом [5].
Похожими свойствами обладает и красный лук Allium cepa. В своем составе он содержит серосодержащие соединения: цистеинсульфоксид, тиосульфинаты, cepaene; эфирное масло; флавоноиды: гликозиды кверцетина (4'-гликозид, 7, 4'-дигликозид, 3, 4'-дигликозид, 3-гликозид, 7-гликозид, 3-рутинозид или рутин, и 3-рамнозид или кверцетин), 7,4'- и 3-каемпферол гликозиды, изорамнетин 4'-гликозид и антоцианы (цианидин); олигофруктаны; сероидные сапонины, витамины С, В1, D и E [6].
Рисунок 2 - Лук Allium cepa
Как любое хорошее «лекарство», чеснок и красный лук имеют ряд ограничений для использования. В том числе, в связи с тем, что сульфанил, который оказывает раздражающее воздействие на стенки желудка при некоторых заболеваниях, чеснок и красный лук приносят непоправимый вред человеку. К примеру, при заболевании желудочно-кишечного тракта (гастрит, язва и другие заболевания в острой либо хронической фазе) и при панкреатите. В связи с этим, для более пролонгированного действия чеснока и красного лука, а также для обеспечения контролируемой доставки и равномерного безопасного распределения в ЖКТ, для сохранения стабильности и маскировки запахов успешным решением является микрокапсулирование антимикробного комплекса (соков чеснока и красного лука) в дешевый, но стабильный материал [7].
В технологии микрокапсул могут использоваться поверхностно-активные вещества, как правило, в том случае, если размер частиц конечного продукта имеет принципиальное значение, например, инъекционные формы. Если микрокапсулы используют в производстве препарата для перорального применения, то поверхностно-активное вещество не обязательно должно присутствовать, так как итоговый размер частиц, как правило, не имеет принципиального значения. В качестве поверхностно-активных веществ для стабилизации эмульсии при получении микрокапсул используются поливиниловый спирт, фосфолипиды, простые и сложные эфиры сорбитана, этоксилированные насыщенные глицериды или полиглицериды кислот жирного ряда [6,7].
В качестве вещества микрокапсулы могут быть использованы различные соединения. Одним из наиболее эффективных способов защиты биологически активных соединений от окисления, нагрева и испарения является применение альгината. Кроме того этот материал может обеспечить равномерную и контролируемую доставку, маскировать запах фитонцидов и продлить срок годности препарата без воздействия на их физические, химические илифункциональные свойства [8]. Milea et al. [9] и Akdeniz et al. [10] успешно были инкапсулированы фенольные соединения, извлеченные из кожуры лука. Пилетти и соавт. [9], где альгинат повышает термостойкость и растворимость в воде, а также сохраняет антимикробную активность [10].
В работе описывается получение антимикробного микрокапсули–рованного комплекса на основе альгината с включением соков чеснока и красного лука, который сможет обеспечить:
1) медленное и замедленное высвобождение компонентов чеснока и красного лука;
2) стабилизацию активных компонентов;
3) значительное усиление антимикробной и противо-биопленочной активности по сравнению со свободными соками чеснока и красного лука.
Таким образом целью исследования было определение антимикробной активности сока Allium sativum и Allium cepa на бактериальных моделях.
Задачами исследования являлись:
1. Отбор перспективных соков Allium sativumи Allium cepa, обладающих антимикробной активностью в отношенииStaphylococcus aureus.
2. Отбор перспективных соков Allium sativumи Allium cepaобладающих антимикробной активностью в отношении Escherichia coli.
3. Включение в микрокапсулы растительных соков.
4. Определение антимикробной активности микрокапсулированных соков Allium sativumи Allium cepa.
1. Материалы и методы
Источник бактериальных штаммов грамположительного золотистого стафилококка Staphylococcus aureus ATCC BAA 1026 и грамотрицательной кишечной палочки Escherichia coli ATCC 10536 были получены из коллекции микроорганизмов кафедры биотехнологии КазНУ имени аль-Фараби.
В качестве контроля брали стандартный антибиотик стрептомицин (Бангалор, Индия), который готовили путем разбавления взвешенных аликвот этого препарата в стерильном 1% фосфатном буфере рН 6,0, ежедневно готовили двукратные разведения. Серия разведений обычно состояла из десяти пробирок размером 100×13 мм, каждая из которых содержала 0,5 мл разведения антибиотика. К каждой пробирке добавляли 1,5 мл разведения 1: 100 в бульоне из приготовленной выше культуры бульона 1824 ч, и все пробирки инкубировались при 37С в течение 24 ч. Последняя пробирка, показывающая ингибирование организма в серии разведений, указывала на начальную чувствительность штамма в микрограммах антибиотика. Вторая пробирка, показывающая рост в серии разведений, была выбрана для приготовления разведений бульона 1:100 для второго воздействия серии разведений стрептомицина. Для повышения резистентности штамма к конкретному антибиотику была повторена описанная выше процедура [11].
