Управление синтезом АТФ в клетках бактерий E.coli путем изменения индукции магнитных полей и концентрации изотопа иона 25Mg2+

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Коркин М.А. 1

---

1ФГКОУ Оренбургское ПКУ

Мушин Ф.Ю. 1Мартынова А.Н. 1

---

1ФГКОУ Оренбургское ПКУ

Работа в формате PDF

1.1 MB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителяСвидетельство руководителя

Введение

Учебно-боевая деятельность военнослужащих является одной из наиболее энергозатратных. По данным ученых расход энергии солдат при гарнизонной службе составляет 3500-3900 ккал, а во время учений доходит до 4200 ккал в сутки [4].

В организме человека источником энергии являются сложные органические соединения потенциальная химическая энергия которых в процессе обмена веществ превращается в другие виды энергии. Совершая движение, человек расходует механическую энергию, передает ее другим телам (например, метание гранаты, оборудование укрытий), тепловая энергия передается окружающей среде путем теплопроводности или излучения и т.д.

В тридцатые–пятидесятые годы прошлого столетия было установлено, что химическая энергия пищевых субстратов переводится в химическую энергию связей неорганического фосфата (Н₃РО₄) в составе молекул аденозинтрифосфата (АТФ), аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинмонофосфата (АМФ) и используется для обеспечения элементарных процессов в клетке при гидролизе фосфатных связей, что процесс образования этих связей (фосфорилирование) сопряжён с реакциями окисления сахаров в клетках животных и бактерий, а также с процессом утилизации световой энергии в растениях и водорослях [3]. Таким образом, АТФ является основным источником и аккумулятором энергии в клетке.

Изучение внешних и внутренних факторов, способных изменять концентрацию АТФ в клетках, а также физико-химических механизмов управления ее синтезом – задача, решение которой открывает новые возможности в регуляции интенсивности обменных и регенеративных процессов, повышении физиологических резервов, адаптационного потенциала, работоспособности и выносливости военнослужащих при экстремальных видах деятельности.

Цель исследования: изучение возможностей управления внутриклеточным синтезом АТФ.

Задачи:

Изучить возможности проявления магнитно-изотопных эффектов в живых клетках и создать установку для проведения эксперимента по управлению синтезом АТФ.

Смоделировать условия регистрации проявления магнитно-полевых эффектов на синтез АТФ (определить диапазон индукции магнитных полей и оптимальное расстояние до объекта).

Изучить влияние внешнего магнитного поля и концентрации изотопа иона ²⁵Mg²⁺ на синтез АТФ в клетках бактерий E. сoli.

Объект исследования: бактерии E. сoli (модельный организм, факультативный анаэроб, способный синтезировать АТФ как в результате гликолиза, так и клеточного дыхания).

Предмет исследования: влияние внешнего магнитного поля и концентрации изотопа иона ²⁵Mg²⁺ на синтез АТФ в клетках бактерий E. сoli.

Методы исследования: теоретические (анализ статей, изучение теоретических моделей); эмпирические (наблюдение, сравнение, измерение, эксперимент, моделирование).

1. Теоретическое обоснование возможности управления синтезом АТФ

1.1. Функции, структура и механизм образования АТФ

Все проявления жизнедеятельности, все функции клетки осуществляются с затратой энергии. Энергия требуется для движения, биосинтетических реакций, переноса веществ через клеточные мембраны, для любых форм клеточной активности. Источником энергии в живых клетках, обеспечивающим все виды их деятельности, является аденозинтрифосфорная кислота (АТФ).

Значение этого соединения в живых организмах трудно переоценить. Аденозинтрифосфат необходим для мышечного сокращения, переваривания и усвоения пищи, химического превращения (метаболизма) веществ в организме, синтеза нуклеиновых кислот и белков, проводимости нервных импульсов, синтеза нейромедиаторов, ответственных за память, мышление и эмоции, деления и роста клеток, функционирования иммунной системы, зрения, свёртывания крови и заживление ран, а также множества других процессов.

