XII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Синтез и исследование применимости новых флуоресцентных материалов на основе пиразолинового гетероцикла в качестве люминесцентного пенетранта
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Флуоресценция находит широкое применение в различных прикладных медицинских и биологических исследованиях. Непрерывное усовершенствование флуоресцентных методик, применимых в юриспруденции и криминалистике, стало объективной потребностью. Кроме того, происходит расширение сферы применения флуоресцентных веществ, которые уже сейчас прочно вошли в промышленное производство и сферу строительства. Столь широкое применение флуоресцентных веществ вызвало у меня живой интерес, когда я рассматривал предложенные темы конкурса Сириус.Лето. А возможность лично принять участие в работе над данной темой, так как проект предполагалось реализовывать на территории Самарской области в Тольяттинском государственном университете, стало определяющим фактором выбора мною этой темы. А дальше началось мое удивительное приключение в мир практической химии в целом, и люминесценции в частности.
Поскольку академический интерес к какому-либо виду исследований всегда прямо пропорционален развитию прикладного интереса, то исследований в этой области в настоящее время масса. За последние 5 лет в литературе описано свыше 250 000 научных статей о флуорофорах, влиянии условий, разновидности люминесценции и т.п. Однако задач, стоящих перед исследователями в области люминесценции, становится с каждым годом все больше. Поскольку возможность применения флуорофора определяется его химическими (растворимость, реакционная способность, стабильность) и фотофизическими (время жизни в возбужденном состоянии, коэффициент экстинкции, квантовый выход, максимум возбуждения, максимум излучения) свойствами, то сегодня требуется их постоянная модификация и усовершенствование. Одновременно, законы рыночной экономики диктуют нам жесткие условия конкурентоспособности как вновь получаемых флуорофоров, так и усовершенствование методик синтеза уже существующих. В настоящее время потребность различных отраслей хозяйства нашей страны (прежде всего это медицина и строительство) во флуороактивных веществах удовлетворяется за счет импорта, что создает дополнительную зависимость для дальнейшего развития данных областей от курса доллара.
Изучив предварительно материал об уже имеющихся флуорофолах, а также теоретический аспект механизма возникновения хемолюминисценции, я заметил, что любой флуорофол содержит бензольное ароматическое кольцо или несколько объединенных ароматических групп с гетероциклическим фрагментом, образуя сопряженную π – систему.
Это позволило мне предположить, что пиразолиновое ядро, содержащие сопряженные π-системы может являться источником высокоэффективных флуоресцентных пенетрантов.
Целью моей работы стал синтез новых гетероциклических материалов на основе винилацетиленовых скаффолдов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить литературу об основных характеристиках флуорофоров; подобрать наиболее оптимальный способ синтеза таких соединений из имеющихся в распоряжении Университета веществ.
2. Экспериментальным путем получить и идентифицировать полученные гетероциклы, определить наличие в них π – связей.
3. Проанализировать фотофизические свойства синтезированных веществ.
4. Изучить возможные области применения полученных соединений в качестве пенетрантов в люминесцентной дефектоскопии.
1. Литературный обзор
Флуоресценция - это физический процесс, который заключается в излучении веществом света в результате поглощения какого-либо внешнего не теплового излучения. Этот процесс является разновидностью люминесценции. В отличии от фосфоресценции флуоресценция характеризуется быстрым затуханием свечения после прекращения возбуждения.
Вещества, способные к процессу неоднократной флуоресценции называют флуорофорами. Механика флуоресценции заключается в переходе электронов в атомах флуорофоров под воздействием света в возбужденное состояние, дальнейшей релаксации и испускании излучения при возвращения электронов в обычное, невозбужденное состояние.
Флуорофоры, как и другие соединения делятся на органические и неорганические. К органическим флуорофорам можно отнести: флуоресцеин, экворин, зеленый флуоресцентные белки, хинин и др. В качестве неорганических флуорофоров используются комплексы органических и неорганических соединений - биоконъюгаты. Органический флуорофор передает свечение атомам неорганических веществ, и они сами начинают флуоресцировать.
Впервые исследование явления хемолюминесценции с использованием научных методов произвел Роберт Бойль. Им было установлено, что кислород оказывает стимулирующее влияния на хемилюминесценцию и более подробно изучил биохемилюминесценцию, как явление, сопровождающееся процессом медленного окисления.