Для приготовления растительных соков свежие луковицы чеснока (Allium sativum L.) и красного лука (Allium cepa) были приобретены на местном рынке. Луковицы были очищены и взвешены (100 г). Очищенный чеснок и красный лук подвергались поверхностной стерилизации путем погружения их в 70% (v/v) этанол в течение 60° С [12] остаточный этанол на поверхности выпаривали в стерильной камере ламинарного воздушного потока с последующей асептической гомогенизацией в стерильной ступке пестиком. Гомогенизированную смесь фильтровали через стерильную марлю. Этот экстракт рассматривался как 100% - ная концентрация сока чеснока и лука. Концентрированный сок дополнительно использовали во время эксперимента [12].
При исследовании антимикробной активности целевого продукта использовали метод, основанный на способности лекарственных веществ диффундировать в агар, зараженный тест-культурами микроорганизмов, и подавлять рост штаммов [10]. Определение активности изучаемых соков проводили в 3-х чашках Петри одинакового диаметра с плоским дном. В чашки, установленные горизонтально, наливали по 15 мл расплавленного питательного агара. На слой агара в чашке Петри заливали 1-2 мл взвеси испытуемого микроба в физиологическом растворе. Затем излишек взвеси полностью удаляли, подсушивали поверхность агара в течение 30 минут. Затем сверлом (6 мм диаметром) делали 6 отверстий («колодцев») на расстоянии 2,5 см от центра и на одинаковом расстоянии друг от друга, «колодцы» заполняли образцами экстрактов и растворителем в соответствующей концентрации (контроль). Чашки оставляли при комнатной температуре на 30 минут, после чего их ставили в термостат при температуре 37 °С, не переворачивая, строго горизонтально, чтобы получить круглые зоны. Под крышки чашки Петри помещали стерильный фильтр во избежание попадания конденсата на лунки. Зоны угнетения измеряли через 16 часов. Оценка результатов проводилась по диаметру зон задержки роста вокруг «колодца», включая диаметр самого «колодца»: отсутствие зоны задержки роста – испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации препарата; диаметр зоны задержки роста 10 мм – умеренная чувствительность культуры к данной концентрации препарата; диаметр зоны задержки роста более 10 мм – высокая чувствительность испытуемой культуры к данной концентрации препарата [10-11].
Для получения микрокапсулированного препарата на основе фитопрепаратов использовали 2 % раствор альгината натрия (Acros Organic, Бельгия). В альгинате указанной концентрации растворяли 200 мг навески.
Дополнительно для увеличения растворимости вещества в альгинат вводили 0,1 % неионогенного поверхностно-активного вещества (ПАВ) TritonX-100 (Serva, Германия). Смеси альгината с фитопрепаратом заправляли в одноразовые шприцы объемом 10 мл и капали с высоты около 15 см через иглы с диаметром отверстия 0,8 мм в 0,55 % раствор СаСl2. После 30 мин полимеризации образовавшиеся шарики вынимали из раствора, промывали дистиллированной водой, сливали воду и во флаконах помещали в холодильник [12-14].
Для контроля целостности гранул в жидкости содержимое каждого флакона выливали в стерильные стаканы диаметром 40 мм и подсчитывали распределившиеся монослоем количество гранул с измененной формой, соотнося их с числом частиц с интактной морфологией в процентном выражении по формуле: K = (ni/n0) x 100, где К – коэффициент изменения формы, %; ni – количество измененных гранул; n0 - количество исходных гранул [15].
2. Результаты исследования
2.1 Определение антимикробной активности фитосоков
Для определения антимикробной активности растительных соков чеснока и красного лука методом диффузии в агар тестировали по отношению к микробам мишеням S. aureus ATCC BAA 1026 и E. coli ATCC 10536.
