XV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Изучение эффективности применения метода биотестирования для определения уровня общей токсичности микотоксинов

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Филатова К.А. 1

---

1Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение «Средняя общеобразовательная школа №1 г. Строитель Яковлевского городского округа» МБОУ "СОШ №1г. Строитель"

Меремьянина Т.Г. 1

---

1Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение «Средняя общеобразовательная школа №1 г. Строитель Яковлевского городского округа»

Работа в формате PDF

561.7 KB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

ВВЕДЕНИЕ

По некоторым оценкам, ежегодные мировые потери продукции сельского хозяйства, за счет грибкового заражения и загрязнения микотоксинами, составлет более 15 млрд. долларов, а более миллиарда тонн продукции ежегодно подвергается опасности загрязнения [3]. В России зараженность семян зерновых культур грибками может приводить к потере до 25% урожая и снижению всхожести семян на 35% [19].

Микотоксины распространены повсеместно, они способны поражать пищевые продукты на любом этапе производства, транспортировки и хранения, что делает проблему загрязнения микотоксинами чрезвычайно актуальной.

Актуальность исследования обусловлена необходимостью разработки простых способов выявления микотоксинов, так как большинство из них обладают цитотоксичными, иммунодепрессивными, мутагенными свойствами и являются серьезным фактором риска для здоровья сельскохозяйственных животных и человека [13].

Гипотеза исследования - использование методов биотестирования значительно проще, чем применение углубленных сложных методов, они пригодны для широкого применения.

Цель работы – определение уровня токсичности трихоцетеновых микотоксинов, в частности Т-2 токсина, методами биотестирования.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. изучить литературу о методе биотестировании, как способе установления токсичности среды, познакомиться с различными видами микотоксинов и их влиянии на живые организмы;

2. Определить уровень токсичности Т-2 токсина на семенах тыквенных в процессе роста боковых корней у проростков огурца.

Предметом исследования стало изучение влияние растворов Т-2 токсина разных концентраций на ростовые процессы семян огурцов.

Объектом исследования были семена огурца сорта «Феникс», производства ООО «Агрофирма ПОИСК». Партия семян выполнена по ГОСТ Р 52171-03, что позволяет с большой уверенностью говорить о пригодности семян к посеву.

Методы исследования включали в себя приготовление растворов определенной концентрации и постановку лабораторного опыта.

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биотестирование – метод установления токсичности среды

Биотестирование – это метод установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест–объектов [8].

Для оценки параметров среды используются стандартизованные реакции живых организмов (отдельных органов, тканей, клеток или молекул). В организме, пребывающем контрольное время в условиях загрязнения, происходят изменения физиологических, биохимических, генетических, морфологических или иммунных систем [9]. Объект извлекается из среды обитания, и в лабораторных условиях проводитсяjнеобходимый анализ.

Более коротко, биотестированием называют частный случай биоиндикации, когда у свободно живущих организмов, находящихся в стандартизованных условиях, исследуются повреждения или отклонения от нормы, вызванные воздействием неблагоприятных факторов (токсических веществ) [16].

Предоставляя мало информации о природе токсического агента, биотестирование дает возможность с большой достоверностью определять степень общей токсичности объекта исследований [10, 15, 17]. Методы биотестирования отличаются высокой чувствительностью и позволяют определять токсические вещества в концентрации до 10^-8%. Объектом исследований может быть любой объекты внешнейrсреды (вода, почва), отходы промышленного производства и т.д. [8].

В качестве тест-объектов используют представителей основных трофических звеньев водной экосистемы: бактерии, водоросли, простейшие, ракообразные, рыбы [16].

Биоиндикация предусматривает выявление уже состоявшегося или накапливающегося загрязнения по индикаторным видам живых организмов и экологическим характеристикам сообществ организмов [15].

Для решения комплекса современных задач, методы биотестирования, используемые для оценки среды, должны соответствовать следующим требованиям:

быть применимыми для оценки любых экологическихeизменений среды обитания живых организмов; характеризовать наиболее общие и важные параметры жизнедеятельности биоты;

быть достаточно чувствительными для выявления даже начальных обратимых экологических изменений;

быть адекватными для любого вида живых существ и любого типа воздействия; быть удобными не только для лабораторного моделирования, но также и для исследований в природе;

быть достаточно простыми и не слишком дорогостоящими для широкого использования [8, 12].

