Влияния различных факторов на активность фермента амилазы слюны

XV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке

Влияния различных факторов на активность фермента амилазы слюны

Аверьянова Ольга Максимовна 1
1МБОУ "БЕРЕЗОВСКАЯ СШ"
Панькина Ольга Евгеньевна 1
1МБОУ "БЕРЕЗОВСКАЯ СШ"
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Цель работы: изучение влияния различных факторов на активность фермента амилазы слюны.

Гипотеза: различные факторы по-разному влияют на активность фермента амилазы слюны.

Объект исследования: фермент амилаза слюны.

Предмет исследования: активность амилазы слюны под влиянием различных факторов.

Задачи:

1.Изучить и проанализировать литературные источники о ферментах, их физико –химических свойствах и их роли в организме человека, на примере фермента амилазы слюны.

2.Познакомиться с методикой – «Изучение физико-химических свойств ферментов на примере амилазы слюны», позволяющей определить, что фермент активен при определенных условиях.

3.Провести эксперимент по определению специфичности фермента и влияния отдельных факторов (температуры, РН среды, ингибиторов: хлорида натрия, сульфата, меди, спирта, никотина, антибиотиков) на активность фермента амилазы слюны.

Введение:

Ферменты очень важны для жизнедеятельности организма. Ферменты помогают современному человеку: поддерживать работу иммунной системы в ее борьбе с инфекцией; повышают уровень выносливости организма (что особенно важно в нынешней ситуации, в период ковидной пандемии); уничтожают и выводят из организма различные вредные вещества; предупреждают хроническое течение болезни; препятствуют гормональному дисбалансу в организме.

Проект позволяет доказать, что работают ферменты в строго определенных условиях, изменения которых снижает их активность и оказывает отрицательное воздействие на все жизненно важные процессы организма.

I. Общая характеристика ферментов

1.1. Что такое ферменты

Ферменты, или энзимы, - это органические катализаторы белковой природы, которые ускоряют реакции, необходимые для функционирования живых организмов. Так как реакции обмена веществ, протекающих в организме, можно разделить на два типа процессов: синтез (анаболические) и распад (катаболические), то соответственно можно выделить и два типа ферментов. [1] Все ферменты – глобулярные белки с третичной или четвертичной структурой. Ферменты могут быть простыми, состоящими только из белка, и сложными. Сложные ферменты состоят из белковой и небелковой части (белковая часть – апофермент, а добавочная небелковая – кофермент). В качестве кофермента могут выступать витамины – E, K, B групп. Фермент взаимодействует с субстратом, не всей молекулой, а отдельной её частью – активным центром. Фермент взаимодействует с субстратом и образует короткоживущий фермент-субстратный комплекс. По завершении реакции, фермент-субстратный комплекс распадается на продукты и фермент. Фермент в итоге не изменяется: по окончании реакции он остается таким же, каким был до неё, и может взаимодействовать с новой молекулой субстрата. В 1890 году Э. Г. Фишер предположил, что эта специфичность обусловлена особой формой молекулы фермента, которая точно соответствует форме молекулы субстрата. Эта гипотеза получила название «ключа и замка», где ключ сравнивается с субстратом, а замок – с ферментом. Гипотеза гласит: субстрат подходит к ферменту, как ключ подходит к замку. Избирательность действия фермента связана со строением его активного центра. В связи с большой значимостью ферментов для обмена веществ и их значительным разнообразием учение о ферментах сформировалось в отдельную биохимическую дисциплину – энзимологию.

1.2. Классификация ферментов

Систематическая классификация учитывает реакционную и субстратную

специфичность ферментов. Все ферменты разделяют на следующие 6 классов в зависимости от типа реакции: 1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции (перенос электронов или атомов водорода) от одного вещества к другому. 2. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных групп атомов (метильной группы, фосфатной или аминогруппы) от одного вещества к другому.

