XII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Особенности микроклонального размножения малины красной на питательных средах различного состава
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время производство плодов и ягод повсеместно возрастает – с ростом популярности экологически чистого питания и здорового образа жизни (за первое десятилетие XXI в. производство ягод выросло вдвое). Малина (Rubus idaeus L.) – одна из наиболее ценных ягодных культур, популярных не только в России, но и во многих странах мира. Наша страна является лидером на мировом рынке по выращиванию малины, однако доля ее в объеме валового сбора ягодной продукции невелика [10].
Исследователи отмечают трудоемкость возделывания малины, но считают, что ее производство в промышленных масштабах экономически оправдано [10; 12]. Помимо вкусовых качеств, достоинством ее плодов являются содержащиеся в них витамины групп B, Е, К, РР, аскорбиновая, кофейная, салициловая кислоты, обладающие лекарственным действием. Благодаря антиоксидантам, ее соки выступают клеточными «антистрессорами», которые уменьшают отрицательное действие свободных радикалов, накапливающихся в клетке при разных дестабилизирующих воздействиях [10; 15; 18]. Важность повышения потребления населением ягод, в частности, малины красной, приобретает все большую актуальность в условиях ухудшения экологической обстановки, распространения малоподвижного образа жизни и многочисленных стрессов современности.
Как отмечается в литературе, за последние годы потребление плодов и ягод в России составляло менее 60 кг на душу населения, а удельный вес отечественной продукции не превышал 28%. Актуальной проблемой также становится активный импорт посадочного материала и рост конкуренции со стороны иностранных производителей [10]. Учитывая, что рекомендуемый уровень потребления плодов и ягод составляет 90-100 кг на человека в год, можно утверждать, что необходимость активизации и совершенствования производства отечественной плодово-ягодной продукции в России стоит особенно остро. В этих условиях большое значение приобретают современные методы размножения посадочного материала малины красной [13].
Для закладки насаждений плодовых и ягодных культур необходимо наличие стандартизированного, высококачественного посадочного материала, который может предоставить производство, основанное на использовании современных биотехнологических методов размножения растений. К таким методам относится микроклональное размножение [2; 6; 12; 13; 16 и др.].
Объектом нашего исследования были растения малины красной (Rubus idaeus L.), размножаемые микроклональным способом на базе лаборатории биотехнологии «Агрокуб», а его предметом – эффективность размножения и специфика процессов органогенеза у эксплантов малины на средах с различным содержанием минеральных и органических веществ. Целью работы было сравнение эффективности микроклонального размножения малины в различных условиях и определение оптимального их сочетания. Задачи исследования включали в себя анализ литературы по проблеме микроклонального размножения растений рода Rubus, изучение соответствующих биотехнологических методик, проведение эксперимента in vitro и анализ полученных результатов.
Основным методом исследования являлся лабораторный эксперимент. Для обработки полученных данных использовались статистические расчеты в программе Microsoft Office Excel 2003. Исследование проводилось в 2020-2021 гг. в ТОГАОУ «Мичуринский лицей-интернат».
1. МАЛИНА КРАСНАЯ КАК ОБЪЕКТ БИОТЕХНОЛОГИИ
1.1. Биологические особенности и хозяйственная ценность малины красной
Малина красная, или обыкновенная (Rubus idaeus L.) – листопадный полукустарник семейства Розовых порядка Розоцветных. Растения рода Rubus L. успешно произрастают в большинстве природно-климатических зон [4; 17].
Подземная часть представлена многолетним корневищем с множественными придаточными корнями, наиболее толстые горизонтальные корни иногда тоже ошибочно принимают за корневища, хотя они отличаются по строению. На корневище располагаются пазушные почки, а на корнях – придаточные (адвентивные), образующие корневые отпрыски.
Надземные побеги прямостоячие. В первый год они травянистые, зелёные с сизым налётом, как правило, не ветвятся. На них в пазухах листьев закладываются основная и 1-2 запасные почки. На второй год надземные побеги одревесневают и становятся серо-коричневыми, а сразу после плодоношения – засыхают. Подземные побеги закладываются на корневищах и корнях. В первый год они имеют длину 4-6 см и находятся в этиолированном состоянии (нежные, бледно-зеленые). Следующей весной они вырастают и замещают собой отмирающие надземные побеги.