Перспективными для оценки негативных стрессовых воздействий являются темп и ритмика ростовых процессов. Методы биотестирования этих процессов просты, относительно недороги, пригодны для широкого применения и дают возможность оценивать качества природной среды при всем многообразии экологических изменений.

1.2. Микотоксины – природные загрязнители продукции

Микотоксины (название образовано от греческих корней гриб-«mykes» и яд - «toxikon») - это продукты жизнедеятельности микроскопических плесневых грибов родов Fusarium, Aspergillus, Myrothecium, Stachybotrys, Trichoderma, Trichothecium, Penicillium и др. Известно более 250 видов грибов, продуцирующих несколько сотен микотоксинов [18]. Общим признаком всех микотоксинов является токсичность преимущественно относительно эукариотических организмов [1, 5]. Токсичное действие микотоксинов обуславливается их взаимодействием с участками молекул ДНК, РНК и белков, что приводит к нарушению и подавлению процессов белкового биосинтеза. Микотоксины обладают выраженными мутагенными (включая гепатоканцерогенные) свойствами [4].

Микотоксины отличаются между собой по химическому строению, токсичности и механизму действия. К наиболее опасным видам микотоксинов, по классификации их воздействия на организм, могут быть отнесены:

Канцерогенные (образование и развитие раковых образований)

Мутагенные (количественные и качественные изменения в наследственном аппарате клетки)

Тератогенные (функциональные, биохимические, и структурные изменения в организме матери и плода, вызываемые воздействием внешне привнесенных, в данном случае - биохимических факторов) [20].

Большинство микотоксинов – это стойкие к термическому воздействию, хорошо растворимые в растворителях органического типа кристаллические вещества. Микотоксины (за исключением охратоксинов) достаточно устойчивы к действию кислот, разрушаются щелочами с образованием нетоксичных или малотоксичных соединений [22].

Среди наиболее вредно воздействующих на состояние здоровья человека и животных, выделяют:

Афлатотоксины

Трихоцетеновые микотоксины (трихоцетены)

Охратоксины

Патулин

Зеараленон и его производные [18].

Трихотеценовые микотоксины - микотоксины, синтезируемые грибами родов Fusarium, Cephalosporium, Myrothecium, Stachybotrys, Trichoderma и Trichothecium; содержат 12,13 - эпоксисесквитерпеноидный остаток (трихотекан); известно около 100 трихотеценовых микотоксинов, относящихся к 4 типам:

* A (Т-2 токсин, НТ-2 токсин, диацетоксисцирпенол),

* B (дезоксиниваленол, ниваленол, фузаренон Х, трихотецин),

* C (кротокол, кротоцин),

* D (веррукарины, роридины) [2].

Трихотецены проявляют тератогенные, цитотоксические, иммунодепрессивные, дерматотоксические свойства, действуют на кроветворные органы, центральную нервную систему, вызывают лейкопению, геморрагический синдром, ответственны за ряд пищевых микотоксикозов человека и животных. Токсические свойства обусловлены их участием в подавлении биосинтеза белка [2]. Из всех трихотеценов природными загрязнителями пищевых продуктов являются только 4 (они приведены в качестве представителей группы А и В). ЛД для этих микотоксинов около 46 мг/кг [22].

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Продовольственное сырье довольно часто бывает загрязнено Т-2 токсином [5]. Выраженные токсичные свойства Т-2 токсина обусловили необходимость контроля продовольственного сырья и продуктов питания для обеспечения их безопасности для потребителей [2].

В современной научной литературе есть сведения, что наиболее удачный тест для поиска соединений с цитостатическим действием – наблюдения за подавлением образования боковых корней у проростков огурца (Иванов В.Б., 2011) [11]. Продуктивность и экологическая пластичность растений во многом зависят от физиологической активности корневых систем. Корневая система огурца стержневая, но относительно слабовыраженная, так как основная масса корней расположена в верхнем (15-20 см) слое почвы, хотя отдельные корни проникают на глубину до 1м и более [21].

