Изучение механизмов действия на клетку антиоксиданта SKQ1 с помощью бактериальной люминесценции.

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Отвиновская Д.В. 1

---

1МБШ Вита

Новоятлова У.С. 1

---

1 МФТИ

Работа в формате PDF

560.2 KB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение:

Данный проект направлен на исследование вещества SkQ1 – митохондриально направленного антиоксиданта нового типа, компонента перспективных препаратов от старения. В начале 2000-х годов научная группа Владимира Скулачева начала разработку веществ, которые могли бы проявлять свои антиоксидантные свойства в митохондриях [1]. Ими был синтезирован класс веществ SkQ - ионов, проникающих через мембрану, в том числе через мембрану митохондрий. Среди них SkQ1 обладает самой большой антиоксидантной активностью. На данный момент вещества класса SkQ активно изучаются в лабораториях, есть ряд организаций, занимающихся созданием новых препаратов и проведением их клинических испытаний. Клинические испытания, показали, что SkQ1 способен задерживать развитие некоторых признаков старения и увеличивать продолжительность жизни самых разных животных. Также в различных экспериментах SkQ замедлил развитие нескольких возраст-зависимых патологий – признаков старения. Было показано, что SkQ ускоряет заживление ран, а также лечит возрастные заболевания. С 2008 г. SkQ1 официально зарегистрирован, как основное действующее вещество лекарственного препарата “Визомитин” (используется при глазных заболеваниях).

В 1972 году Денхам Харман предложил теорию старения, основанную на накоплении активных форм кислорода, производимых в митохондриях [2]. Активные формы кислорода (АФК) – это небольшие молекулы, обладающие сильной реактивностью, благодаря наличию неспаренного электрона на внешнем электронном уровне. К ним относятся ионы кислорода, свободные радикалы и пероксиды. При высоком содержании АФК клетка испытывает окислительный стресс, идет окисление жизненно важных компонентов клетки. Потребляемый клетками кислород в митохондриях обычно восстанавливается до воды, но приблизительно 2% молекуд кислорода образуют супероксид за счет паразитных химических реакций, происходящих в начале и середине цепи дыхательных ферментов митохондрий. Супероксид затем превращается в перекись водорода (Н₂О₂) и радикал гидроксила (ОН•) – сильнейший окислитель, разрушающий любые вещества живой клетки [3]. Накопление АФК и повреждений, обусловленными ими, в митохондриях, согласно митохондриальной теории, предложенной Харманом, в итоге и приводят к старению организма.

Рис.1 Молекула SkQ1

Молекула SkQ1 (рис. 1) имеет гидрофобную часть, что позволяет ей проникать через мембраны клетки, а положительно заряженный ион трифенилфосфония (TPP) определяет эффективность доставки соединения в матрикс митохондрии. Пластохиноновая часть отвечает за антиоксидантные свойства соединения.

Рис.2 Окислительно-восстановительная реакции SkQ1.

SkQ1 является так же возобновляемость: комплекс III дыхательной цепи восстанавливает молекулу после ингибирования АФК. SkQ1 как гидрофобное соединение с делокализованным положительным зарядом является разобщителем дыхания. То есть, оно способно переносить анионы жирных кислот с одной стороны мембраны на другую и, таким образом, понижать трансмембранный потенциал. Слабое разобщение мембраны обычно приводит к многократному уменьшению количества производимых митохондриями АФК.

В данной работе предлагается изучить влияние вещества SkQ1 на энергетические процессы в клетке с помощью двух принципиально различных механизмов биолюминесценции, для этого используются генно-инженерные клетки E.coli с генами бактериальной и светлячковой люминесценции. Изменение люминесценции позволит сделать ряд предположений о том, как вещество влияет на клетку и эти предположения будут проверены.

Под бактериальной люминесценцией имеется в виду способность бактерий светиться в результате определённой химической реакции, катализируемой ферментом люциферазой. В ходе этой реакции происходит окисление восстановленного флавинмононуклеотида (FMNH) и алифатического альдегида (RCOH) кислородом воздуха (O₂) [4] Скоординированный непрерывный процесс люминесценции предполагает взаимодействие между ферментами, в том числе таким, как NADH-зависимая оксидоредуктаза, что показано на рис. 3. В качестве двух ключевых компонентов люминесцентной цепи выступают NAD и FMN.