Стебли малины обычно покрыты тонкими частыми миниатюрными шипами, растут в высоту до 1,5-2 м, в толщину – до 1-1,5 см. Листья сложные, непарноперистые, с 3-7 овальными листочками, самый крупный из которых – верхний, снабжены прилистниками. Снизу листья опушены мелкими беловатыми волосками, сверху – тёмно-зелёные. Все почки у малины вегетативно-генеративные (могут образовывать побеги и цветки), дифференциацию они проходят осенью (с сентября до декабря), начиная с верхушечных и заканчивая нижними. Из почек формируются плодовые побеги, несущие листья и заканчивающиеся соцветиями [4; 9; 10].
В средней полосе России малина цветет в июне-июле, иногда до августа, является хорошим медоносом. Цветки белые, правильные, типичные для представителей семейства, около сантиметра в диаметре, чашелистики длиннее лепестков. Соцветия кистевидные, небольшие, цветки в них направлены вниз, что способствует опылению пчелами. С гектара малины пчелы собирают 50-70 кг меда за лето [1; 4].
Плоды у малины сборные – это небольшие волосистые многокостянки, легко отделяющиеся от цветоложа при созревании. Как правило, плоды появляются на второй год, однако у некоторых ремонтантных сортов и в южных районах они могут формироваться и осенью первого года. Цвет плодов, в основном, розово-красный («малиновый»), но существуют сорта и с желтыми, и с почти черными плодами [5; 9].
Костянки малины содержат углеводы (11%), пектиновые и белковые вещества, слизь; спирты (винный, изоамиловый), кетоны (ацетоин, диацетил, β-ионон), антоцианы; органические кислоты (яблочная, кофейная, лимонная, винная, салициловая и др.) – 1-2 %, витамины C, A, B2, B6, PP, K; следы эфирного масла, дубильных веществ. Семена малины содержат до 22 % жирного масла [10; 15; 18].
Содержание солей железа в малине в 3 раза выше, чем в яблоках, грушах и черной смородине – это позволяет предполагать ценность железа в качестве элемента минерального питания для малины красной. Железо играет важную роль в жизни растений: входит в состав ферредоксинов – посредников в окислительно-восстановительных реакциях фотосинтеза, рибонуклеотид-редуктаз, участвующих в синтезе ДНК, ферментов пероксисом; железосодержащие белки участвуют в восстановлении нитритов и сульфатов. Недостаток железа проявляется как хлороз (заболевание с пожелтением и побледнением листьев) у растений [11; 14; 18].
Плоды малины употребляют в свежем виде, используют для консервирования, приготовления напитков, применяют в качестве лекарственного средства. В народной медицине чай с плодами и листьями малины используют при простуде [9; 10; 15].
Таким образом, малина красная является ценной ягодной культурой, обладающей высокими пищевыми качествами и лекарственными свойствами и являющаяся медоносом. Хорошие способности к вегетативному размножению облегчают возможность ее клонирования в лаборатории.
1.2. Микроклональное размножение растений как современный метод биотехнологии
Биотехнология понимается как вид технологии, связанный с использованием биологических систем, живых организмов или их производных для изготовления продуктов или изменения технологических процессов и их практического использования. Микроклональное размножение – способ массового размножения растений, которое проводится в пробирке (в условиях in vitro), где из клеток изолированных тканей получают растения, генетически идентичные исходному экземпляру [2; 7].
Микроклональное размножение в культуре изолированных тканей является хорошо разработанным и широко применяемым как в нашей стране, так и за рубежом методом прикладной биотехнологии. Оно имеет ряд преимуществ. Первым из них является получение генетически однородного посадочного материала. При этом воспроизведение такого материала может идти круглый год и не зависит от погодных условий. Вторым преимуществом является более высокий коэффициент размножения, позволяющий получить из одного растения тысячи клонов. Это особенно важно для редких и трудноразмножаемых форм растений. Транспортировка и хранение стерильных культур в стеклянной посуде более безопасны и удобны, чем манипуляции с растением, уже высаженным в почву [3; 6; 13].
