XII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Оптико-микроскопический анализ старения и стрессовых реакций листвы
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
1.Актуальность темы:
Исследования процессов старения и стрессовых реакций растений актуальны по нескольким причинам. Растения выполняют важную функцию в природе. Такие функции, как: Космическая роль в природе, фотосинтез, образование озонового слоя в атмосфере, питание для всех живых существ . С растений начиналось образование всего живого на нашей планете и многие происходящие в них процессы в основных чертах повторяются и в других биосистемах вплоть до млекопитающих (включая и человека). Например, один из ключевых моментов жизнедеятельности и растений, и животных – реакция на резкое изменение внешних условий, называемое стрессом. Стрессовые ситуация такие как: резкое похолодание, перепады температуры. А так как растения с методической точки зрения значительно проще для экспериментальных исследований по сравнению с людьми, изучение процессов старения и стрессов в растительных компонентах может существенно способствовать прогрессу, не только в ботанике, но и в биомедицине. Вторым фактором актуальности нашей темы является то, что растения – основа питания всего животного мира (в том числе и людей), так как в процессе фотосинтеза происходит химическое преобразование видимой (солнечной) энергии в энергию химических связей органических веществ при участии фотосинтетических пигментов. Всем известно, что фотосинтетические пигменты – зелёного цвета, у растений – хлорофилл, который имеет формулу C₅₅H₇₂O₅N₄Mg В процессе фотосинтеза поглащается CO2, а в процессе дыхания поглащается O2, благодаря этому мы можем дышать, так как поддерживается концентрация CO2 и O2 в атмосфере.. Так же на фоне быстро увеличивающейся численности населения Земли остро актуальны проблемы повышения урожайности, питательности, выживаемости растений, уменьшение численности фотосинтезирующих растений, для решения которых необходимо значительное углубление понимания происходящих в них процессов. Кроме того, к настоящему времени общепризнано, что в жизнедеятельности растений главную роль играют фотоэлектрические и электрофизические явления (фотосинтез, разделение и перенос электрических зарядов и др.), в регулировании которых естественная природа достигла высокого совершенства. Например, эффективность разделения зарядов при фотосинтезе в растениях превышает 90%, в то время как в самых лучших и самых дорогих солнечных батареях, требующих значительных производственных затрат, этот параметр достигает всего лишь от 20 до 40 %. Поэтому развитие понимания микроскопики процессов, происходящих в растениях, способно принести большую пользу повышению эффективности, экологичности и экономичности научно-технических разработок в энергетической, электронной и оптической областях.
Цели и задачи:
Изучить и дать новую информацию о микроскопическом уровне процессов старения и стрессовых реакций в растениях посредством экспериментального наблюдения, а также дать анализ об изменении в структуре листвы растений при неблагоприятных условиях, такие как: изменения условий внешней среды, лазерных и электрических воздействиях. Предположить, благодаря чему происходит активация антоцианов, так как в наше время они недостаточно изучены.
2. Методики экспериментов.
Для проведения экспериментов использовали листья, которые были только сорваны в период с начала по конец сентября 2020 года с таких растений, как клен и крапива. Так же изучали их водные суспензии, приготовленные раскатыванием листьев в чашке Петри стальным шариком с добавлением пару каплей дистиллированный воды. Листья клена были в разных состояниях, то есть различались своей окраской (зеленые, желто-зеленые, желтые, красно-зеленые и красные). Внутренние структуры листьев и их водные суспензии в исходном состоянии и после внешних воздействий (лазерным облучением и электрическим полем) исследовались с помощью оптического микроскопа как в неполяризованном белом свете, так и при размещении просвечиваемых образцов между скрещенными поляризаторами. Лазерное воздействие проводилось непрерывным полупроводниковым лазером с красным излучением (длина волны 633 нм) интенсивностью 200 милливатт (3 минуты) . Электрическое воздействие осуществлялось постоянным полем от аккумулятора с разностью потенциалов 14 вольт. Суспензии размещались на предметном стекле оптического микроскопа между параллельными электродами из алюминиевой фольги. Зазор между электродами составлял 3 мм, а напряженность электрического поля, действующего на образцы – порядка 40 в/см. Наблюдения проводились как визуально, так и с регистрацией процессов и результатов воздействий с помощью видеокамеры и компьютера.
3.Экспериментальные результаты и их обсуждение.