Появившаяся до второй мировой войны фотографическая методика позволила другому ученому - Рене Одюберу обнаружить исключительно слабое УФ излучение от многих реакций: нейтрализация сильных кислот сильными щелочами, гидратация и дегидратация хининсульфата, ряд окислительно-восстановительных реакций. В 60-е годы 19 века стали широкодоступны высокочувствительные фотоэлектронные умножители, которые дали мощный толчок исследованиям свечения во многих химических реакциях, а также расширились возможности применения этого явления для практических задач. Большой вклад в развитие учения о люминесценции в нашей стране внесла школа академика С. И. Вавилова и школа академика А. Н. Теренина.
Исследования флуоресценции не потеряли своей актуальности и в 21 веке. Например, в 2007 г. профессором кафедры химии Университета Пердью в США Чэндэ Мао было опубликовано интересное исследование, посвященное методике получения многоцветных флуоресцентных углеродных наночастиц (CNP), полученных в результате сгорания копоти свечей [4]. Выделение этих частиц из сажи от горения свечей происходит с помощью окислительной кислотной обработки и их очистки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Улеродные точки имеют большой потенциал для применения, поскольку обладают биосовместимостью с человеческим организмом, а их получение намного проще и дешевле, чем синтез полупроводниковых квантовых точек. Более того, полученные наночастицы стабильны в течение нескольких месяцев в условиях окружающей среды и могут флуоресцировать в несколько цветов от одного светового источника.
Одним из наиболее известных веществ, способных к хемилюминесценции, является люминол. Роль люминола и других флуоресцентных веществ в биологическом анализе достаточно велика. Например, в работе [6] описывается, что выявлено усиление интенсивности хемилюминесценции LH2 и его производных было при щелочном pH в присутствии природных циклодекстринов. Уникальное свойство циклодекстрина делает его потенциальным кандидатом в качестве чрезвычайно эффективных молекулярных носителей для доставки лекарств.
Большую популярность и значимость в последнее время приобрели исследования в области ближней инфракрасной флуоресценции (NIR-флуоресценции), используемой в медицине, особенно в онкологической хирургии.
Разрабатываются методы флуоресцентной диагностики на живой ткани. Так, например, учеными были созданы флуоресцентные зонды, избирательно окрашивающие злокачественные опухоли и помогающие обнаруживать их во время томографии или эндоскопического обследования, и даже проводить хирургические операции [6,7]. С помощью флуоресценции делают иммуноферментные анализы: на гепатиты, герпес, ВИЧ и т.д.
Последние два десятилетия характеризуются особенно бурным ростом всех областей научных знаний, что в свою очередь ведет к стремительному технологическому прогрессу в разных сферах хозяйственной деятельности человека. Методы флуоресцентного анализа сегодня применяют, чтобы обнаружить некоторые составляющие компоненты биологических структур. Например, данный метод может применяться для обнаружения биопленки, состоящей из диатомовых водорослей, на стенках медных или пропиленовых труб [9].
Широкое применение флуорофоры находят в изготовлении красок и красящих пигментов. Флуоресцентные вещества позволяют получать яркие, необычные цвета. Причина этого состоит в том, что флуоресцентные пигменты способны "преобразовывать" ультрафиолет внешних источников (естественной и искусственной природы) в излучение определенного спектра, которому соответствуют специфические цвета [5]. Примером такого красителя является оптическая синька.
2. Экспериментальная часть
2.1. Синтез пиразолиновых гетероциклов
Любой синтез зависит от структуры молекул исходных веществ. Учитывая данное обстоятельство, синтез случайного набора веществ может занять многие годы. Поэтому я отдал предпочтение синтезу на основе наиболее перспективных «каркасов», определенных совместно с моим научным руководителем с применением компьютерного моделирования и на основе его опыта в данной области исследования. В качестве исходных соединений для синтеза были применены известные винилацетиленовые кетоны.
Контроль хода реакций осуществлялся мною с применением тонкослойной хроматографии на коммерческих пластинах с силикагелем фирмы Sorbfil (подвижная фаза состояла из растворителей этилацетат-петролейный эфир), пластины проявлялись с помощью камеры с парами йода.
В рамках проделанной работы мне удалось синтезировать несколько новых, ранее не описанных в литературе, гетероциклических флуоресцентных 3-(фенил)-1-фенил-5-(фенилэтинил)-4,5-дигидро-1H-пиразолинов. Схемы синтезов не приводятся в связи с дальнейшими планами публикации результатов в научных журналах.