Важным преимуществом микроклонального размножения является и возможность омоложения и оздоровления микропобегов, освобождения их от вирусов, грибков и других инфекций, т.к. задействуется здоровая образовательная ткань. Исследователи отмечают [5; 10; 17], что растения рода Rubus L. из всех ягодных культур средней полосы наиболее активно поражаются грибковыми и вирусными инфекциями, что делает это преимущество особенно актуальным.
При размножении садовых культур in vitro необходимо учитывать видовую и сортовую специфику растений. Для культивирования определенного вида, как правило, подходят не одна, а несколько питательных сред с разным набором регуляторов роста. Представители рода Rubus L., к которым относится малина красная, не требовательны к минеральному составу среды, что позволяет культивировать их на питательных средах по разным прописям [10; 13; 17].
Основной состав питательных сред для микроразмножения – это сбалансированный набор веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности растительного организма: в их состав входят макроэлементы, микроэлементы, источники железа и кальция, углеводы и витамины. Варьируя уровни этих питательных веществ, фитофизиологи Тошио Мурасиге и Фольке К. Скуг показали, что можно добиться усиления роста растений, а наибольшее влияние на рост культуры тканей оказывали соли азота [19].
Углеводы необходимы для жизни клетки как источник энергии и углеродных скелетов для биосинтеза органических веществ. В культуре изолированных тканей углевод нужен и как осмотический агент. Подбор углевода зависит от индивидуальных особенностей культивируемого растения, его происхождения. Наиболее часто используемый при культивировании углевод – сахароза, обычно применяемая в концентрации 2-5% (20-40 г/л). Иногда целесообразно проводить культивирование изолированных органов и тканей растений на питательной среде, содержащей не сахарозу, а другие источники углерода, в частности глюкозу и фруктозу [11; 13].
Биологически активные вещества, добавляемые в среду для культивирования – это витамины (миоинозитол, никотиновая кислота, пиридоксин, тиамин) и фитогормоны (ауксины, гиббереллины, цитокинины). Ауксины – производные индола и органических кислот – способствуют дифференциации и растяжению тканей, образованию корней, определяют адаптивные изгибы растения. Гиббереллины (гибберелловая кислота и ее производные, относящиеся к дитерпенам) ускоряют рост и развитие, активируя верхушечные и вставочные меристемы. Цитокинины являются производными аденина, они стимулируют деление растительных клеток, способствуют удержанию в них веществ, необходимых для роста и обновления тканей, тормозят старение, ускоряют развитие боковых почек и вызывают ветвление, снимая эффект апикального доминирования [13; 14; 16].
На питательную среду помещают участки растительных органов и тканей – экспланты, которые на ней начинают расти и дифференцироваться. Их целесообразно получать из меристематических тканей: апикальных меристем почек, каллюсных меристем, эксплантами могут быть также зародыши, цветочные зачатки и т.д. [10; 16 и др.].
После дифференциации растения высаживают в контейнеры со специально подготовленным, обычно стерильным, субстратом и помещают в специально оборудованных климокамерах или теплицах с регулируемой температурой и влажностью. Для успешной адаптации пробирочных растений водородный показатель (рН) субстрата не должен быть выше 7,0. Адаптация зависит от генотипических особенностей растений, однако известно, что она улучшается в осенне-зимний период [5; 17].
Таким образом, система приемов клонального микроразмножения позволяет ускорить процесс получения ценных форм посадочного материала, освободить ткани микропобегов от возбудителей заболеваний, провести их реювенилизацию (омоложение), повысить способность к вегетативному размножению. Значение этого интенсивного метода велико для ускоренного получения растений, а также для клоновой селекции вегетативно размножающихся видов, в частности, малины красной.
2. ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ МАЛИНЫ КРАСНОЙ
2.1. Методика проведения эксперимента
Исследование проводилось на базе лаборатории биотехнологии «Агрокуб» ТОГАОУ «Мичуринский лицей-интернат», оснащенной необходимыми помещениями: комната для приготовления питательных сред и посуды, оборудованная соответствующими инструментами, аналитическими весами, мойками, автоклавом, дистиллятором, сушильным шкафом; операционная с ламинарным боксом и хирургическими инструментами; комната с люминостатом и термостатом для выращивания полученных растений.