Наши эксперименты показали, что оптическая микроскопия – это эффективная методика исследований поведения компонентов растений в различных условиях. На рисунках 1 и 2 показаны участки листьев клена в двух состояниях: зеленом состоянии, сорванного с дерева два часа назад (время - начало сентября), и побуревшего листа, подобранного из-под того же клена в начале октября. Увеличение на этих и последующих снимках - 300-кратное. Эти снимки сделаны в проходящем свете на листьях , помещенных между скрещенными поляризаторами. В этом случае участки, не содержащие оптически анизотропных фрагментов, выглядят темными. Оптическая анизотропия создает локальное просветление тем больше, чем сильнее анизотропия. Свежий лист (рис. 1) характеризуется сильной оптической анизотропией прожилок между изотропными областями мягких зеленых тканей. В прожилках зеленого листа просматриваются расположенные вдоль них микрокапилляры, обеспечивающие доставку питательных веществ и воды от корней к листьям и продуктов фотосинтеза к другим тканям растения. Микрокартина бурого листа существенно отличается. Во-первых, в прожилках не заметно следов оптической анизотропии, явно проявлявшихся в свежем листе. Во-вторых, в зонах между прожилками появились микроучастки с сильной анизотропией. Исчезновение анизотропии в прожилках свидетельствует о разрушении целлюлозных микроволокон. Образование анизотропных микроучастков в зонах мягких тканей между прожилками указывает на формирование там взаимно ориентированных групп протяженных биомолекул. Возможно, это фрагменты целлюлозы, белков и других биополимеров, изначально имевшихся в растении или сформированных там в результате реакций между собственными компонентами растения и инородными веществами, внесенными туда внешними микроорганизмами типа бактерий или грибков. Для уточнения этого вопроса требуются дополнительные исследования процессов, происходящих с листьями между двумя этими состояниями. На рис. 3 и 4 показаны микрофотографии листьев клена в двух стадиях старения. В самом начале на зеленом в целом фоне мягких тканей между прожилками проявляются участки пожелтения- микроостровки (рис.3). На следующей стадии, когда общий фон мягких тканей стал желто-зеленым (рис. 4), к желтым добавились микроостровки красного цвета. Публикации по структуре растений связывают появление желтых областей растений с увеличенным содержанием каротиноидов, а красных – антоцианов. При этом каротиноиды, судя по литературным данным, должны появляться одновременно с хлорофиллами, определяющими зеленую окраску листьев и отвечающими за процесс фотосинтеза. Относительно формирования желтой окраски мнения в литературе расходятся, так как эти темы мало изучены. Одна из точек зрения связывает желтизну с распадом хлоропластов при осеннем спаде солнечной активности, за счет чего ослабляется зеленая окраска и из-под нее проявляется желтый цвет каротиноидов. Другие авторы считают необходимым увеличение общего количества каротиноидов. А появление красного цвета листьев при наступлении осеннего резкого похолодания в литературе связывается и каротиноидами других видов, и с синтезом антоцианов, который начинается одновременно с разрушением хлорофиллов. Наши последующие наблюдения дают дополнительную информацию для прояснения этих вопросов.
На рис. 5 показан фрагмент листа клена с одновременным присутствием больших зеленых и желтых участков. Важно подчеркнуть, что в этом случае наблюдение ведется в проходящем свете, хотя в обычных случаях и зеленые, и желтые листья рассматриваются в свете отраженном. Цвет материала в отраженном свете определяется прежде всего веществом, находящимся на его поверхности. А в проходящем вклады в окраску дают и поверхностные , и объемные вещества в пропорциях, определяемых их количествами и спектрами пропускания света. По сопоставлению количественных изменений спектров пропускания, отражения и прозрачностей, интегрированных по всему спектру, можно определить по отдельности абсолютные изменения содержания разных веществ (хлорофилла, каротиноидов и антоцианов). По тому, что на рис. 5 участки желтого цвета выглядят ярче, чем зеленые, можно заключить, что суммарное количество свето-поглощающих веществ в желтых участках меньше, чем в зеленых. Этот факт делает более вероятной версию осеннего пожелтения на основе распада хлорофилла и проявления за счет этого жёлтых каротиноидов. Дополнительное подтверждение эта версия получает из рис. 6, где представлены изменения микрокартины участка листа крапивы после облучения красным лазером, свет которого хорошо поглощается хлорофиллом и может привести к его разрушению. Пожелтение участков листа после облучения сопровождается увеличением их яркости. Это можно объяснить тем, что интенсивное лазерное облучение, разрушая хлорофилл, «раскрывает» цвет желтых каротиноидов, изначально содержавшихся в листе. С другой стороны, в красных островках на рис. 4 и 10 яркость пропускания света не выше, чем в окружающих их зеленых областях и слабее, чем в желтых островках. Из этого следует, что вещества, определяющие красный цвет, до распада хлорофилла в листе отсутствовали. Таким образом, осеннее появление красной окраски растений определяется синтезом антоцианов, происходящим при распаде хлорофилла, и этот распад вызывает также появление желтой окраски за счет проявления содержащихся изначально желтых каротиноидов.