Количество АТФ колеблется и в среднем составляет 0,04% (на сырую массу клетки). Наибольшее количество АТФ содержится в скелетных мышцах 0,2–0,5%, [4].

По химической структуре АТФ является нуклеотидом, и, как у всякого нуклеотида, в ней имеются азотистое основание (аденин), углевод (рибоза) и остаток фосфорной кислоты. Однако в отличие от обычных нуклеотидов, в АТФ не один, а три остатка фосфорной кислоты (рисунок 1). Это очень неустойчивая структура, поэтому под влиянием фермента в АТФ самопроизвольно и значительно быстрее разрывается связь между Р и О и к освободившимся связям присоединяется одна или две молекулы воды, причем могут отщепляться один или два остатка фосфорной кислоты [4].

Если отщепляется одна молекула фосфорной кислоты, то АТФ переходит в АДФ, т. е. в аденозиндифосфорную кислоту. Если отщепляются две молекулы фосфорной кислоты, то АТФ переходит в АМФ, т.е. в аденозинмонофосфорную кислоту. Реакция отщепления каждой молекулы фосфорной кислоты от АТФ сопровождается большим энергетическим эффектом, а именно на отщепление одной грамм-молекулы фосфорной кислоты затрачивается 30,6 кДж/моль (7,3 ккал/моль). Все другие экзотермические реакции клетки сопровождаются значительно меньшим выходом энергии. Самые эффективные из них дают не более 8 кДж. Чтобы подчеркнуть такую особенно высокую энергетическую эффективность фосфорнокислородной связи в АТФ, ее называют макроэргической связью [2].

Синтезом АТФ в клетках управляет АТФ-синтаза - универсальный фермент, присутствующий как в клетках прокариот, так и эукариот (рисунок 2).

Рис. 2. Схема АТФ-синтазы в плазматической мембране бактерий

А ТФ-синтаза представляет собой роторную электромеханохимическую молекулярную машину, которая преобразует электрический потенциал, создаваемый протонным градиентом на мембране, в механическое движение асимметричного ротора АТФ-синтазы. Ротор при вращении последовательно сжимает участки белковой макромолекулы фермента (статора), в которых находятся каталитические сайты, где осуществляется синтез АТФ. Протонный градиент, который приводит в движение ротор, создается переносом электронов от окисляемого субстрата по цепи дыхательных ферментов к кислороду, и потому этот тип синтеза АТФ называют окислительным фосфорилированием.

Работа АТФ-синтазы зависит от двухзарядных ионов магния Mg²⁺, который стимулирует синтез новой, дополнительной химической связи Р-О.

1.2. Обзор теоретических исследований влияния слабых магнитных полей и ионов магния на внутриклеточные реакции

Идея заменить в реакциях синтеза АТФ ионы магния природного состава (79% ²⁴Mg, 10% ²⁵Mg, 11 % ²⁶Mg) чистыми изотопными формами ²⁴Mg²⁺, ²⁵Mg²⁺, ²⁶Mg²⁺ впервые использована академиком Российской академии наук Анатолием Леонидовичем Бучаченко. В результате проведенных им экспериментов был обнаружен необычный изотопный эффект: скорость синтеза АТФ была одинакова для ²⁴Mg²⁺ и ²⁶Mg²⁺, но активность ферментов с ионами ²⁵Mg²⁺ в каталитических сайтах была почти вдвое выше [1].

Влияние магнитного поля на ферментативный синтез АТФ было изучено доктором физико-математических наук Виталием Львовичем Бердинским. Проведенные им эксперименты показали, что внутриклеточная концентрация АТФ в клетках Escherichia coli увеличивается в 3,5 раза после одного часа воздействия статического магнитного поля (17 мТл).