В результате исследования были получены следующие результаты (Таблица 1 и Рисунок 3, 4).
|
А) Зоны задержки роста E. coli ATCC 10536 |
E. coli ATCC 10536 |
|
Б) Зоны задержки роста S. aureus ATCC BAA 1026 |
S. aureus ATCC BAA 1026 |
Рисунок 3 - Антимикробная активность сока чеснока по отношению к S. aureus ATCC BAA 1026 (А) и E. coli ATCC 10536 (Б)
Средние зоны торможения различных групп измерялись методом диффузионного анализа на агаре-лунке.
В результате проведённых исследований было установлено, что чеснок ингибирует рост культуры S. aureus ATCC BAA 1026 от 29±2,1 мм, тогда как зона ингибирования по отношению к E. coli ATCC 10536 составляет 35±2,9 мм.
Рисунок 4 - Антимикробная активность сока красного лука по отношению к S. aureus ATCC BAA 1026 (А) и E. coli ATCC 10536 (Б)
Средние зоны ингибирования сока красного лука по отношению к S. aureus ATCC BAA 1026 были выражены от 36±3,5 мм, а по отношению к E. coli ATCC 10536 зона задержки роста составляла 24±2,3 мм.
Таблица 1 - Результаты антимикробного действия сока чеснока и красного лука по отношению к штаммам S. aureus ATCC BAA 1026 и
E. coli ATCC 10536 (на 3-5 сутки)
|
Вид условно-патогенных микроорганизмов |
Зона ингибирования роста культур, мм |
||
|
сок Allium sativum |
сок Allium cepa |
Контроль Антибиотик стрептомицин |
|
|
Staphylococcus aureus ATCC BAA 1026 |
29±2,1 |
36±3,5 |
0 |
|
Escherichia coli ATCC 10536 |
35±2,9 |
24±2,3 |
5±2 |
Известно, что инфекции, вызванные полирезистентными штаммами микроорганизмов, такими как S. aureus ATCC BAA 1026 (А) и E. coli ATCC 10536 крайне сложно поддаются лечению при использовании обычных антибиотиков, к примеру стрептомицина. Было показано, что чеснок и красный лук являются достаточно мощными фитопрепаратами, которые могут защитить организм человека или животного от различных инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Однако по результатам многократного эксперимента было установлено, что по сравнению с соком красного лука, сок чеснока более эффективно подавляет рост бактерий Escherichia coli ATCC 10536, тогда как красный лук хорошо подавляет рост культур S. aureus ATCC BAA 1026.
В связи с тем, что растительные соки чеснока и красного лука способны в определённой степени подавлять рост и развитие условно-патогенных микроорганизмов, для дальнейшего исследования было принято решение, создать новый высокоэффективный антимикробный препарат на основе сока чеснока и красного лука в соотношении 50/50.
2.2 Микрокапсулирование комплексного растительного фитопрепарата
Однако, чтобы защитить биологически активные соединения соков чеснока и красного лука от окисления, нагрева и испарения, для обеспечения контролируемой доставки и равномерного безопасного распределения, для сохранения стабильности при хранении, для маскировки запахов и продления срока годности без воздействия на их физические, химические или функциональные свойства, необходимо было инкапсулировать полученный комплекс растительных соков включить в микрокапсулы.
В качестве метода модификации с целью повышения устойчивости выбранных растительных соков использовали микропсулирование с применением пленкообразователей в виде альгината натрия (Рисунок 5).
Рисунок 5 - Альгинатные гранулы с комплексом растительных соков
В процессе работы по микрокапсулированию образцы альгината пропускали через шприц и получали сферические гранулы размером 2,5±0,31 мм, куда в последующем включали 2 мл сока чеснока и красного лука, рисунок 6.
Рисунок 6 – Измерение размера микрокапсул
Полученные микрокапсулы тестировались на предмет деструкции при нахождении в воде в условиях комнатной температуры в течение месяца.
Рисунок 7 – Антимикробное действие микрокапсул на тест-культуры
Через месяц микрокапсулы прокалывали иглой и наносили содержимое вместе с капсулой методом диффузии на агар, предварительно зараженный тест-культурами Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Качественное тестирование микрокапсул доказывает, что активность растительных соков Allium sativum и Allium cepa сохраняется на всех стадиях приготовления образцов микрокапсул, а именно во время смешивания фитопрепарата с раствором альгината, в процессе и после внедрения фитопрепарата в микрокапсулы. Кроме того, результаты исследования показали, что в комплексе микрокапсулированный фитопрепарат влияет на рост тест штаммов значительно лучше, чем монопрепарат. Это показано на рисунке 6, зона ингибирования Staphylococcus aureus и Escherichia coli составляет 39±1,37 мм, что подтверждает эффективную антимикробную активность микрокапсулированного комплексного растительного фитопрепарата (Рисунок 7).