3. Гидролазы, катализирующие реакции гидролиза молекулярных связей (амилаза слюны). 4. Лиазы (синтазы), катализирующие расщепление или образование связи без участия окисления или гидролиза. 5. Изомеразы, катализирующие реакции изомеризации. 6. Лигазы (синтетазы), катализирующие реакции присоединения, сопряженные с разрывом макроэргической связи в АТФ . [2]

1.3. Свойства белков

Ферменты- веществами белкой природы, обладают всеми свойствами белков: являются амфотерными соединениями; вступают в те же качественные реакции, что и белки (биуретовую, ксантопротеиновую и др.); подобно белкам растворяются в воде с образованием коллоидных растворов; гидролизуются до аминокислот; склонны к денатурации под влиянием тех же факторов: температуры, изменениях рН, действием солей тяжелых металлов, действием физических факторов (ультразвук, ионизирующее излучение и др.); имеют несколько уровней организации макромолекул. Свойства ферментов, отличающие их от неорганических катализаторов: 1. высокая специфичность: субстратная специфичность:

абсолютная (1 фермент – 1 субстрат), групповая (1 фермент – несколько похожих субстратов) стереоспецифичность (ферменты работают с субстратами только определенного стереоряда (LилиD), каталитическая специфичность(селективность)- ферменты катализируют реакции преимущественно одного из типов химических реакций – гидролиза, окисления-восстановления и др.. 2. Высокая эффективность действия: ферменты ускоряют реакции в108-1014 раз. 3. Ферменты действуют только в мягких условиях (= 36-37ºС, рН ~ 7,4, атмосферное давление), т.к. они обладают конформационной лабильностью – способностью к изменению конформации молекулы под действием денатурирующих агентов (рН, Т, химические вещества). 4.Широкий диапазон действия (большинство процессов в организме катализируют ферменты).

1.4. Фермент амилаза слюны - класс гидролазы

Амилаза (от лат. amylum – крахмал) – фермент класса гидролаз, секретируется слюнными железами и поджелудочной железой. Действие амилазы слюны прекращается в резко кислой среде содержимого желудка (рН 1,5–2,5). Однако внутри пищевого комка активность амилазы может некоторое время сохраняться, пока рН не изменится в кислую сторону. В ротовой полости пища измельчается при пережёвывании, смачиваясь при этом слюной. Слюна на 99 % состоит из воды и обычно имеет рН 6,8. В ротовой полости не может происходить полное расщепление крахмала, так как действие фермента на крахмал кратковременно. Воздействие слюны на крахмал называют ферментативным гидролизом. Так как сам крахмал является веществом инертным, то эта реакция происходит под воздействием тепла и катализатора. Им в данный момент является фермент амилаза, находящийся в человеческой слюне. Именно она расщепляет крахмал на более мелкие составляющие. Этот процесс каждый человек ощущает при долгом пережёвывании крахмалосодержащих продуктов, например, хлеба. Ведь через некоторый промежуток времени можно ощутить сладковатый привкус во рту, что свидетельствует о том, что гидролиз крахмала начался, и он постепенно распадается на углеводы. Одним из важнейших углеводов для человеческого организма является глюкоза. При окислении её в каждой клетке человеческого организма образуется вода и углекислый газ. Также эта реакция сопровождается выделением энергии, столь необходимой для функционирования всех органов. Лишняя глюкоза, получившаяся при гидролизе крахмала, превращается в запасное вещество гликоген, который откладывается «про запас» в печени. Качественная реакция на крахмал – проба с йодом (сине-фиолетовое окрашивание). Крахмал – один из наиболее распространенных запасных полисахаридов растений. Он интенсивно накапливается в результате фотосинтеза и откладывается в семенах, клубнях и других частях растений. При гидролизе крахмал распадается с образованием глюкозы, являющейся его структурным элементом.

