XV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Изучение воздействия антибиотиков и бактериофагов для определения наиболее эффективного способа борьбы против болезнетворных бактерий

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Магомедова С.С. 1

---

1Негосударственное общеобразовательное частное учреждение "Центр образования" Международная гимназия в Новых Вешках"

Толстых С.В. 1

---

1Негосударственное общеобразовательное частное учреждение "Центр образования " Международная гимназия в Новых Вешках"

Работа в формате PDF

0.9 MB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение. К идее в выборе темы исследования меня подвёл просмотр ролика на YouTube «Эволюция бактерий в огромной чашке Петри»[6] о том, как врачи из Гарварда вырастили в чашке Петри супер-бактерию, способную размножаться даже в среде с тысячекратной концентрацией антибиотиков. Изучив некоторые материалы в сети [1], [2], [5], я убедилась в том, что, на самом деле в жизни такие бактерии существуют. В XXI веке появилась такая проблема мирового масштаба, как бессилие антибиотиков из-за появления бактерий, которые невосприимчивы ко всем известным антибиотикам. Из-за таких бактерий в Европе ежегодно умирает 25000 человек. Если не будут предприняты меры, то к 2050 году (в соответствии с прогнозами) может погибать до 10 млн. человек в год [3]. В апреле 2014 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) заявила о кризисе в сфере лечения антибиотиками и призвала специалистов обратить своё внимание на создание новых методов и препаратов, помогающих в противостоянии инфекциям, устойчивым к антибиотикам. На сегодняшний день замены антибиотикам нет. Одним из способов, который сейчас рассматривается, как альтернатива антибиотикам, являются бактериофаги- вирусы, способные избирательно поражать бактериальные клетки [3].  Мы решили провести своё исследование. Возможно, я стану врачом и буду лечить людей, используя новые современные способы и средства.Цель нашей работы –определить, кто эффективнее в борьбе с бактериальными инфекциями: антибиотик или бактериофаг путём выявления отличий в способах их действий.

Задачи исследования

Изучить и проанализировать материалы по теме.

Определить степень информированности обучающихся о таких понятиях, как антибиотики, бактериофаги, супер-бактерии.

Вырастить бактерии кишечной инфекции и провести сравнительный анализ способов воздействия на них различными антибиотиками.

Исследовать воздействие различной концентрации бактериофага на бактерии.

Провести сравнительный анализ способов действий антибиотиков и бактериофагов и определить наиболее эффективный способ.

Сделать выводы

Объект исследования: бактериофаг, антибиотики, кишечная супербактерия E. coli

Предмет исследования: способы воздействия антибиотиков и бактериофагов на вредоносную кишечную бактерию

Гипотеза: мы предполагаем, что антибиотики и бактериофаги по-разному воздействуют на болезнетворные организмы

Методы исследования:

-анализ источников информации по теме;

-анкетирование;

-визуализация;

-биологический метод выращивания бактерий E. Coli на твёрдой питательной среде [3];

-метод Грациа для определения оптимальной концентрации бактериофага [2];

-фотофиксация;

-эксперимент;

-сравнение.

Глава I. Из истории изучения и применения антибиотиков и бактериофагов способах их действий [3], [4]. 

1.1. Что такое антибиотики и как они действуют? [3], [4]. Каждому современному человеку знакомо слово «антибиотики». Открыты они были Александром Флемингом. Что же это такое? Антибиотики-это вещества природного или синтетического происхождения, которые подавляют способность бактерий к размножению или убивают их. Антибиотики используют для профилактики и лечения бактериальных инфекционных заболеваний: от случаев пищевого отравления до брюшного тифа, туберкулёза и т.д. Антибиотики начали активно использовать с сороковых годов, когда первый из них – пенициллин-стал поступать на фронты Второй мировой войны. Как часто бывает, военные события ускорили развитие медицины. Учёные всего мира стали открывать новые виды антибиотиков, более безопасные и сильные. Но с годами выявилась пугающая закономерность: оказалось, что бактерии обладают поразительной способностью к изменчивости и приобретению устойчивости и довольно быстро справляются со смертельными дозами антибиотиков. а глобальное использование этих полезных человечеству веществ привело к тому, что появление новых видов бактерий стало повсеместным и неконтролируемым. Сейчас во всём мире появляются бактерии, которые невосприимчивы ко всем известным антибиотикам.