Совместное действие изотопа иона магния ²⁵Mg²⁺ и магнитных полей было обнаружено в АТФ-пуле бактерий E. coli в диапазоне от 70 до 98 мТл [8].Внутриклеточная концентрация АТФ увеличивается в 2-3 раза в этих полях для бактерий, обогащенных магнитным изотопом магния ²⁵Mg. Интересно, что даже 10%-ное обогащение питательной среды магнитным изотопом ²⁵Mg (это содержание магнитного изотопа в природном магнии) позволяет регистрировать увеличение концентрации АТФ.

По данным Ульяны Григорьевны Лутуты наиболее выраженными являются эффекты магнитного поля, полученные в диапазоне 0-10 мТл [8].

Доказательством совместного влияния изотопа иона магния и магнитных полей является то, что в экспериментах бактерии E. coli, культивируемые без внешнего постоянного магнитного поля, образовывали биоплёнки лучше при культивировании на среде с магнитным изотопом ²⁵Mg.

2. Экспериментальные исследования влияния магнитных изотопов на синтез АТФ в клетках бактерий E. coli

2.1. Материалы и оборудование

С целью изучения влияния внешнего магнитного поля и концентрации изотопа иона ²⁵Mg²⁺ на синтез АТФ в клетках бактерий E. coli, была разработана установка (рисунок 4), представляющая собой совмещенные луночные планшеты, с возможностью помещения исследуемого объекта в верхние ячейки с различной концентрацией изотопов иона ²⁵Mg²⁺ и возможностью варьирования количества магнитов в нижних лунках.

В качестве источников магнитных полей использовались неодимовые магниты кубической и шарообразной конфигурации.

Регистрация магнитных полей осуществлялась портативным универсальным миллитесламетром ТП2-2У, допускающего наблюдение формы переменного и импульсного магнитного поля в диапазонах измерений магнитной индукции – от 0,1 до 1999 мТл на пределах измерений 20, 200 и 2000 мТл, при подключении осцилографа к аналоговому выходу.

Для экспериментов использовался музейный штамм Escherichia coli, который предварительно инкубировался при температуре 37ͦ С в питательном бульоне LB (богатая питательными веществами среда, разработанная Ленноксом для роста и поддержания рекомбинанных штаммов E. coli).

Плотность посевной культуры E.coli определялась фотометрически с помощью спектрофлуориметра «СОЛАР» СМ 2203, обеспечивающего высокочувствительные и стабильные измерения в видимой области спектра. В качестве контроля использовалась кювета с питательной средой LB.

Измерение концентрации АТФ проводили на люминометре «Люм-1» (высокочувствительном приборе для регистрации биолюминесценции в видимой области спектра - слабых оптических свечений, возникающих в живых организмах и биохимических реакциях) с использованием набора реактивов «Люмтек» (рисунок 5). Интенсивность полученного биолюминесцентного сигнала сравнивалась с интенсивностью сигнала АТФ-контроля.

Чувствительность люминометра «Люм-1» к квантам света в диапазоне длин волн от 400 нм до 600 нм соответствует не менее 20%, чувствительность обнаружения АТФ (при использовании АТФ-реагента, ТУ 2639-001-17919612-2002) составляет 0,005 пикомоль/мл раствора.

Рис. 5. Оборудование для определения концентрации АТФ в растворе

2.2. Моделирование магнитных полей

Учитывая, что особый интерес представляют слабые магнитные поля, соизмеримые с магнитным полем Земли, и, опираясь на данные научных исследований, мы определили, что оптимальный диапазон наблюдения за воздействие магнитного поля на ферментативные процессы синтеза АТФ в клетках бактерий E. coli составляет 0-10 мТл.

Рис. 6. Дистанционная зависимость индукции магнитного поля для магнитов различной конфигурации

Варьируя количество магнитов в нижнем планшете установки для изучения магнитно-изотопных явлений в клетках E. coli (рисунок 4), их форму и расстояние до лунок верхней планшеты мы смогли смоделировать слабые магнитные поля, необходимые для управления внутриклеточным синтезом АТФ.