II. Экспериментальная часть работы. Методика «Изучение физико-химических свойств ферментов на примере амилазы слюны»

2.1. Влияние температуры на активность ферментов

1. В 4 пробирки отмерить по 2 мл крахмала. Пробирки поместить в разные температурные условия: а) в кипящую водяную баню 100оС; б) в термостат на 40 оС; в) оставить в штативе (комнатная температура); г) поставить в снег 2. Через 10 мин, когда содержимое пробирок примет заданную температуру, во все пробирки добавляют по 0,5мл разбавленной слюны, перемешивают с помощью стеклянной палочки и оставляют в тех же условиях.3. Тотчас же начинают делать капельные пробы на стекле. Две капли содержимого второй пробирки капают на стекло, к ним добавляют 1 каплю раствора Люголя. Вначале получается синее окрашивание, через 1-2 мин. Пробу повторяют до появления красно-бурой окраски. 4. Как только окраска содержимого второй пробирки окажется красно-бурой, прибавляют во все пробирки 1-2 капли раствора Люголя и отмечают время окончания ферментативной реакции.

№ пробирки

Фермент амилаза, мл

Объем 0,5% крахмала, мл

Температура, оС

Результат опыта с раствором Люголя (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)

1

1

2

100

Синее окрашивание

2

1

2

40

Бледно - розовая окраска

3

1

2

20

Окраска меняется незначительно, через более длительное время

4

1

2

0

Синие окрашивание

При определенной температуре, называемой оптимальной, активность фермента достигает своего максимума. Для большинства ферментов температурный оптимум находится в пределах 40—50 °С, причем для каждого фермента его величина не является константой. Для амилазы слюны оптимальная температура -38 градусов. С повышением температуры происходит разрушение фермента. Амилаза ускоряет гидролиз крахмала наиболее активно при температуре 40 градусов. Приложение (рис.1)

2.2. Влияние рН среды на активность амилазы слюны

Содержимое каждой пробирки после прибавления слюны тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20оС) на 15-20 мин. Через 10 мин. берут пробы из третьей пробирки, переносят на стеклышко и проделывают реакцию с каплями раствора Люголя. Вначале обычно получается синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное, красно-бурое, желтое. Как только содержимое третьей пробирки будет давать желтое окрашивание, через 1-2 минуты приливают во все пробирки по 1 капле раствор Люголя. На основании полученной окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН среды.

№ пробирки

рН буферного раствора

Объем растворов для получения буферного раствора с заданным рН

Субстрат (крахмал) 0,5%

Фермент амилаза

Результат опыта с раствором Люголя (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)

1/15М дигидрофосфата калия

1/15М гидрофосфата натрия

       

1

5,6

0,25

4,75

1

Темно -синий

2

6,2

1

4

1

Слабо- фиолетовый

3

7

3

2

1

Раствор обесцветился.

4

7,4

4

1

1

Фиолетовый

5

8

4,75

0,25

1

Темно - синий

Оптимальная РН для амилазы слюны 6,8 (слабощелочная реакция среды). По мере отклонения pH среды от оптимальных значений для действия данного фермента в кислую или в щелочную сторону его каталитическая активность начинает быстро ослабевать, а затем полностью прекращается. Блика к оптимальной РН - 7. Приложение (рис.5)

2.3. Специфичность ферментов

Принцип работы: каждый фермент может катализировать только одну реакцию, действуя на одно вещество или ряд близко родственных веществ. Высокая специфичность - одно из наиболее характерных свойств ферментов. Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов и не оказывает никакого действия на дисахариды. В случае расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу реакция Триммера должна быть положительной. При расщеплении крахмала до глюкозы эта проба также положительна. Работа проводится с 2 пробирками по следующей схеме: в каждую из пробирок добавляют по 0,5 мл слюны, затем в 1-ю - 2 мл крахмала, во 2-ю – 2 мл сахарозы, оставляют на 10 минут. Содержимое каждой пробирки делят на 2 части: одну часть проверяют с раствором Люголя, другую – с раствором Триммера. на присутствие глюкозы 1 мл исследуемого раствора + 0,5 мл 10% раствора гидроксида натрия + 5 капель 1% раствора сульфата меди. Пробирку нагревают в кипящей водяной бане.