При прорастании семян тыквенных боковые корни появляются уже на третий день. Доказано, что цитостатики полностью останавливают появление боковых корней. Существует целый ряд токсикантов, ингибирующих только рост главного корня, но не влияющие на рост боковых корней. Например, высокие концентрации солей тяжелых металлов свинца и кадмия сильно тормозят рост главного корня, но не влияют на формирование боковых.

Модельный опыт основан на методике биотестирования по проращиванию семян, включенном в санитарные правила и нормы СанПиН 2.1.7.573-96 (утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31 октября 1996 г. N 46) [22]. Опыт закладывался дважды. Первый раз он был воспроизведен в вариантах в концентрациях 0.05 ppm, 0.1 ppm, 0.2 ppm, 0.3 ppm, 1 ppm, 3 ppm, 5 ppm и 10 ppm , плюс контроль с дистиллированной водой в двух повторностях по 9 семян (162 шт). Второй раз рабочие растворы Т-2 токсина были приготовлены в концентрациях 0.1 ppm, 0.2 ppm, 0.3 ppm, 1 ppm, 2.5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, также по две повторности, но по 10 семян (220 шт). Увеличение концентраций во втором опыте связано с целью проверить влияние повышенных концентраций токсина и обнаружить закономерности развития семян огурца под его действием.

В качестве тест-объекта использовались семена огурца. В каждую чашку Петри помещают по 9 семян (опыт №1) или по 10 семян (опыт №2), наливают по 5 мл дистиллированной воды, если это контроль, или по 5 мл рабочего раствора Т-2 токсина. Уровень жидкости в чашках должен быть ниже поверхности семян. Чашки покрывают и помещают при температуре 22⁰С.

Эксперимент заканчивается через 72 часа измерением длины главного корня и боковых корней.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Использование особенностей роста корней семян огурцов

в качестве тест-объекта

В начале опыта определи лабораторную всхожесть семян. Под всхожестью понимают способность семян формировать нормальные проростки за определенный для каждой культуры срок при оптимальных условиях проращивания. Она выражается в процентах нормальных проростков от числа анализируемых.

Таблица 1 – Лабораторная всхожесть семян огурца

под действием Т-2 токсина (опыт №1)

Анализ данных таблицы 1 показывает, что самые наименьшие концентрации по сравнению с контролем практически не оказывают негативное воздействие на лабораторную всхожесть, чего нельзя отметить у вариантов 8, 1, 3 и 4, где концентрации составляют 0,3, 0,5, 1, 2 и 3 ppm соответственно. Наиболее наглядно данную ситуацию представляет рис.1. (Приложение 1)

Анализируя данные таблицы 2 (рисунок 2, Приложение 2), мы выявили тенденцию негативного воздействия токсина: максимальное снижение лабораторной всхожести на вариантах 8 (25 ppm), 9 (50 ppm) и 10 (100 ppm).

Таблица 2 – Лабораторная всхожесть семян огурца

под действием Т-2 токсина (опыт №2)

То есть, на начальной стадии роста зародышевых корешков семян огурца были видны прямые воздействия Т-2 токсина, что дает основание предполагать проявление мутагенного эффекта Т-2 токсина.

В качестве второй сравнительной характеристикой данного эксперимента использовали длину главного корня. В обоих опытах влияние разных концентраций токсина не обнаружили значительных отличий от роста главного основного корня от контрольного варианта с водой (таблицы 3 и 4, Приложение 3,4).

Вследствие этого было проведено наблюдение за развитием боковых корешков. В огурцах, как и у других растений семейства тыквенные, боковые корешки формируются в меристеме. Если боковые корешки не формируются, это означает, что на растение действуют токсичные агенты! Динамика длины боковых корешков семян огурца опыта №1 показана в таблице 5, (рисунок 3, фото, приложение 5,6).

Таблица 5 – Длина боковых корней огурца (опыт №1)

Таким образом, мы обнаружили тенденцию уменьшения роста боковых корней . Т-2 токсин является носителем цитостатического эффекта, т.к. он ингибирует рост боковых корней, что доказано на примере проведенных опытов. Этот факт проявился в уменьшении длины боковых корешков в 1.6 раза.

Мы провели лабораторный опыт №2 с большими концентрациями токсина. В опыте №2 воздействие Т-2 токсина на семена огурца было изучено в дополнительных концентрациях: 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm и 100 ppm .