На подготовительном этапе исследования необходима стерилизация инструментов (скальпели, пинцеты, пластиковые наконечники для автоматических пипеток) и посуды (колбы, предназначенные для культивирования микропобегов, пробирки, чашки Петри). Чашки Петри, пробирки и наконечники пипеток автоклавируют, а хирургические инструменты стерилизуют в сухожаровом шкафу, чтобы избежать их преждевременного выхода из строя.
Микропобеги малины красной культивировали на минеральной основе питательной среды Мурасиге-Скуга (MS) c добавлением углевода в необходимой концентрации и 8 г/л агара. Среда была разработана в 1962 г. для выращивания культур растительных клеток, она содержит нитрат аммония, соли макроэлементов (CaCl2, MgSO4, КH2РО4, КNО3), микроэлементов (Н3ВО3, CuSO4, КІ, CoCl2, MnSO4, ZnSO4, Na2МoО4), набор органических веществ (витамины B1, B6, B8, PP, глицин) и хелатный комплекс натрия и железа (Na2Fe ЭДТА). Натрий-железная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты обычно добавляется в соотношении 5 мл/л для раствора, содержащего 5,57 г FeSO4 •7H2O и 7,45 г Na2ЭДТА (Трилон Б) на литр воды [19].
В нашем эксперименте содержание железа варьировалось (независимая переменная с тремя уровнями: ½ исходного содержания, обычная концентрация – контроль и удвоенный объем хелата железа). Второй независимой переменной в исследовании являлся углеводный компонент среды. Один из вариантов среды содержал сахарозу (контроль), второй – глюкозу и третий – по 50% глюкозы и сахарозы, сравнивались среды с концентрацией 20 г/л, 30 г/л и 40 г/л. Для быстрого растворения навесок сыпучих веществ и смешивания растворов использовались магнитные мешалки с подогревом.
Приготовление питательной среды для микроразмножения мы проводили в следующей последовательности. В мерном цилиндре в небольшом количестве воды растворяли необходимое количество углевода, добавляли макроэлементы – 100 мл/л, микроэлементы – 1 мл/л; хелат железа – в соответствии с исследуемым уровнем, полученный объем доводили до литра дистиллированной водой. Кислотность среды доводили до уровня pH 5,6-5,8, используя однонормальный раствор щелочи (NaOH), который добавляли по каплям, сверяясь с показаниями рН-метра. Затем по 4 г агара насыпали в плоскодонные колбы (0,5 л.), и разливали в них полученный 1 литр питательной следы. На колбах со средой маркером указали тип питательной среды. Каждую колбу закрывали фольгой и пергаментной бумагой и автоклавировали готовые среды в течение 30 минут.
На следующем этапе в условиях ламинар-бокса в предварительно расплавленный питательный раствор добавляются витамины и регуляторы роста. В нашем эксперименте добавлялась гибберелловая кислота (ГК) в концентрации 1 мг/л, ауксин – β-индолил-3-масляная кислота (ИМК) в концентрации 0,2 мг/л, а также цитокинин – 6-бензиламинопурин (6-БАП), уровень которого являлся третьей независимой переменной с вариантами 1 мг/л и 4 мг/л.
До посадки растительных эксплантов закрытые колбы с разлитой средой (70 мл среды на колбу объемом 250 мл) оставляют внутри ламинар-бокса. Для вычленения эксплантов (верхушечная часть побега с 2-3 узлами) и черенкования микропобегов используют хирургический скальпель и длинный пинцет, в опыте в каждую колбу сажали по 8 эксплантов.
На этапе укоренения микрочеренков концентрацию макросолей и углеводов снижали вдвое, и в среду добавляли ауксин ИМК в концентрации 0,2 (контроль) или 2,0 мг/л – таким образом, уровень дополнительно внесенного ауксина являлся четвертой независимой переменной. После проведения операций непосредственно в ламинар-боксе сосуды с микрорастениями переносят в культуральную комнату, оборудованную 4-ярусными стеллажами с люминостатом и термостатом. Субкультивирование побегов осуществляли в широкогорлых конических колбах емкостью 250 мл, закрытых алюминиевой фольгой. Растения культивировали при температуре воздуха 26 ± 2 ºC, освещенности 2000-2500 люкс и фотопериоде 16/8 часов.