Реактивы

№ пробирки

Результаты опытов по реакции (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)

Результаты опыта с раствором Триммера

Результаты опыта с раствором Люголя

1

2

с раствором Люголя

   

Крахмал

2 мл

-

Красно – бурое окрашивание

обесцветился

Сахароза (1% раствор)

-

2 мл

Голубое окрашивание осадка не меняется

Цвет раствора Люголя не изменяется

Амилаза

0,5 мл

0,

   

Появление глюкозы наблюдаем в растворе с крахмалом, в растворе с сахарозой реакция гидролиза не происходит, качественная реакция на глюкозу не идет, что свидетельствует о избирательности фермента амилазы, катализатор ускоряет реакцию гидролиза крахмала и не действует на дисахарид -сахарозу. Приложение (рис.6-9)

2.4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

В данной работе исследуется влияние на каталитическую активность амилазы слюны хлорида натрия и сульфата меди. Нумеруются три пробирки. В пробирку №1 наливают 1 мл воды; в пробирку № 2 - 0,8 мл воды и 0,2 мл. 1% раствора хлорида натрия, в пробирку № 3 - 0,8 мл воды и 0,2 мл 1% раствора сульфата меди. Во все пробирки добавляют по 1 мл разведенной слюны и по 1 мл 0,5% крахмала и оставляют на 3 мин. при комнатной температуре. Затем проверяют действие ферментов в пробирке №2, где предполагается наибольшая активность амилазы. Для этого из пробирки №2 отбирают несколько капель и проделывают пробную реакцию с йодом; эту реакцию повторяют каждые 20-30секунд, пока не получат оранжевое или желтое окрашивание. Затем добавляют йод в пробирки № 1, 2, 3. Отмечают окрашивание и записывают результаты в виде таблицы.

№ пробирки

Объем воды, мл

Модулятор

Фермент
амилаза, мл

Субстрат (крахмал 0,5%), мл

Результат опыта по реакции с йодом (рисунок пробирки с полученным цветом раствора)

1

1

-

1

1

 

2

0,8

0,2 мл хлорида натрия

1

1

Желтое окрашивание

3

0,8

0,2 мл сульфата меди

1

1

Темно – синее окрашивание

Результаты опыта свидетельствуют о том, что одни вещества -активаторы (хлорид натрия) ускоряют реакцию гидролиза, повышают активность фермента, а другие вещества - ингибиторы (сульфат меди) замедляют действие фермента. Гидролиза во второй пробирке, с ингибитором, не происходит. Приложение (рис.4)

2.5. Влияние концентрации слюны на активность фермента

Оборудование: пробирки (6 шт.), пипетка, раствор крахмала, раствор Люголя, раствор слюны, вода.

Номер пробирки

1

2

3

4

5

6

Концентрация слюны

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

1:320

Окраска с йодом

Грязно-желтый

Желтл-розовый

розовый

красноватый

фиолетовый

синий

В пробирке N6 раствор окрасился в синий цвет, значит, концентрация воды значительно больше, чем концентрация слюны и в этой пробирке расщепление крахмала под действием амилазы идёт очень медленно. Наиболее активно гидролиз крахмала происходит в пробирке №1, где концентрация слюны самая высокая. Опыт доказывает, что концентрация фермента влияет на скорость реакции, катализируемой им. Приложение (рис.18)

2.6. Влияние никотина на активность фермента амилазы Оборудование: пробирки (2шт), пипетка, 1 % раствор крахмала, раствор Люголя, растворы слюны курящего и не курящего человека.

Номер пробирки

Содержимое пробирок

Окраска с йодом

1

Крахмал, слюна

Некурящего человека

Синее окрашивание исчезает со временем

2

Крахмал, слюна курящего

человека

Синее окрашивание не исчезает

Синий цвет в первой пробирке, свидетельствует о том, что расщепление крахмала не произошло, а это значит, что никотин угнетающе воздействует на активность амилазы слюны. Приложение. (рис.16, 17)

2.7 Влияние спирта на активность фермента амилазы

Оборудование: пробирки (2 шт.), пипетка, 1 % раствор крахмала, раствор Люголя, раствор слюны.