Опыт №2 показывает цитостатический эффект с варианта 4 (1 ppm) без дальнейшего волнообразного перемещения по графику (рис. 5).

Анализируя показатели средних значений, стабильная чувствительность к токсину проявляется с варианта 1 (10 ppm).

Таблица 6 – Длина боковых корней огурца (опыт №2)

Таблица 6 показывает фиксацию токсичности среды с концентраций 25-100 ppm, так как, снижение суммы длин боковых корней семян огурца от контроля составляет более 50%.(приложение 7)

Известный хроматографический метод определения микотоксинов: Т-2 токсина по ГОСТ 28001-88 [9], является сложным в исполнении, требующем специального лабораторного оборудования и навыков работы с ним. Сущность метода заключается в извлечении токсина ацетоном, очистке экстракта от липидов и растительных пигментов с последующей доочисткой на хроматографической колонке и двукратном хроматографированни его на пластинке «Силуфол» со стандартным раствором токсина. Чувствительность метода - 600 мкг/кг кормового средства.

В таблице 7 (приложение 8) приведена номенклатура материалов, необходимых для определения опытов на наличие Т-2 токсина

Для общепринятого ГОСТ 28001-88 [7] необходимо приобрести 48 наименований материалов для проведения анализа, а для биометодов перечень ограничивается 13-15 наименованиями без наличия дорогостоящего оборудования в нем. Что является дополнительным плюсом к методам биотестирования.

ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Максимальное снижение лабораторной всхожести семян огурца обнаружено в вариантах с концентрациями микотоксина 25 ppm, 50 ppm и 100 ppm.

Нами обнаружена тенденция уменьшения роста боковых корней зародышевых корешков семян огурца при воздействии Т-2 токсина в различных концентрациях. Этот факт проявился в уменьшении суммарной длины боковых корешков семян огурца в 1.6 раза. Анализируя показатели средних значений, стабильная чувствительность к токсину проявляется в варианте с концентрацией микотоксина 10 ppm.

2. Методом биотестирования с помощью фитоиндикации нами установлен предел обнаружения эффекта токсичности в концентрациях 25-100 ppm. Нами отмечено уменьшение общей суммы длин боковых корешков семян огурца по сравнению с контролем более чем на 50%.

Таким образом, метод биотестирования на наличие Т-2 токсина может быть использованы в качестве удобного способа для лабораторного биометода определения токсичности сельскохозяйственной продукции (семенного материала, кормов, готовой продукции и т.д.) не смотря на то, что этот метод обладает меньшей чувствительностью к токсинам. Но биотестирование на семенах огурцов является биометодом, не требующим дополнительных затрат. Его длительность составляет 72 часа, он не требует сложных навыков работы и наличия определенного оборудования.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ

Аверкиева О. Какие микотоксины «прячутся» в нашем зерне. / О Аверкиева, Т. Айдинян, О.Крюков - Комбикорма. 2012. № 6. С. 119-120.

Артюх В.П. Трихоцетеновые микотоксины: определение в объектах окружающей среды. / В.П. Артюх, О.С. Гойстер, Г.А. Хмельницкий, Н.Ф. Стародуб - Biopolymers and cell. 2003. Т. 19. № 3. С. 216-223

Богуславская Н.В. Микотоксины и проблема безопасности зерна и зарнопродуктов. / Н.В.Богуславская - Экологическая безопасность в АПК. Реферативный журнал. 2007. № 3. С. 719-719

Буркин А.А. «Микотоксины. Микотоксикозы и отравление грибами» / А.А. Буркин, Г.П. Кононенко, О.С. Кислякова - материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, 2003г.

Ганиев М.М. Вредители и болезни зерна и зернопродуктов при хранении / М.М. Ганиев, В.Д. Недорезков, X.Г. Шарипов - М.: КолосС, 2009. - 208 с.

ГОСТ Р 52337-05 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности.

ГОСТ 28001-88 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения микотоксинов:Т-2 токсина, зеараленона (Ф-2) и охратоксина А.

Егорова Е. И. Биотестирование и биоиндикация окружающей среды: учеб. пособие по курсу «Биотестирование» / Е. И. Егорова, В. И. Белолипецкая. - Обнинск: ИАТЭ, 2000.