В целом, микрокапсулированный антимикробный комплекс может быть многообещающим кандидатом для лечения хронических инфекций, вызванныхStaphylococcus aureus и Escherichiacoli.
Выводы
1. По результатам антимикробного теста в отношении Staphylococcus aureus были отобраны перспективные соки Allium sativum с зоной отсутствия роста 29±2,1мм и Allium cepa - 36±3,5 мм.
2. В результате проведения антимикробного теста в отношении Escherichia coli были отобраны перспективные соки Allium sativum с зоной отсутствия роста 35±2,9 мм и Allium cepa -24±2,3 мм.
3. Растительные соки Allium sativum и Allium cepa были включены в микрокапсулы альгината натрия.
4. Зоны ингибирования роста тест штаммов Staphylococcus aureus и Escherichia coli после включения в микрокапсулы растительных соков составило 39±1,37 мм.
Список использованной литературы
1. Национальный доклад по науке: МОН РК – Астана, 2015. – 217 с.
2. Стратегия ВОЗ в области народной медицины 2014-2023. – 75 с.
2. Roth, N.; Hofacre, C.; Zitz, U.; Mathis, G.F.; Moder, K.; Doupovec, B.; Berghouse, R.; Domig, K.J. Prevalence of antibiotic-resistant E. coli in broilers challenged with a multi-resistant E. coli strain and received ampicillin, an organic acid-based feed additive or a synbiotic preparation. Poult. Sci. 2019, 98, 2598–2607.
3. Suresh, G.; Das, R.K.; Brar, S.K.; Rouissi, T.; Ramirez, A.A.; Chorfi, Y.; Godbout, S. Alternatives to antibiotics in poultry feed: Molecular perspectives. Crit. Rev. Microbiol. 2018, 44, 318–335.
4. Van Boeckel, T.P.; Brower, C.; Gilbert, M.; Grenfell, B.T.; Levin, S.A.; Robinson, T.P.; Teillant, A.; Laxminarayan, R. Global trends in antimicrobial use in food animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 5649–5654.
5. Diarra, M.S.; Malouin, F. Antibiotics in Canadian poultry productions and anticipated alternatives. Front. Microbiol. 2014, 5, 282.
6. Mehdi, Y.; Létourneau-Montminy, M.-P.; Gaucher, M.-L.; Chorfi, Y.; Suresh, G.; Rouissi, T.; Brar, S.K.; Côté, C.; Ramirez, A.A.; Godbout, S. Use of antibiotics in broiler production: Global impacts and alternatives. Anim. Nutr. 2018, 4, 170–178.
7. Kim, W.H.; Lillehoj, H.S. Immunity, immunomodulation, and antibiotic alternatives to maximize the genetic potential of poultry for growth and disease response. Anim. Feed Sci. Technol. 2019, 250, 41–50.
8. Melia U., Van Hal, S.J. Candidemia following solid organ transplantation in the era of antimicrobial prophylaxis: the Australian experience / Melia U., Hal, D.J. Marriott, S.C. Chen // Transpl Infect Dis. – 2009. – Vol. 11, N 2. – P.122-127.
9. Akdeniz G.,Varshosaz, J. Effect of citric acid as cross-linking agent on insulin loaded chitosa n microspheres / Akdeniz G, R. Alinagari // Iranian Polymer Journal. – 2005. – Vol. 14, N 7. – P. 647-656.
10. Поляк, М.С. Питательные среды для медицинской микробиологии / М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. – СПб.: НИЦФ, 2002. – 80 с.
11. Попова, Л.М. Химические средства защиты растений: учеб. пособие / Л.М. Попова. – СПб.: СПбГТУРП, 2009. – 96 с.
12. Weller, D.M. Potential applications of plant based derivatives as fat replacers, antioxidants and antimicrobials in fresh and processed meat products.// Phytopathology. – 2007. – Vol. 97, N 2. – P. 250-256.
13. Dorman, H.J.D.; Deans, S.G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J. Appl. Microbiol. 2000, 88, 308–316.
14.Cavallito, C.J.; Bailey, J.H. Allicin, the antibacterial principle of Allium sativum. I. Isolation, physical properties and antibacterial action. J. Am. Chem. Soc. 1994, 66, 1950–1951.
15. Taylor, T.M.; Davidson, P.M. Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds. In Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, 3rd ed.; American Society of Microbiology: Washington, DC, USA, 2014; pp. 713–745.