Зависимыми переменными в опыте являлись коэффициент размножения (количество побегов на эксплант), длина побегов, частота укоренения и количество корней. Эксперимент проводился в двукратной повторности (всего 26 колб с растениями, по 8 на колбу), учет показателей роста и размножения вели еженедельно. Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли методами описательной статистики [8] в программной среде Microsoft Excel.
2.2. Обсуждение результатов микроразмножения малины красной
Как показали результаты эксперимента, железо оказалось важным компонентом минерального состава среды для малины красной (Рис. …)
Рис. …. Зависимость коэффициента размножения малины красной от минерального и гормонального состава среды.
Рис. …. Размножение малины красной на среде MS с ½Fe, МS и МS с 2Fe (слева-направо)
При удвоении содержания железа коэффициент размножения увеличился более чем в два раза, при повышенном содержании железа у этих культур формируются хорошо развитые побеги с крупными листьями темно-зеленого цвета, тогда как при пониженной концентрации железа формируются укороченные побеги с бледно-зелеными или желтоватыми листьями (Рис. …)
Рис. 3 Образование побегов более 1,5 см у малины красной при изменении минерального и гормонального состава среды размножения.
Существенным моментом, обеспечивающим длительное поддержание активно пролиферирующей культуры in vitro, является правильный выбор цитокинина и его концентрации. В нашем эксперименте повышение коэффициента размножения малины напрямую зависело от концентрации внесенного 6-БАП (Рис. …). При этом если повышение содержания железа способствовало удлинению побегов, то повышение концентрации 6-БАП компенсировало этот эффект, так как способствовало их разветвлению (снятию апикального доминирования) (Рис. …).
Рис. …. Влияние типа и концентрации углевода на коэффициент размножения и длину побегов малины красной.
Одним из важных компонентов любой питательной среды является источник углерода. Как показало наше исследование, хорошие результаты дает замена сахарозы на глюкозу при культивировании малины красной. На средах с глюкозой прослеживается как тенденция к увеличению коэффициента размножения побегов, так и тенденция к увеличению их длины. Увеличение концентрации с 20-30 до 40 г/л, хотя и не ведет к значительному снижению числа образовавшихся побегов, но существенно замедляет их рост (Рис. …).
Этап ризогенеза in vitro особенно важен, так как количественные и качественные показатели формирования корневой системы во многом определяют интенсивность развития растений при пересадке их в почву. Анализ интенсивности корнеобразования с учетом процента корнеобразования и числа корней на эксплант. В наших исследованиях была показана необходимость дополнительного применения ИМК на этапе ризогенеза. Эффективность ризогенеза полученных микрочеренков зависела от концентрации используемого ауксина.
Рис. …. Влияние концентрации ИМК на эффективность укоренения побегов малины красной.
Полученные укорененные микрорастения малины красной были адаптированы для выращивания в грунте.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Анализ литературы по проблеме размножения малины красной раскрывает необходимость дальнейшего поиска оптимальных технологий для производства посадочного материала этой культуры, обладающей ценными пищевыми и лекарственными свойствами. Технологией массового размножения здорового посадочного материала растений рода Rubus L. является технология микроклонального размножения в условиях in vitro.
При этом для эффективного микроразмножения малины важно действие таких факторов как минеральный и углеводный состав питательных сред, а также присутствие фитогормонов, таких как бензил-6-аминопурин, относящийся к группе цитокининов и бета-индолил-3-масляная кислота, относящаяся к группе ауксинов.
В ходе проведенного экспериментального исследования на базе лаборатории биотехнологии «Агрокуб» в ТОГАОУ «Мичуринский лицей-интернат» нами было установлены особенности микроклонального размножения малины красной на средах с различным содержанием железа, углеводов и фитогормонов. В результате сделаны следующие выводы:
1. Повышенное содержание железа положительно сказывается на интенсивности процессов органогенеза у эксплантов малины, однако для проявления этого влияния необходимо достаточное содержание цитокинина, такого как 6‑бензиламинопурин.
2. Для микроклонального размножения малины красной целесообразно использовать глюкозу в концентрации 20‑30 г/л, поскольку в таких концентрациях она обеспечивает максимум энергии для органогенеза и не ограничивает растяжение растущих клеток (в отличие от более высоких концентраций).