1.2. Бактериофаги как альтернативные способы борьбы с болезнетворными микроорганизмами. Появился перспективный способ решения проблемы -это идея лечить инфекционные заболевания с помощью других микроорганизмов-бактериофагов [1], [2]. Идея эта возникла давно, на 20-30 лет раньше появления первого антибиотика пенициллина, но не вызвала должного интереса. Первым, кто обнаружил растворяющие клетки был российский микробиолог Н. Ф. Гамалея в 1897 г. во время исследования палочки сибирской язвы. Немного позже, в 1915 г., в Англии растворение стафилококка наблюдал микробиолог и бактериолог Фредерик Творт. Однако только в 1917г. Фелиск Дэ Эрель рассказал миру о бактериофагах как действительном научном открытии: используя эти вещества он смог излечить больного от дизентерии. Впоследствии ему удалось подтвердить результат и развить теорию о том, что бактериофаг, являясь паразитом бактериальной клетки, способен не только излечить больного, но и создать внутри его организма специфический иммунитет, который впоследствии может противостоять вредоносным бактериям. Обычно бактериофаги используют клетки для своего размножения, клетка тратит всю свою энергию на производство новых вирусов. После появления новых вирусов клетка становится полностью истощённой и не может больше существовать, она умирает, растворяясь в соседних тканях. Источниками бактериофагов являются: сточные воды, образцы почв, вода из природных водоёмов. Часто уникальный материал дают материалы, собранные во время экспедиций. Например, недавно совершенно новые бактериофаги были обнаружены в нижних слоях воды озера Байкал [3].

1.3. Как работают с антибиотиками и бактериофагами современные учёные?[3], [4]. К сожалению, столь многообещающее открытие бактериофагов не получило массового распространения. Скорее всего это связано с тем, что примерно в это же время были открыты антибиотики – значительно более дешёвый и технологичный способ борьбы с инфекционными заболеваниями. Антибиотики почти всегда действуют комплексно. Уничтожая целый ряд патогенных микроорганизмов. Бактериофаги же способны действовать узконаправленно и поражать только ту бактерию, для борьбы с которой они специализированы. И несмотря на то, что бактериофаги в отличие от антибиотиков, безвредны для организма человека и не затрагивают полезную микрофлору, а также их использование не приводит к появлению устойчивости у бактерий, их исследованием практически никто не занимался. И до сих пор условия рынка не позволяют развиваться этому направлению борьбы с бактериальными инфекциями. Кризис в лечении антибиотиками существует, но для проведения полного изучения бактериофагов фармацевтическим компаниям придётся потратить огромные суммы средств. Но нет ясности, вернутся ли инвестиции прибылью или нет. Обычные лекарственные средства, разработанные в крупных исследовательских лабораториях при фармацевтических заводах, приносят корпорациям огромную прибыль. Однако бактериофаги – это существующие в природе микроорганизмы, они не создаются с нуля, поэтому их невозможно запатентовать и зарабатывать на них состояния. Это-существенное противоречие не даёт заниматься в полной мере изучением и производством бактериофагов. Лишь отдельные группы учёных продолжают работать с бактериофагами. Болезни, которые лечатся фаговой терапией [3], [4]: большинство инфекционных заболеваний;заболевания, при которых действие осложнено из-за слабой циркуляции крови в зоне поражения, например, при ранениях;при аллергических реакциях на антибиотики;супербактерии, например, знаменитая E. coli, у которой развилась устойчивость к антибиотикам. Впервые массовое применение бактериофагов произошло в России во время наводнений в Краснодарском крае в 2012г. И в Хабаровском крае в 2013г. Благодаря бактериофагам медикам и спасателям удалось предотвратить эпидемию дизентерии, которая всегда сопутствует наводнениям [4]. Лечение пациентов бактериофагами очень специфично. Иногда врачи подбирают или создают новые виды бактериофага для лечения определённой инфекции или для определённого пациента. Иногда патогенные микроорганизмы развивают устойчивость к бактериофагу так же, как к антибиотику, и приходится создавать новые фаги, способные победить вредоносные бактерии. Для создания новых фагов фармацевты воспроизводят механизм, независимо и постоянно работающий в природе: бактерии мутируют, а в ответ на это появляются новые фаги. На создание фага в лаборатории нужно потратить несколько десятков дней, что в любом случае дешевле и быстрее поиска нового антибиотика, на разработку которого уходит около 10 лет.

Глава II. Исследование отличий в способах действий антибиотиков и бактериофагов на вредоносные организмы.