Номер пробирки

Содержимое пробирок

Окраска с йодом

1

Крахмал, слюна вода

Синее окрашивание исчезает со временем

2

Крахмал, слюна, этиловый спирт

Синее окрашивание не исчезает

Синий цвет в первой пробирке свидетельствует о том, что расщепления крахмала не произошло, следовательно, спирт негативно влияет на активность амилазы слюны. Приложение (рис.10,11)

2.8. Влияние антибиотиков на активность фермента амилазы

Оборудование: пробирки (2 шт.), пипетка, 1 % раствор крахмала, раствор Люголя, раствор слюны, антибиотик «Доксициклин».

Номер пробирки

Содержимое пробирок

Окраска с йодом

1

Крахмал, слюна вода

синее окрашивание исчезает со временем

2

Крахмал, слюна, антибиотик

Синее окрашивание не исчезает

Синий цвет в пробирке №2 свидетельствует о том, что антибиотик угнетающе влияет на активность амилазы слюны. Приложение (рис.12,13)

2.9. Влияние кислоты на активность фермента амилазы

Оборудование: пробирки (2 шт.), пипетка, 1 % раствор крахмала, раствор Люголя, раствор слюны, лимонная кислота.

Номер пробирки

Содержимое пробирок

Окраска с йодом

1

Крахмал, слюна

вода

синее окрашивание исчезает со временем

2

Крахмал, слюна, лимонная кислота

Синее окрашивание

Не исчезает

Синий цвет свидетельствует о том, что кислота угнетающе повлияла на активность амилазы. Приложение (рис.14,15)

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

В результате проведенных исследований установлено:

Ферменты или энзимы -это органические катализаторы белковой природы, которые ускоряют реакции, необходимые для функционирования живых организмов. Все ферменты – глобулярные белки с третичной или четвертичной структурой. Ферменты могут быть простыми, состоящими только из белка, и сложными. Сложные ферменты состоят из белковой и небелковой части (витамины – E, K, B групп). Фермент взаимодействует с субстратом, не всей молекулой, а отдельной её частью – активным центром. Субстрат подходит к ферменту, как ключ подходит к замку. Избирательность действия фермента связана со строением его активного центра. Учение о ферментах сформировалось в отдельную биохимическую дисциплину – энзимологию. Систематическая классификация учитывает реакционную и субстратную специфичность ферментов. Все ферменты разделяют на 6 классов в зависимости от типа реакции: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Ферменты по химической природе являются белками и обладают всеми свойствами белков: амфотерны, дают качественные реакции характерные для белков, в воде образуют коллоидные растворы, гидролизуются до аминокислот, имеют несколько уровней организации, подвергаются денатурации под влиянием ряда факторов. Свойства ферментов, отличающие их от неорганических катализаторов: высокая специфичность и эффективность действия, действуют в мягких условиях, широкий диапазон действия. Амилаза (от лат. amylum – крахмал) – фермент класса гидролаз, секретируется слюнными железами и поджелудочной железой. В ротовой полости пища измельчается при пережёвывании, смачиваясь при этом слюной. Слюна на 99 % состоит из воды и обычно имеет рН 6,8. В ротовой полости не может происходить полное расщепление крахмала, так как действие фермента на крахмал кратковременно. Крахмал гидролизуется под действием амилазы до глюкозы и промежуточных продуктов гидролиза. Глюкоза- источник энергии в организме, лишняя глюкоза превращается в запасное вещество гликоген, который откладывается «про запас» в печени. Одним из важнейших углеводов для человеческого организма является глюкоза. При окислении её в каждой клетке человеческого организма образуется вода и углекислый газ. Также эта реакция сопровождается выделением энергии, столь необходимой для функционирования всех органов. Лишняя глюкоза, получившаяся при гидролизе крахмала, превращается в запасное вещество гликоген.