Наиболее эффективными с точки зрения флуоресценции оказались следующие:
Ввиду длинной химической формулы данных веществ, решено было дать им условные названия - F1 и F4.
Рисунок 2.1. Флуоресценция соединений F1 (слева) и F4 (справа).
2.2. Исследование спектральных характеристик полученных соединений
После визуального исследования полученных веществ и отбора двух, обладающих наибольшей флуоресценцией, интенсивность флуоресценции была проанализирована с помощью молекулярной флуоресцентной спектроскопии.
С этой целью мною были подготовлены спиртовые растворы в этаноле для каждого вещества с примерно одинаковой концентрацией (~ 10-4 моль/л). Спектры поглощения растворов были сняты на спектрофотометре модель UNICO-2100 в кварцевых кюветах (не поглощающих УФ-излучение). Спектры флуоресценции измеряли на приборе Shimadzu RF-6000 в диапазоне 300–650 нм с использованием кварцевых кювет с длиной пути 1 см и спектральной щелью монохроматора 5 нм.
Результаты проведенного исследования отображены в таблице 2.1
Таблица 2.1. Фотофизические характеристики синтезированных соединений.
|
Соединение |
λabs, НМ |
λem, НМ |
νss, НМ |
|
F4 |
340 |
391 |
51 |
|
F1 |
342 |
401 |
59 |
На графиках 2.1-2.2 представлены зависимости поглощения (синий цвет) и флуоресценции (красный цвет) от длины волны.
График 2.1. Спектр флуоресценции/поглощения соединения F1
График 2.2. Спектр флуоресценции/поглощения соединения F4
Из графиков 2.1 и 2.2. можно отметить симметричность спектров поглощения и флуоресценции и высокие значения флуоресценции, что соответствует высоким значениям молярной экстинкции при заданной длине волны.
2.2. ИК-спектроскопия
В дальнейшем с целью подтверждения структуры соединений был использован метод ИК-спектроскопии. Подготовленные мною для ИК-спектрального анализа раствор CHCl3 и в таблетка KBr с синтезированными веществами, совместно с научным руководителем были исследованы на Фурье-спектрометре ФСМ-1201 в диапазоне 4000–400 см–1.
График 2.3. ИК-спектр соединения F1
В ИК спектре соединений сигнал углеродных атомов группы C=N, по-видимому, ядра пиразолина лежат в области 1590 см–1 . Отсутствует полоса карбонильной связи в области 1600 см–1 в случае соединений F1 и F4. Слабые сигналы тройной связи С≡С в районе 2200 см–1 показывают, что во всех молекулах содержатся тройная связь.
3. Практическое применение полученных соединений
3.1. Люминесцентная дефектоскопия
Люминесцентная дефектоскопия - один из методов для определения дефектов на рабочих поверхностях (например, сварочные швы труб, металлические поверхности и др.). Принцип работы этого способа заключается в капиллярном проникновении детектирующего вещества (пенетранта) в микроскопические дефекты на поверхности изделия с последующим детектированием областей распределения пенетранта. В рамках эксперимента я наносил полученный раствор на поверхность, содержащую микродефекты (были использованы пластинки из алюминия с искусственно нанесенными повреждениями).
Результаты испытаний представлены на рисунке 3.1. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что полученные соединения могут быть использованы в качестве пенетрантов в люминесцентной дефектоскопии.
Рисунок 3.1. Люминесцентная дефектоскопия на алюминиевой поверхности. Слева - F4, справа - контрольный образец, без флуоресцентных меток.
3.2. Анализ ПАВ
Важным аспектом при применении веществ в качестве пенетрантов является наличие поверхностной активности - то, насколько эффективно вещества способны проникать в поры. Один из самых простых и легко интерпретируемых методов является метод максимального давления в пузырьке или Метод Ребиндера.
Данные метод используется для расчета поверхностного натяжения на границе раздела фаз раствор — воздух. Схема прибора представлена на рисунке 3.2.
Рисунок 3.2. Установка для измерения поверхностного натяжения.