2.1. Анкетирование проводили среди респондентов начальной школы гимназии с 1 по 4 классы. Всего в анкетировании участвовало 68 человек.

Анкета

1.Что такое антибиотики?

вещества, которые убивают полезные для организма бактерии;

вещества, которые убивают вредные для организма бактерии;

вещества, которые убивают все бактерии в организме: и полезные, и вредные;

2. Что такое супер-бактерия?

бактерия предельно больших размеров;

бактерия, устойчивая к большинству антибиотиков;

бактерия, способная поглощать другие бактерии;

3. Бактериофаги –это…

грибы;

бактерии;

вирусы;

Цель анкетирования- определить степень информированности обучающихся о таких понятиях, как антибиотики, бактериофаги, супер-бактерии. При ответе на первый вопрос «Что такое антибиотики»? 9 человек (14%) считают, что это вещества, которые убивают полезные для организма бактерии. Ровно по 29 человек (т.е. по 43%) ответили, что это вещества, которые убивают вредные для организма бактерии и что это вещества, которые убивают все бактерии в организме: и полезные, и вредные.

< Рисунок 1 >

Из этого следует, что большая часть детей не знает, что антибиотики- вещества, которые убивают все бактерии в организме: и полезные, и вредные, хотя все, почти со 100% вероятностью не раз пропивали курс антибиотиков. Без них не обходится ни один человек. При ответе на второй вопрос «Что такое супер-бактерия?» 12 человек (18%) выбрали ответ, что это бактерия предельно больших размеров, всего лишь 9 человек (14%), что это бактерия, устойчивая к большинству антибиотиков, а это и был правильный ответ и 46 человек (68%) отметили в анкете, что это бактерия, способная поглощать другие бактерии, что является неверным ответом. Ответы на второй вопрос тоже говорят о незнании ответа на данный вопрос.

< Рисунок 2 >

На третий вопрос «Что такое бактериофаги» 15 человек (22%) ответили, что грибы, 28 человек (42%), что бактерии -24 человека (36%), что это вирусы.

< Рисунок 3 >

Вывод: большая часть респондентов не знает, что такое антибиотики, супер-бактерии и бактериофаги.

2.2. Исследование способа воздействия различных антибиотиков на кишечную супер-бактерию E. coli путём выращивания микроорганизмов на плотной питательной среде.

Эксперимент 1. Выращивание бактерий кишечной инфекции и сравнительный анализ способов воздействия на них различными антибиотиками [3].

В рамках данного эксперимента нам понадобилось следующее оборудование:

1.антибиотики-4шт.:гентамицин, стрептомицин, фосфомицин, тамифлю;

2.агар-агар-1 пачка- 10 г;

3.культура бактерии E. coli, нанесённая на бумагу;

4.пинцет-1шт.;

5.пипетка Пастера(1мл)-1шт;

6.пробирка со стерильной водой (15 мл)-1шт.;

7.шпатель-2 шт;

8.раствор бактериофагов-1шт.;

9. чашки Петри-3шт.;

10.шприц с иглой (5мл)-1шт.;

11. филе куриной грудки-400г.;

12. раствор для уборки хлорный-50 мл.;

13. перчатки

14. халат

 Для исследования способа подавления вредоносных организмов антибиотиками, мы провели эксперимент, используя биологический метод выращивания бактерий E. сoli на твёрдой питательной среде, с нанесением затем на заражённую среду антибиотиков с фотофиксацией и затем сравнением результатов на основании размеров подавления роста бактерий каждым из антибиотиков [3]. Для начала мы подготовили поле битвы, которая затем происходила втрёх чашках Петри:

1.чашка Петри с E. coli и дисками с антибиотиками;

2.чашка Петри с E. coli и бактериофагами;

3.чашка Петри с чистой культурой E. сoli.

1.Приготовили мясопептонный агар (МПА) и разлили его в чашки Петри.  Далее, соблюдая стерильность, вблизи горящих свечей, разлили в каждую чашку примерно по 15 мл.

2.Для нанесения бактерий на среду (посева) использовали суспензию бактерий-воду, в которой находились бактерии. В нашем случае бактерии- для длительного сохранения их жизнеспособности были иммобилизованы (прикреплены) на кусочки фильтровальной бумаги. Для изготовления суспензии бумажный диск с бактериями стерильным пинцетом поместили в пробирку со стерильной водой и встряхнули. Далее пипеткой Пастера набрали суспензию, добавили по несколько капель во все чашки Петри и осторожно растёрли шпателем.