Формула реакции бактериальной люминесценции, катализируемой люциферазой:

RCHO + FMNH₂ + O₂ = RCOOH + FMN + H₂O + hν (490 нм)

Рис.3 Сопряжение ферментов биолюминесцентной системы бактерий

Люминесцентная реакция светляков требует на ряду с ферментом люциферазой и субстратом люциферином аденозинтрифосфат (ATP). Свет образуется при окислении люциферина при помощи фермента люциферазы, в качестве кофактора требуется ATP.

люциферин + ATP → люцифериладенилат + PP_i

люцифериладенилат + O₂ → оксилюциферин + АМP + свет.

Благодаря двум разным типам люминесценциям можно косвенно судить об уровне NADH и ATP в клетке.

На данный момент различные системы люминесценции используются в различных исследованиях, как invivo, так и invitro.

Актуальность:

Данная работа направлена на то, чтобы получить дополнительные сведения о влиянии SkQ1 на энергетические процессы в клетке. Выводы данной работы, в дальнейшем, смогут пригодиться для дизайна лекарств на основе SkQ1 - в том числе, лекарств, замедляющих старение. На данный момент исследование SkQ1 является одним из самых популярных инновационных проектов, интерес к которому не утихает на протяжении более 10 лет. SkQ1 уже используется для лечения возрастных глазных болезней, еще несколько препаратов находится на клинических исследованиях.

Цель работы:

Узнать, как SkQ1 влияет на бактериальную клетку с помощью генноинженерных штаммов, способных к биолюминесценций, которая определяется белками - люциферазами двух типов: бактериальной и светлячковой.

Задачи работы:

Изучить кинетику влияния SkQ1 на биолюминесценцию в клетках E. coli.

Изучить выживаемость клеток при воздействии различных концентраций SkQ1.

Материалы и методы

Используемые штаммы

E.coli MG1655 pXen7: генно-инженерный штамм кишечный палочки, содержащий плазмиду с генами luxCDABE из бактерии Photorhabdusluminescens [5]

Рис.4 Карта плазмиды pXen7

E.coli MG1655 pLR4: генно-инженерный штамм кишечный палочки, содержащий плазмиду с генами люциферазы светляков Luciólamingrelicaпод контролем промотора lux-оперона Aliivibriofischeri[6]

Рис.5 Карта плазмиды pLR4

Среды и условия роста

Для культивирования клеток использовались жидкая и агаризованная среда LB (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl). Для получения агаризованной среды к жидкой среде LB добавлялся агар в концентрации 1,5%. Среды перед культивированием были стерилизованы.

Клетки выращивались при температуре 37°С на чашках Петри с агаризованной средой. В жидкой среде клетки выращивались в пробирках на 10 мл. при 37°С и перемешивании 200 об/мин.

Схема постановки экспериментов

Для исследования кинетики изменения бактериальной люминесценции использовался прибор Биотокс-7. Для измерений использовались пробирки с объемом пробы – 200 мкл. К клеткам E. coli pXen7 в объеме 200 мкл. Добавлялось SkQ1 до конечных концентраций:1мкМ, 4мкМ, 20мкМ, 40мкМ. Одна из проб не содержала SkQ1.

Исходный раствор SkQ1 в воде был в концентрации 10 мМ.

Для исследования выживаемости клеток E. сoli pXen7 при воздействии различных концентраций SkQ, к 200 мкл. клеток добавлялось вещество до конечных концентраций: 4мкМ, 20мкМ, 40мкМ. Далее клетки инкубировались на столе при нормальной температуре 10 минут, далее 1 мкл. клеток разбавлялся в 100 раз в жидкой среде, и 50 мкл. получившегося раствора высевались на чашку с антибиотиком с помощью шпателя. Клетки, к которым не добавлялся SkQ1, высевались тем же образом. Чашки инкубировались сутки в термостате. На следующий день вручную проводился подсчет выросших колоний.