Выводы и заключение

Доказано: 1. Ферменты действуют в мягких условиях: t=40-50 градусов С, при атмосферном давлении, при оптимальной РН реакции среды. Оптимальная РН среды для амилазы слюны-6,8. 2. Для ферментов характерна высокая избирательность к субстрату (специфичность). Амилаза слюны легко расщепляет крахмал, но не гидролизует сахарозу .3. Ионы Cl активируют амилазу, поваренная соль (хлорид натрия) повышает активность амилазы, является активатором. NaCl – активатор для амилазы слюны. Добавление соли в пищу – кулинарный прием, который не только улучшает вкусовые качества пищи, но и способствует перевариванию сложных углеводов в ротовой полости.4. Сульфат меди угнетающе воздействует на активность фермента – амилазы слюны. Все соли тяжёлых металлов, например медный купорос (сульфат меди), снижает активность фермента, вызывает денатурацию белка – фермента. 5. Концентрация слюны влияет на активность фермента амилазы. 6. Никотин, этиловый спирт и антибиотики снижают активность фермента амилазы, является ингибиторами действия амилазы слюны.

7. Амилаза работает в ротовой полости, при РН-6,8. Кислая среда приводит к нарушению работы фермента. Гипотеза подтвердилась, различные факторы по-разному влияют на активность фермента амилазы слюны. Ферменты работают в при определенных условиях. Любое отклонение от нормы способно нарушить равновесие в процессах обмена веществ.

Литература:

1. Габриелян, О.С., Химия.10 класс: Учебное пособие для общеобразовательных учреждений/О.С. Габриелян, Ф.Н. Маскаев, С.Ю. Пономарев, В.И. Теренин; Под редакцией В.И. Теренина.-М.: Дрофа 2020-304 с. :ил.

2. Емельянов В.В., Биохимия: Учебное пособие/Емельянов В.В., Максимов Н.Е., Мочульская Н.Н.; М-во образования и науки Российской Федерации; Урал, Федеральный университет – Екатеринбург: Изд-во Урал. Ун-та, 2016-132с.

3.Шаталова О.П. Ферменты/ к.м.н., доц. Шаталова О.П. Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Минздрава России, кафедра биохимии и молекулярной биологии ЛФ – Москва: 2020

Приложение

Влияние температуры на активность фермента – амилазы слюны:

Рис.1 1пробирка t-100 ˚С; 2 пробирка t-40 ˚С

Рис.2 t-20 ˚С

Рис.3 t-0 ˚С

Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов:

Рис. 4 1 пробирка: крахмал и амилаза, раствор Люголя;

2 пробирка- амилаза , крахмал, хлорид натрия раствор Люголя,;

3 пробирка- амилаза , крахмал, сульфат меди(II), раствор Люголя

Влияние рН среды на активность амилазы слюны:

Рис. 5

РН- 6,2, РН - 7, РН– 8

Специфичность действия фермента – амилазы слюны

Рис.6 Действие раствора Люголя на сахарозу и амилазу слюны

Рис.7 Действие раствора Люголя на крахмал и амилазу слюны

Рис.8 Действие раствора Триммера на сахарозу (слева)

Рис.9 Действие раствора Триммера на крахмал (справа)

Влияние ингибиторов на активность фермента амилазы:

Рис. 10 Пробирка 1-крахмал, амилаза, спирт

Рис.11 Пробирка 2-амилаза, крахмал

Рис.12 Крахмал, амилаза, антибиотик

Рис. 13 Крахмал, амилаза

Рис.14 Крахмал, амилаза, лимонная кислота

Рис.15 Крахмал, амилаза,

Рис.16 Крахмал, амилаза, никотин

Рис.17 Крахмал, амилаза,

Влияние концентрации слюны на активность фермента:

Рис. 18 Концентрация слюны:

1:320, 1:160, 1:1:10

Просмотров работы: 147