Четко ограниченная локализация микроостровков зарождения желтой и красной зон свидетельствует о том, что определяющие это зарождение процессы распада хлорофилла и синтеза антоцианов носят лавинный характер, т.е. по мере накопления таких преобразований их скорость все более возрастает (рис. 3,4,10).
Такие нелинейные по времени скорости преобразований можно объяснить активным участием в них электрических полей. Например, при фотосинтезе в растениях происходит активное разделение зарядов: электроны, возбуждаемые в хлорофилле поглощаемым им светом, выносятся наружу тилакоидов. Остающиеся внутри положительные заряды создают вместе с этими электронами сильное электрическое поле, деформирующее мембраны тилакоидов и хлоропластов. Действие этого поля способно разрушить мембрану, вызвав выброс электрических зарядов, которые могут быстро разлететься по другим мембранам, индуцировав и их разрывы. Эти лавинные разрывы мембран сопровождаются разрушениями прикрепленных к ним хлорофиллов. Локальные лавиноподобные разрушения хлорофиллов приведут к появлению желтых микроостровков каротиноидного просветления и красных – антоцианного покраснения.
Возможность эффективного разрушения хлорофиллов сравнительно небольшим электрическим полем была подтверждена экспериментально воздействием электрического поля напряженностью 100 в/см (рис. 8). Водная суспензия с растертыми зелеными листьями крапивы помещались на предметное стекло оптического микроскопа между электродами в виде параллельных полосок алюминия . На электроды, расстояние между которыми было порядка 3 мм, подавалась постоянная разность потенциалов в 30 в. В течение нескольких секунд у отрицательного электрода формировалась «пена» из микропузырьков серого вещества.
При нормальных условиях фотосинтеза в растениях действует предохранительный механизм, ограничивающий величины фотоэлектрических полей в мембранах тилакоидов и хлоропластов. Он основан на подвижности хлоропластов, взвешенных в цитоплазме клеток. Когда разделение зарядов, индуцированное светом, приближается в опасной величине , хлоропласт под действием электростатических сил переворачивается и подвергавшяся светвому облучения мембрана уходит в тень. Но при резком похолодании цитоплазмы клеток загустевают, сильно затрудняя процессы переворачивания хлоропластов. В этой ситуации при освещении разделение зарядов на мембране «примороженного» хлоропласта быстро достигает критического предела, приводя к разрушению ее и закрепленных на ней хлорофиллов. Так как молекулярные структуры хлорофилла и антоцианов близки, из фрагментов разрушенных хлорофиллов могут формироваться антоцианы.
Результаты воздействия красным лазером на листья крапивы и водную суспензию с их растертой зеленой массой также можно объяснить электрическими процессами, возбуждаемыми при поглощении света хлорофиллами. Как известно, молекулы воды сильно полярны, т.е. обладают большим дипольным моментом. Поэтому вода активно связывается с электрически полярными веществами, являясь для них эффективным растворителем (хорошо известные примеры – поваренная соль и сахар). При поглощении света хлорофиллом зеленых клеток листа, граничащих с окружающей лист водой, в хлоропластах происходит разделения электрических зарядов с соответствующей поляризацией. Молекулы воды, связываясь с поляризованными хлоропластами, отрывают их от массы листа и увлекают их в раствор. С другой стороны, в суспензии растертой зеленой массы хлоропласты, тилакоиды и отдельные хлорофиллы уже окружены молекулами воды. Их электрическая поляризация, происходящая при поглощении света хлорофиллами, возбуждает дипольное взаимодействие между соседними частицами и их притяжение друг к другу. По этим причинам лазерное облучение водной суспензии индуцирует коагуляцию зеленых частиц, в то время как облучение помещенных в воду зеленых листьев вызывает их растворение (рис. 6,7).
Следует подчеркнуть, что коагуляция водных суспензий с зелеными компонентами растений при облучении их светом может быть использована для формирования нового типа солнечных батарей. Внутри таких коагулированных микрочастицах тилакоидные пластинки ориентированы одинаково. Поэтому, если организовать единую ориентацию всех микрочастиц зеленой массы внешним электрическим полем, то последующее облучение их солнечным светом создаст в этих частицах макроскопическую электрическую поляризацию и при подключении к поляризуемой светом суспензии электрических контактов возникнет электрический ток.