Для исследования кинетики изменения светлячковой люминесценции использовался прибор Synergy HT (BioTek). Для измерения люминесценции к клеткам E. coli pLR добавлялся субстрат – D-люциферин в конечной концентрации 0,1 мМ. Далее в 96-луночный планшет помещались пробы в объеме 200 мкл. с различной конечной концентрацией SkQ1. В контрольную пробу SkQ1 не добавлялось.

Результаты:

На первом графике (рис. 6) показано изменение люминесценции клеток E.coli pXen7, видно, что при увеличении концентраций, резко снижается люминесценция клеток E. coli pXen7. Также мы можем заметить, что pXen7 и 1мкМ – практически не отличаются друг от друга. Начиная с 4 мкМ, видно резкое и значительное падение. На высоких концентрациях прямые стремятся к нулю.

Рис.6 Изменение бактериальной люминесценции у клеток E.coli pXen7

В ходе первого эксперимента мы выяснили, что концентрации SkQ1 4 мкМ и выше вызывают падение бактериальной люминесценции. Это может быть вызвано гибелью клеток или воздействием на химическую реакцию люминесценции, то есть либо денатурацией люциферазы, либо падением уровня субстратов люциферазной реакции: FMNH₂ и тетрадеканаля.

Для проверки жизнеспособности клеток, инкубирующихся с SkQ1 была проверена выживаемость клеток при концентрациях от 1 до 400 мкМ SkQ1 после измерения люминесценции (табл. 1). Время инкубации составило примерно 15 минут.

Таблица 1. Подсчет колоний E. coli pXen7 (разведение 10^-4).

По этим данным, а также с расчетом коэффициента падения люминесценции в первом эксперименте, был построен следующий график (рис. 7). По данному графику заметно, что количество клеток при воздействии высоких концентраций SkQ1 практически не меняется, что означает, что выживаемость клеток на падение люминесценции никак не влияет.

Рис. 7 Концентрационная зависимость для коэффициента падения люминесценции (левая ось) и для количества колоний на чашках (правая ось)

На графике (рис. 8) показано изменение светлячковой люминесценции на клетках E. coli pLR. На графике заметно, что для высоких концентраций (20мкМ и 40мкМ), которые уже вызывают падение бактериальной люминесценции, светлячковая люминесценция не падает и остается примерно на одном уровне. Так как один из основных компонентов реакции светлячковой люминесценции – ATP, по этому графику можно сделать вывод, что количество ATP при воздействии на клетку SkQ1 не падает.

Рис.8 Изменение светлячковой люминесценции у клеток E. coli pLR

Вывод:

Поскольку для работы бактериальной люциферазы требуется восстановленный флавин-мононуклеотид (FMN*H₂), а для работы светлячковой люциферазы аденозинтрифосфат (АТP), можно сделать вывод: полученные результаты поддерживают гипотезу о том, что SkQ1 прямо влияет на пул восстановленных эквивалентов клетки, в частности на продукцию FMN*H₂, но не снижает уровень АТP в клетке.

Список литературы:

V. P. Skulachev A Biochemical Approach to the Problem of Aging: “Megaproject” on Membrane-Penetrating Ions. The First Results and Prospects // Biochemistry (Moscow), 2007;

D. Harman The biological clock: The Mitochondria? // Journal of the American Geriatrics Society, 1972;

В. П. Скулачев Эволюция Митохондрии и Кислород // Соросовский Образовательный Журнал, 1999;

Edward A. Meighen Molecular Biology of Bacterial Bioluminescence // Microbiological Reviews, 1991;

Манухов И.В., Расторгуев С.М., Ерошников Г.Е., Зарубина А.П., Завильгельский Г.Б. Клонирование и экспрессия lux-оперона Ph. luminescens, штамм Zm1: нуклеотидная последовательность генов luxAB и основные характеристики люциферазы. // Генетика. Т. 36. №3. С. 322-330;

Koksharov, M.I. and Ugarova, N.N. Random mutagenesis of Luciola mingrelica firefly luciferase. Mutant enzymes with bioluminescence spectra showing low pH sensitivity // Biochemistry Mosc. 73 (8), 862-869 (2008);