< Рисунок 4 > < Рисунок 5 > < Рисунок 6 >

3.Чтобы увидеть, как работают антибиотики, поместили аккуратно прижав, по 7 дисков с антибиотиками №1-гентамицин, №2-стрептомицин, №3-фосфомицин и одну капсулу №4-тамифлю (один из современных препаратов от гриппа в России) в чашку Петри №1 на некотором расстоянии друг от друга. Антибиотики должны были по нашим предположениям попасть в среду вокруг диска, и бактерии не должны были вырасти в этих местах.

4.Чтобы увидеть, как работает бактериофаг, мы попробовали действовать таким же способом. Набрали в шприц 5 мл раствора бактериофагов и вылили его равномерным слоем на среду с бактериями в чашку Петри №2 и также осторожно растёрли шпателем

< Рисунок 7 > < Рисунок 8 > < Рисунок 9 > < Рисунок 10 >

5.Затем мы подождали, когда застынет агар, скотчем закрыли доступ в чашки бактериям из воздуха и поместили сами чашки в тёплое и сухое место, чтобы

температура была не менее 37°. В нашем случае-это место в ванной комнате с подогревом пола.

< Рисунок 11 >

Мы создали трёх условных пациентов, которых почти сразу заразили кишечной палочкой. Далее мы «назначили лечение»: одному «пациенту» была введена ударная доза антибиотиков, в «тело» другого подсадили фагов. Третий «пациент» («Контроль») остался без лечения. Наблюдения фиксировали. В течение трёх дней у нас не происходило роста бактерий ни в одной чашке. Мы увеличили температуру и уже на 4-й день увидели рост бактерий одновременно почти во всех чашках, но их было немного больше в чашке Петри №3, без лечения, что и следовало ожидать. Мы продолжили наблюдения, фиксирую рост бактерий 1 раз в два дня в течение 14 дней. В результате проведённого эксперимента, антибиотик 1-гентамицин, у которого зона подавления роста бактерий оказалось больше, является наиболее агрессивным по отношению к бактерии E. coli. У антибиотика 3-фосфомицина не возникло зоны подавления, что свидетельствует о том, что он не оказывает никакого воздействия на данный вид бактерий. Среднюю степень воздействия дали антибиотик 2-стрептомицин и бактериофаг. У антибиотика 3-фосфомицина не возникло зоны подавления. Следует отметить, что в чашке №3 «Контроль». т.е. у пациента, который остался без лечения, заселение бактерий шло неравномерно, а от периферии к центру, что может свидетельствовать о не герметичности чашки. Предположительно, бактерии из воздуха проникли внутрь и начали заселение описанным выше способом.Неожиданным оказался результат работы бактериофага. Мы рассчитывали на то, что действие бактериофага будет

сильнее, чем антибиотиков, но, проанализировав результаты, поняли, что всё закономерно и что приготовленная среда для проверки работы антибиотиков совсем не подходит для работы бактериофагов.

Таблица 1. Выращивание бактерий кишечной инфекции и сравнительный анализ способов воздействия на них различными антибиотиками.

< Рисунок 12 >Чашка №1 < Рисунок 13>Чашка №2 < Рисунок 14>Чашка №3

Вывод: эффективнее в борьбе с кишечной палочкой показал себя антибиотик №1-гентамицин, так как у него самая большая зона подавления роста E. coli. Среднюю степень воздействия дали антибиотик 2-стрептомицин и бактериофаг. Слабую степень воздействия наблюдали у антибиотика 4-тамифлю. У антибиотика 3-фосфомицина не возникло зоны подавления

2.3. Эксперимент 2. Исследование способа воздействия различной концентрации бактериофага на кишечную супер-бактерию E.coli путём смешения и суспензии бактерий и раствора с бактериофагами.

В рамках этого эксперимента нам понадобилось следующее оборудование:

1.агар-агар-1 пачка- 10 г;

2.культура бактерии E. coli, нанесённая на бумагу;

3.пинцет-1шт.;

4.пробирка со стерильной водой (15 мл)-1шт.;

5.пробирки с закручивающейся крышкой стерильные (15 мл)-5шт.;

6.раствор бактериофагов-1шт.;

7. чашки Петри-5шт.;

8. шприц с иглой (5мл)-6шт.;

9. филе куриной грудки-400г.;

10. раствор для уборки хлорный-50 мл.