3. Этап ризогенеза особенно важен в процессе микроразмножения и должен проходить с добавлением дополнительных повышенных доз ауксина (ИМК), присутствие которого обеспечивает развитие и дифференциацию тканей эксплантов малины in vitro.
Таким образом эксперимент позволяет констатировать эффективность микроразмножения малины красной из апикальных меристем на среде MS с содержанием глюкозы в концентрации 20‑30 г/л и хелата железа в удвоенном объеме при условии внесения повышенных доз БАП (в концентрации 4 мг/л) на этапе высадки и дополнительных доз ИМК (в концентрации 2 мг/л) на этапе ризогенеза. Полученные укорененные микрорастения малины красной можно успешно адаптировать к условиям in vivo.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Абрикосов Х.Н. и др. Малина // Словарь‑справочник пчеловода / Сост. Федосов Н.Ф. – М.: Сельхозгиз, 1955. – С. 181.
Белокурова В.Б., Листван Е.В., Майстров П.Д., Сикура Й.Й., Глеба Ю.Ю. Кучук Н.В. Использование методов биотехнологии растений для сохранения и изучения биоразнообразия мировой флоры // Цитология и генетика. 2005. – №1. – С.41‑51.
Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе, 1999, М, ФБК‑ПРЕСС, 160 с.
Вехов В.Н. и др. Культурные растения СССР / Отв. ред. Т. А. Работнов. – М.: Мысль, 1978. – С. 144.
Вовк В.В., Заякин В.В., Нам И.Я., Казаков И.В. Клональное микроразмножение ремонтантных форм малины и подходы к разработке системы трансформации малины // Материалы межвузовской научно‑практической конференции Брянск, 1997. – С. 94‑96.
Высоцкий В.А. Некоторые итоги и перспективы использования методов культуры изолированных тканей и органов в садоводстве // История, современность и перспективы развития садоводства России: Матер. междунар. конф., Москва, 15‑17 ноября 2000 г. – М., 2000. – С. 163‑191.
Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение плодовых растений и декоративных кустарников // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве: Сб. научн. тр. ВНИИС им. И.В.Мичурина. – Мичуринск, 1989. – С. 3‑8.
Гмурман, В.Е. Теория вероятности и математическая статистика: учеб. пособие для ВТУЗов / В.Е. Гмурман. – М.: Высшая школа, 1977. – 479 с.
Губанов И.А. и др. Rubus idaeus L. – Малина обыкновенная, или лесная // Иллюстрированный определитель растений Средней России. В 3 т. – М., 2003. – Т. 2. Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные). – С. 406.
Киркач В.В. Совершенствование технологии размножения растений рода Rubus L. in vitro с применением физиологически активных веществ в малых и сверхмалых дозах. Дисс. … кандидата с.‑х. наук. Специальность: 06.01.08. – М., 2019. – 244 с.
Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. – М.: Высшая школа, 2003. – С. 65‑66. (479 с.)
Куликов И.М., Высоцкий В.А., Шипунова А.А. Биотехнологические приемы в садоводстве: экономические аспекты // Садоводство и виноградарство. – 2005. – №5. – С.24‑27.
Муратова С.А., Шорников Д.Г., Янковская М.Б. Размножение садовых культур in vitro: методические рекомендации. – РАСХН, ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина. Мичуринск-наукоград РФ, 2008. – 68 с.
Муромцев Г.С., Чкаников Д.П., Кулаева О.П. и др. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. – М.: Агропромиздат, 1987. – 383 с.
Лекарственные свойства сельскохозяйственных растений / Под ред. Борисова М.И. – Мн.: Ураджай, 1974. – С. 236.
Тимофеева О.А., Невмержицкая Ю.Ю. Клональное микроразмножение растений: Учеб.‑методич. пособие. – Казань, 2012. – 56 с.
Туровская Н.И., Стрыгина О.В. Микроклональное размножение малины // Садоводство и виноградарство. – 1990. – №8. – С. 26‑29.
Krivokapić S, Vlaović M, Damjanović VB, Perović A, Perović S. Biowaste as a Potential Source of Bioactive Compounds – A Case Study of Raspberry Fruit Pomace // Foods. – 2021. – 10(4). – 706. – 11 p. [Электронный ресурс: https://doi.org/10.3390/foods10040706]
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. – 1962. – V.15, № 95. – P. 473‑497.