Экспериментальные кривые дистанционной зависимости индукции магнитного поля (рисунок 6) позволяют увидеть, что величина индукции магнитного поля зависит: обратно от расстояния, количества магнитов и их конфигурации. Наибольшее значение индукции магнитного поля соответствуют кубической конфигурации магнита, наименьшее – сферической, данные приведены в приложении 1.

После размещения магнитов в лунки, используя полученные дистанционные зависимости, мы определили наиболее оптимальное расстояние между планшетами (10-11 мм).

2.3. Изучение влияния внешнего магнитного поля и концентрации изотопа иона ²⁵Mg²⁺ на синтез АТФ в клетках бактерий E. coli

Культура Escherichia coli одинаковой оптической плотности D=0,6 отн. ед. помещалась в ячейки верхнего планшета, содержащие изотопы магния ²⁵Mg²⁺. В качестве контроля использовалась культура бактерий с природным содержанием изотопов магния.

Рис. 7. Схема эксперимента по изучению влияния внешнего магнитного поля и концентрации изотопа иона ²⁵Mg²⁺ на синтез АТФ в клетках бактерий E. coli

Культуры бактерий в лунках верхнего планшета подвергались воздействию постоянного магнитного поля, создаваемого магнитами нижней планшеты (рисунок 7). Установка выдерживалась в течение 7 часов при постоянном термостатировании (37 °С).

На основании полученных данных (приложение 2) с помощью программного пакта Origin, была построена карта луночной концентрации внутриклеточного содержания АТФ в бактериях Е.сoli (рисунок 8).

На контурной карте хорошо видно, что в отсутствие магнитных полей в концентрационном диапазоне ²⁵Mg²⁺ 15-25*10^-8 моль/л наблюдается увеличение синтеза АТФ в 1,52 раза, что говорит о влиянии ионов ²⁵Mg²⁺ на внутриклеточное накопление АТФ. Таким образом, клетки E. coli, обогащенные магнитным изотопом ²⁵Mg²⁺, быстрее адаптируются к новой среде и синтезируют значительно больше молекул АТФ по сравнению с клетками, не обогащенными магнитными изотопами.

Рис. 8. Поверхность луночной концентрации внутриклеточного содержания АТФ в бактериях Е. сoli в зависимости от индукции внешнего магнитного поля (ось y) и концентрации изотопа иона ²⁵Mg²⁺⁽ось x)

Без добавления изотопа ²⁵Mg²⁺ проявляется влияние магнитного поля в диапазоне 6-8 мТл, увеличивая концентрацию АТФ примерно в 1,53 раза. Что подтверждает стимулирующее действие магнитного поля на синтез АТФ в клетках E. coli. Оптимальный индукционный диапазон воздействия на ферментативные процессы составляет 0-10 мТл.

Совместное действие изотопов магния и магнитных полей в концентрационном диапазоне 20-30*10^-8 моль/л и индукционном 6-7 мТл приводит к увеличению концентрации АТФ в клетках E. coli в 2,5 раза. Данные эксперимента позволяют прийти к выводу о совместном влиянии концентрации изотопов ²⁵Mg²⁺ и величины индукции магнитного поля на синтез АТФ в прокариотических клетках.

Заключение

Учебно-боевая деятельность военнослужащих является одной из наиболее энергозатратных. Основным источником и аккумулятором энергии в клетках тела является молекула АТФ.

Энергетическая функция АТФ обусловлена наличием двух высокоэнергетических связей между остатками фосфорной кислоты, гидролиз каждой из которых приводит к выделению, по различным данным, от 40 до 60 кДж/моль энергии, использующейся организмом для выработки тепла, мышечных сокращений, проведения нервного импульса и других важнейших биохимических и физиологических процессов.