Для исследования способа подавления вредоносных организмов бактериофагами, мы провели эксперимент, используя однослойный метод Грациа по выращиванию бактерий с одновременным соединением раствора бактерий с раствором фага различной концентрации из разных пробирок в одной чашке Петри для определения оптимальной концентрации. Приготовили стерильные чашки Петри и стерильные пробирки с закручивающимися крыщками. Все дальнейшие действия производили также в условиях стерильности, при горящих свечах.

1.Выливали среду с бактериями на среду с бактериофагами в чашки Петри следующим образом: разливали МПА в количестве по 5 мл каждый раз (всего 10) в две пробирки и, не дожидаясь, пока он застынет, помещали каждый раз в первую пробирку по 1 мл суспензии бактерий, а вот во вторую, третью, четвёртую и пятую пробирки растворы бактериофагов с увеличивающейся каждый раз концентрацией, соответственно 1мл, 2мл, 3 мл, 4мл и 5мл.

2. Равномерным слоем быстро выливали в чашки Петри сначала по 1мл. МПА с суспензией, а затем быстро добавляли содержимое пробирок МПА с разными концентрациями бактериофагов в каждую из пяти пробирок.

<Рисунок 15> <Рисунок 16> <Рисунок 17> <Рисунок18>

3.Затем поступили также как в предыдущем опыте с чашками Петри, когда МПА застыл. Наблюдения вели и фиксировали в виде фото также в течение двух недель.

Получилось, что мы создали уже пять условных пациентов, которых заразили кишечной палочкой, но теперь мы не сверху, не на застывший МАП с суспензией бактерий, как в предыдущем опыте, нанесли раствор бактериофагов, а получается, что, как- будто в «тело больных» подсадили фагов с разной концентрацией, т.к. ещё расплавленные МАП с фагами выливали на такие же расплавленные суспензии с бактериями кишечной палочки.

Таблица 2. Исследование воздействия различной концентрации бактериофага на бактерии

< Рисунок 19 > < Рисунок 20 >

Результаты перед вами. Вывод: эффективность воздействия бактериофага на супер-бактерии прямо пропорциональна концентрации раствора. Подбираю точную концентрацию, можно получить полное растворение болезнетворных бактерий.

Выводы

1.Микробиологическое исследование показало, что антибиотики и бактериофаги по-разному действуют на бактерии кишечной палочки.

2.Слишком много факторов влияют на результат экспериментов: условия стерильности, температура, точность концентрации, а также особенность приготовления среды.

3.В нашем случае только один антибиотик, а это 25 % быстрее поразили кишечную палочку. Три антибиотика - 75% менее эффективны или совсем не эффективны в борьбе с болезнетворными микроорганизмами (на примере супер-бактерии E. coli).

4. Наиболее эффективен был бактериофаг, который быстрее антибиотиков поразил кишечную палочку и не дал даже возможности развиться вредоносным бактериям, растворив их.

Заключение

Исходя из вышеизложенного можно утверждать, что цель работы достигнута: мы выявили отличия в способах действий антибиотиков и бактериофагов и определили, что наиболее эффективный способ борьбы с инфекциями в настоящее время - это бактериофаги. Наша гипотеза подтвердилась полностью. Вместе с тем, подбирая правильный тип антибиотика или концентрацию бактериофагов, можно победить вредоносные супер-бактерии.Проведя исследование, мы ознакомили с его результатами гимназическое сообщество. В будущем хотелось бы продолжить работу по изучению бактериофагов как альтернативы антибиотикам.

Список литературы и интернет-источников

1.Боргоякова М. Б., Ильичев А.А. «Бактериофаги». Практикум по молекулярной вирусологии: Учеб. -метод. пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2013- 34 с.

2.Иконникова Н.В. «Бактериофаги- вирусы бактерий: учеб. пособие. - Минск: ИВЦ Минфина, 2017- 41 c.

3.Максимова Е.Б., Бондаренко ФВ., Ивлев А.С., Кудряшов Е.С. МодульГид «Медицинские биотехнологии». – СПб.: Школьная лига, 2017. -32с.

4.Максимова Е.Б., Бондаренко ФВ., Кудряшов Е.С. STA-Ведение «Медицинские биотехнологии». – СПб.: Школьная лига, 2017. -16с.

5.Щербенков И.М. Бактериофаги. Что мы знаем о них? Медицинский Совет. 2013(2-3):56-63с

6.Эволюция бактерий в чашке Петри [Электронный ресурс] www.youtube.com/watch%3Fv%3DplVk4NVIUh8