Захаров В. М. Асимметрия морфологических структур животных как показатель незначительных изменений состояния среды / В. М. Захаров Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. — Л.: Гидрометео-издат, 2001. - Т.4.

Звягинцев Д. Г. Биология почв / Д. Г. Звягинцев [и др.]. - М.: Изд-во МГУ, 2005.

Иванов В.Б. Клеточные механизмы роста растений (Тимирязевские чтения;68) / В.Б. Иванов - Наука-М - 2011.- 104с.

Мелехова О. П. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию / О.П.Мелехова [и др.]. - М.: РГОТУПС, 2000.

Сазонова Ю.В.Внимание: Микотоксины! / Ю.В.Сазонова - Птица и птицепродукты. 2007. № 5. С. 10-12.

Санитарные правила и нормы СанПиН 2.1.7.573-96 "Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения" (утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 31 октября 1996 г. N 46)

Свистова И.Д. Биотестирование длительно окультуренного чернозема выщелоченного разного уровня удобренности./ И.Д. Свистова, Л.Д. Стахурлова, М.В. Еременко, А.Ю. Бендяк - Агрохимия. 2011. № 5. С. 54-59.

Семенченко В.П. Принципы и системы биоиндикации текучих вод. / В.П. Семенченко - Минск: "Орех", 2004. – 125 с.

Терехова В.А. Биотестирование почв: подходы и проблемы. / В.А. Терехова - Почвоведение. 2011. № 2. С. 190-198.

Тутельян В.А. Микотоксины (медицинские и биологические аспекты). / В.А. Тутельян, Л.В. Кравченко - М.; «Медицина», 1985.-С. 320

Charm Sciences Russia «Экспресс-анализ зерна и кормов на микотоксины» Опубликовано 25.07.2012 http://www.charm-m.ru/news/data/ic_blog/2/

Биомедиа. РФ (научно-популярный портал) Микотоксины. Определение. Классификация. Воздействие. Методы профилактики Опубликовано05.10.2012http://биомедиа.рф/nauka-i-praktika/tehnologii-i-novacii/1152-mikotoksiny.html

ООО «Селекционно-семеноводческая фирма «Манул» Зимне-весенняя культура пчелоопыляемого огурца. Биологический подход Опубликовано март 2002 http://manul.ru/article/item/64

05.11-19Е.7 Микотоксины: структура и биосинтез РЖ 19Е. Природные органические соединения и их синтетические аналоги. 2005. № 11

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1

Рис. 1 Лабораторная всхожесть семян огурца (среднее значение)

под действием Т-2 токсина (опыт №1)

Приложение 2

Рис. 2Лабораторная всхожесть семян огурца (среднее значение)

под действием Т-2 токсина (опыт №2)

Приложение 3

Таблица 3 – Длина главного корня огурца (опыт №1)

Приложение 4

Таблица 4 – Длина главного корня огурца (опыт №2)

Приложение 5

Рис. 4 Длина боковых корней огурца (опыт №1)

Приложение 6

Лабораторная всхожесть семян огурца под воздействием различных концентраций Т-2 токсина (опыт №1)

В ариант 1 – концентрация Т-2 токсина 0.5 ppm

В ариант 2 – концентрация Т-2 токсина 1 ppm

Вариант 3 – концентрация Т-2 токсина 2 ppm

Приложение 6 (продолжение)

Лабораторная всхожесть семян огурца под воздействием различных концентраций Т-2 токсина (опыт №1)

Вариант 4 – концентрация Т-2 токсина 3 ppm

Вариант 5 – концентрация Т-2 токсина 0.05 ppm

Вариант 6 – концентрация Т-2 токсина 0.01 ppm

Приложение 6 (продолжение)

Л абораторная всхожесть семян огурца под воздействием различных концентраций Т-2 токсина (опыт №1)

Вариант 7 – концентрация Т-2 токсина 0.2 ppm

В ариант 8 – концентрация Т-2 токсина 0.3 ppm

Контроль с дистиллированной водой

Приложение 7

Рис. 5 Длина боковых корней огурца (опыт №2)

Приложение 8

Таблица 7 – Номенклатура приборов и материалов, необходимых для

разных способов определения Т-2 токсина