Изучение внешних и внутренних факторов, способных изменять концентрацию АТФ в клетках, а также физико-химических механизмов управления ее синтезом – одна из важнейших задач современной биофизики. Этой проблеме посвящены работы отечественных ученых А.Л.Бучаченко, В.Л.Бердинского и У.Г.Летуты.

На основе анализа результатов научных исследований и экспериментальных данных была сконструирована и апробирована установка, позволяющая моделировать условия эксперимента по управлению синтезом АТФ при варьировании величины индукции магнитного поля и концентрации ионов магния.

Анализ экспериментальных данных демонстрирует стимулирующее действие на внутриклеточный синтез АТФ как концентрации ионов ²⁵Mg²⁺ (15-25*10-8 моль/л) в отсутствии магнитных полей, так и магнитных полей (6-8 мТл) без дополнительного внесения ²⁵Mg²⁺. И в том и в другом случае можно добиться повышения концентрации АТФ в клетках E. coli примерно в 1,5 раза. Оптимальный индукционный диапазон воздействия на ферментативные процессы составляет 0-10 мТл. Совместное действие изотопов магния и магнитных полей в концентрационном диапазоне 20-30*10-8 моль/л и индукционном 6-7 мТл приводит к увеличению концентрации в 2,5 раза синтеза АТФ в клетках E. coli.

Данные эксперимента позволяют прийти к выводу о возможности управления ферментативным синтезом АТФ в прокариотических клетках путем изменения концентрации изотопов ²⁵Mg²⁺ и индукции магнитных полей, как отдельно, так и в сочетании.

Дальнейшие исследования могут быть связаны с управлением синтезом АТФ в эукариотических клетках. Это раскрывает новые возможности регуляции интенсивности обменных и регенеративных процессов в организме человека, в частности, повышения работоспособности и выносливости военнослужащих.

Список использованных источников

Бучаченко А. Л., Кузнецов Д. А. Ядерно-магнитное управление синтезом энергоносителей в живых организмах. Вестник российской академии наук, 2008, том 78, № 7, с. 579-583

Трухан Э. М. Введение в биофизику: Учебное пособие / Э. М. Трухан – М.: МФТИ, 2008 – 242 с.

Шилина М. В. Биофизика: курс лекций / М. В. Шилина – Витебск: ВГУ имени П. М. Машерова, 2012. – Ч.1: Предмет биофизики. История развития биофизики. Термодинамика. Биоэнергетика. – 50 с.

Пугаев Э.М. Биоэнергетические свойства изотопа магния-25 и перспективы его использования в вооруженных силах / Э.М. Пугаев, В. А. Майдан – Вестник Российской Военно-медицинской Академии им. С. М. Кирова, г. Санкт-Петербург, Россия 2018.

Макеев В. А. Основы биологии / В. А. Макаев – М.: МФТИ, 1997 – 234 с.

Скулачев В.П. Законы биоэнергетики / В. П. Скулачев - СОЖ 1997, № 1, с. 9-14.

Виноградов А.Д. Преобразование энергии в митохондриях / А. Д. Виноградов - СОЖ 1999, № 9, с.

Летута У. Г. Влияние магнитных полей и магнитного изотопа ²⁵Mg на образование биоплёнок бактериями E. Coli / У. Г. Летута, Т. А. Тихонова - Доклады Академии Наук, 2019, том 484, № 6, с. 768–771

Летута У. Г. Магнитно-полевые эффекты в бактериях E. Coli в присутствии изотопов Mg / У. Г Летута, Е. И Авдеева, В. Л Бердинский - Известия Академии наук. Серия химическая, 2014

Приложение 1

Экспериментальные данные, полученные при измерении дистанционной зависимости индукции магнитного поля для магнитов различной конфигурации

Приложение 2

Экспериментальные данные, полученные при измерении луночной концентрации внутриклеточного содержания АТФ в бактериях Е. сoli