На рис. 9 – 11 представлены микрофотографии, характеризующие динамику реакции листьев клена на интенсивное стрессовое воздействие. В данном случае представлены образцы листьев, покрасневших в течение одного – двух дней при похолодании, пришедшем в московский регион в начале октября 2020 года. На рис. 9 показан фрагмент листа, покрасневший почти целиком за исключением небольшого участка чуть правее середины кадра, окружающий стык трех прожилок. Здесь видно, что покраснение пошло сразу в зеленой фазе (минуя стадию пожелтения). Отсюда можно сделать вывод, что, как указывалось выше, покраснение и пожелтение процессы разной природы, которые могут развиваться независимо друг от друга. Тот факт, что покраснение задержалось у стыка прожилок, где сообщение зеленой ткани листа с другими частями растения обеспечивается лучше, приводит к заключению, что генерация антоцианов развивается в зеленых тканях автономно и независимо от системы централизованных связей. Еще одно подтверждение этого заключения показано на рис. 10: снизу от магистральной прожилки покраснение произошло практически полностью, в то время как сверху оно только начинается. То есть магистральные связи с другими органами растения не только не стимулируют покраснений, но и служат в качестве барьеров для их распространения.
Сопоставление внутренних структур прожилок между участками мягких тканей в зеленых, желтых и красных фазах листьев (см. все рисунки за исключением 9-го) показывает, что в процессах межфазовых превращений изменяются не только мягкие ткани, но и прожилки. В зеленой фазе внутри прожилок просматриваются продольные микрокапилляры, обеспечивающие коомуникации листа с другими частями. В желтой в структуре прожилок начинают проявляться поперечные разбиения. А в красной фазе эти разбиения уже сформировали четкую ячеистую структуру внутри прожилок (см. центральную часть рис. 11). Кроме того, в красной фазе общая площадь прожилок заметно возросла, т.е. они расширились за счет преобразований прилегающих к ним участков мягких тканей. То есть одновременно с покраснением и утолщением кутикулы в листьях при стрессе продольная структура прожилок преобразуется в ячеистую, а сами прожилки заметно расширяются. Из этого можно предположить, что формирование красных антоцианов в листьях при стрессах резкого похолодания - не просто финальная фаза жизни отмирающего органа, а целенаправленная акция, необходимая для возобновления активной жизни многолетнего растения при наступлении очередной весны. С этой точки зрения указанные выше утолщение кутикулы и преобразование прожилок – способ сохранить образовавшиеся в опадающих под дерево листьях антоцианы до весны с тем, чтобы через почву и корни дерево смогло впитать их в развивающиеся ткани. Полезные функции антоцианов в качестве антиоксидантных и антизлокачественных факторов достаточно подробно описаны в литературе. В таком смысле целесообразность преобразований кутикулы и прожилок в листьях, которые вот-вот опадут или уже опали, становится понятной. Необходимо защитить антоцианы от проникновения агрессивных бактерий, разрушающих ткани листа (рис.2). Для этого утолщается кутикула, формируются поперечные перегородки в прожилках, а сами они расширяются, чтобы выдержать механическое воздействие снега, способное разрушить защитный слой кутикулы раньше времени.
4. Основные результаты и выводы
1. Обнаружено, что и старение зеленых листьев в виде пожелтения, и стрессовое покраснение в виде появления антоцианов начинаются с образования желтых и красных микроостровков, которые по мере разрастания постепенно заполняют всю площадь листа. Такую динамику старения и стрессового покраснения листвы можно объяснить тем, что процессы разрушения хлорофиллов и формирования антоцианов носят автокаталитический характер, когда скорости указанных преобразований существенно возрастают по мере накопления уже преобразованных в данной области листа органелл. Причиной такого возрастания могут быть, например, затруднения в переворотах хлоропластов, взвешенных в строме клеток листа, в связи с загустением цитоплазмы из-за повышения концентрации продуктов предшествующих распадов других хлоропластов.
2. Экспериментальным путем установлено, что при естественном старении и стрессовых преобразованиях листьев в первую очередь изменяются клеточные ткани между прожилками, а после этого – сами прожилки. С другой стороны, при нападениях вредителей в виде грибков или бактерий – наоборот, прожилки разрушаются в первую очередь. Это объясняется тем, что внешним вредителям выгодно как можно быстрее разрушить защитную структуру листьев, а самому растению необходимо ее сохранить как можно дольше для нормальной жизнедеятельности.