1 — пробирка с исследуемой жидкостью; 2 — капиллярная трубка сообщающаяся с атмосферным воздухом; 3 — сосуд с водой, плотно закрытый пробкой; 4 — кран для слива воды; 5 — микроманометр
В исследуемый раствор опускается капилляр, касается мениска исследуемой жидкости. Другим концом капилляр сообщается с атмосферным воздухом. Давление над раствором постепенно уменьшают путем водяного насоса. Под действием давления образуется воздушный пузырек. Зная поверхностное натяжение жидкости принятой за стандарт и определяя экспериментально высоты столбов жидкости в манометре можно рассчитать поверхностное натяжение продукта.
Мною было исследовано поверхностное натяжение умеренно концентрированных спиртовых раствора F1 методом максимального давления в пузырьке.
График 3.1. Зависимость поверхностного натяжения σ (10-3 Н/м) от концентрации исследуемого раствора (%).
Исходя из представленных данных можно сделать вывод, что данный пиразолин действительно обладает поверхностным натяжением, что делает его перспективным для разработки в качестве эффективного люминесцентного пенетранта.
Выводы
Подводя итог, прежде всего хочу обозначить достижения в ходе работы над данным проектом лично для меня: мне удалось не просто получить новые знания по химии, но расширить свой кругозор в плане ее практического применения в десятки, а может даже в сотни раз! Уроки химии в школе стали для меня значительно интереснее.
Получив колоссальный багаж новых знаний в исследуемой области, мне удалось по результатам проведённых экспериментов подтвердить гипотезу моего проекта: вещество с несколькими ароматическими группами или несколькими сопряженными π – связями может быть флуорофором с большой долей вероятности. Способность испускать свет зависит от строения вещества, внешнего окружения и ряда других факторов.
В результате проведенных синтезов были получены два новых гетероциклических соединений, содержащих пиразолиновый фрагмент и являющихся флуоресцентными соединениями.
Растворы полученных соединений обладают полезной фотофизической активностью. Оптимальные значения флуоресценции свидетельствуют о высоком значении коэффициента экстинкции для данного вещества.
Для полученных соединений мною были проведены испытания в качестве пенетрантов для дефектоскопии. Установлено, что растворы веществ способны проникать в микроскопические дефекты металлических поверхностей и быть в дальнейшем обнаруженными под действием УФ-излучения. Это позволяет сделать вывод, что данные соединения могут служить в качестве поверхностно активных веществ, так как в их растворах наблюдается снижение значения поверхностного натяжения.
Дальнейшая моя работа по исследованию синтезированных соединений будет проводится на предмет изучения их биологической активности и цитотоксичности.
Список литературы
Choi, H. S. (2013). Targeted zwitterionic near-infrared fluorophores for improved optical imaging. Nat. Biotechnol , 148-153.
David F.Roswell, Emil H.Wite (1978) The Chemoluminescence Of Luminol and Related Hydrazides, The Journal Methods in Enzymology, 409-423
Haipeng Liu, T. Y. (2007). Fluorescent Carbon Nanoparticles Derived from Candle Soot. Angewandte Chemie , 46.
Madhukar N. Jachak, Sandeep M. Bagul, Bhausaheb K. Ghotekar, Raghunath B. Toche (2009) Synthesis and study of the fluorescent behavior of 3-pyridinecarbonitriles, The Journal Monatsh Chem, 655-662
Mitra, N. S. (2011). Luminol Fluorescence Quenching in Biomimicking Environments: Sequestration of Fluorophore in Hydrophobic Domain. The jornal of Phisical chemistry , 10163–10172.
N. Shaemningwar Moyon and Sivaprasad Mitra (2011) Luminol Fluorescence Quenching in Biomimicking Environments:Sequestration of Fluorophore in Hydrophobic Domain. The The Journal Physical Chemistry, 10163-10172
J T Walker a , D Wagner b , W Fischer b & C W Keevil (1994) Rapid detection of biofilm on corroded copper pipes. The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research, 55-63.
Р.Ф. Васильев «Химическое свечение»- журнал Химия и Химики № 1 (2010), 5-62.
Медведев Е.А. Классификация флуоресцентных органических соединений // International scientific review. – 2016. - No12.
Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии // пер. с англ. - М.: Мир. – 1986
Уэйн Р., Основы и применения фотохимии // пер. с англ. – М.: Мир. - 1991
Гуревич П.А., Сатарова Л.Ф., Струнин Б.П. Введение в химию биологически активных соединений. Казань: Изд-во КГТУ, 2008. 108 с.