3. Обнаружено, что облучение зеленых листьев красным светом, поглощаемым Хлорофиллом, ускоряет их пожелтение и растворение в воде, в то время как такое же облучение водных растворов с компонентами растертых листьев приводит, наоборот, к коагуляции зеленых компонентов. Оба процесса объясняются электрической поляризацией зеленых компонентов при поглощении света. В первом случае их поляризация усиливает взаимодействие связанных в тканях компонентов с полярными молекулами контактирующей с ними воды, а во втором возникает взаимное притяжение взвешенных в воде хлоропластов, тилакоидов и хлорофиллов, вызывающее их коагуляцию.
4. Экспериментами по разрушению зеленых компонентов листьев электрическим полем показано, что главным действующим фактором изменений в зеленых тканях листьев при старении и стрессах могут быть локальные электрические поля, вызывающие распад молекул хлорофилла.
5. Обнаружено, что при стрессовом покраснении происходят увеличение поперечных сечений прожилок листьев и преобразование их внутренней структуры от пучков продольных микрокапилляров к сетке микроячеек. Оба процесса обусловлены тем, что при стрессе предназначение прожилок изменяется от обеспечения связи с корнями растения к усилению защиты преобразованного листа, содержащего антоцианы, необходимые растению в будущем сезоне для усиления его сопротивляемости вредоносным факторам. Одним из факторов такой защиты может быть активация производства молекул воска непосредственно в тканях листа для образования защитного слоя его кутикулы.
5.Список использованной литературы
1. В.А Опритов Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского. Электричество в жизни животных и растений.
2. О.Ю Шоева. Библиотека в популярных журналах «Химия и Жизнь», Антоцианы: секреты цвета. «Химия и Жизнь» №1, 2013
3. Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный университет им. А.М. Горького». ИОНЦ «Экология и природопользование». Биологический факультет. Кафедра экологии. Кафедра физиологии и биохимии растений. РАСТЕНИЕ И СТРЕСС. Курс лекций. Екатеринбург 2008.
Рис. 1 . Микрофотография зеленого листа клена в скрещенных поляризаторах (середина сентября). На фоне однородной и изотропной зеленой ткани ярко выделяются прожилки, содержащие продольно ориентированные микрокапилляры из целлюлозы
Рис. 2. Микрофотография листа клена, деградировавшего до бурого состояния, в скрещенных поляризаторах (середина октября). Заметное потемнение прожилок указывает на разрушение целлюлозных волокон, которые раньше определяли их анизотропию. В то же время в тканях между прожилками появились анизотропные микрозоны.
Рис. 3. Микрофотография листа клена при первой стадии пожелтения. Видно, что оно начинается с образования большого количества микроостровков желтого цвета.
Рис. 4. Микрофотография листа клена при второй стадии пожелтения. На фоне желто- зеленой окраски увеличилось количество красных микроостровков, свидетельствующих об участившихся зарождениях антоцианов.
Рис. 5. Микрофотография желтеющего листа клена с участками, пораженными вредителями. В нижней части хорошо видно, что поражение пожелтевших листьев в первую очередь распространяется по прожилкам.
Рис. 6. Вверху – микрофотография фрагмента желтеющего листа крапивы, расплоложенного в воде, до облучения красным лазером. Внизу – тот же фрагмент после трех минут лазерного облучения. Отчетливо видно уменьшение площади нижней части листа и его пожелтение после облучения .
Рис. 7. Микрофотографии водной суспензии растертого зеленого листа крапивы. Вверху – до облучения красным лазером, внизу – после трехминутного облучения. Отчетливо видно расширение зеленых участков, вызванное коагуляцией зеленых компонентов при лазерном облучении.
Рис. 8. Микрофотография процесса разрушения зеленых компонентов в водной суспензии растертого листа крапивы электрическим полем. Справа – отрицательный электрод, у которого разрушение идет значительно сильнее.
Рис. 9. Микрофотография краснеющего листа клена. Наличие зеленого участка указывает на то, что стрессовое покраснение началось, минуя стадию пожелтения.
Рис. 10. Микрофотография участка красно-желто-зеленого листа клена. Отчетливо видно, что магистральная прожилка является резкой границей между областями с различными стадиями преобразований зеленой ткани листа.
Рис. 11. Микрофотография покрасневшего листа клена с отчетливо проявившейся ячеистой микроструктурой прожилок.