XVI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке. Летняя площадка 2022
Выявление организмов, способных к биоремедиации
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
ВВЕДЕНИЕ
Значение очистки окружающей среды возрастает в «эпоху пластика». В настоящий момент человек не может обойтись без настолько удобного и дешевого материала. Из-за большого спроса мир не может полностью отказаться от пластика, а его безопасная переработка довольно дорогая, из-за чего не каждая компания занимается этим. Из-за неразлагающегося материала страдает экология, что приводит к необратимым последствиям. Именно поэтому ученые занимаются разработкой комплексов экологических методов очистки окружающей среды, что зовется биоремедиацией.
В нашем проекте мы провели несколько экспериментов по выявлению живых организмов, которые способны к биоремедиации и могут помочь с проблемами человечества в экологическом плане.
Объект исследования- плесневелые грибы, почвенные бактерии
Актуальность:
На сегодняшний день проблемы экологии входят в топ 10 проблем человечества. Из-за большого количества пластика и мусора, плавающего в океане, многие животные подвержены вымиранию. Существующий процесс переработки трудоемкий, а также распространяется не на все виды пластика.
Многие современные ученые заинтересованы в биоремедиации, и стараются как можно быстрее расширить данный комплекс, чтобы в будущем использовать для экологичной переработки пластиковых остатков. Очень важно развивать данную тему, чтобы как можно быстрее помочь нашей экологии.
Гипотеза:
Если на чашках Петри прорастут колонии плесени и почвенных бактерий, то они способны к разложению пластика.
Методы изучения:
1. Теоретический
2. Эксперимент
3. Наблюдение
4. Анализ результатов
5. Сравнение
Цели данного проекта:
Выявить биологические объекты из плесени и почвы, которые были бы способны к очистке окружающей среды с помощью своего метаболического потенциала.
Для реализации цели нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить несколько статей про биоремедиацию с помощью интернет-ресурсов и научной литературы.
2. Взять пробу плесневых грибов с 3ех образцов и изучить их за день.
3. Подготовить около 2ух граммов пластиковой стружки с помощью наждачной бумаги.
4. Приготовить питательную среду для посева плесневелых грибов и культивирования почвенных бактерий.
5. Вырастить плесневелые грибы на питательных средах с пластиком за неделю.
6. Культивировать бактерий из почвы на питательной среде за неделю.
7. Культивировать бактерий на питательной среде с пластиком за неделю.
8. Изучить результаты.
9. Сформулировать вывод.
Практическая значимость: биологические объекты можно будет использовать для экологичного уничтожения пластика. Такие бактерии можно размещать на дно мусорных баков, а также расселять на полигонах с мусором.
Дальнейшее развитие: узнать тип выросших бактерий и провести еще несколько опытов, доказывающих, что эти организмы способны к разложению пластика, приспособить бактерии к жизни в окружающей среде путем объединения гена цианобактерий и полученных нами бактерий.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Краткая информация о биоремедиации
Биоремедиация - комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов - растений, грибов, насекомых, червей и других организмов.
Использование растений:
Ризофильтрация -корни всасывают воду и химические элементы необходимые для жизнедеятельности растений.
Фитоэкстракция - накопление в организме растения опасных загрязнений (например, тяжёлых металлов).
Фитоволатилизация - испарение воды и летучих химических элементов (As, Se) листьями растений.
Фитостабилизация - перевод химических соединений в менее подвижную и активную форму (снижает риск распространения загрязнений).
Фитодеградация - деградация растениями и симбиотическими микроорганизмами органической части загрязнений.
Фитостимуляция - стимуляция развития симбиотических микроорганизмов, принимающих участие в процессе очистки.
Использование микроорганизмов и грибов:
Биостимуляция - стимулирование развития аборигенной микрофлоры на территории, подвергшейся загрязнению.
Биодополнение - внесение в почву биопрепаратов микроорганизмов, способных к деградации загрязнителя.
Преимущества:
Возможность произведения ремедиации in situ.
Относительно низкая себестоимость проводимых работ по сравнению с традиционными очистными сооружениями.
Метод безопасен для окружающей среды.
Теоретическая возможность экстракции ценных веществ из зелёной массы растений (Ni, Au, Cu).
Возможность мониторинга процесса очистки.
Уровень очистки не уступает традиционным методам, особенно при небольшом объеме сточных вод (например, в деревнях).
Информация о Ideonella sakaiensis.
Ideonella sakaiensis - вид грамотрицательных бактерий из группы протеобактерий. Эти организмы стали известны благодаря своей способности быстро разлагать полиэтилентерефталат (ПЭТ) - пластик, который широко используется при производстве упаковок и тары. Ранее похожие свойства разлагать пластмассы были выявлены только у некоторых грибов, например, нитчатого гриба Fusarium oxysporum, который может расти на минеральной среде, содержащей нити ПЭТ, и Pestalotiopsismicrospora, способного поглощать полиуретан.
Ideonella sakaiensis -грамотрицательные аэробные неспорообразующие бактерии палочковидной формы. Клетки подвижны и несут полярный жгутик. Они содержат цитохромоксидазу и каталазу.
Японские ученые проанализировали 250 образцов почвы на прилегающей территории завода по переработке пластиковых бутылок из ПЭТ, и обнаружили, что из всех обитающих в этих условиях бактерий только один штамм способен полностью разрушать тонкую пленку из ПЭТ в течение 6 недель при температуре 30°C. Микроорганизм получил название Ideonella sakaiensis 201-Ф6.
Ученые отмечают, что действие ферментов Ideonella sakaiensis уникально в животном мире, а значит, данный вид микроорганизма мог сформироваться недавно ввиду быстрого приспособления к изменениям окружающей среды.
Клетки, обитающие на плёнке из ПЭТ, соединены друг с другом выростами, а более короткие выросты соединяют клетки и плёнки. Возможно, по этим выростам к плёнке доставляются ферменты, разлагающие ПЭТ.
Под действием бактериальных ферментов плёнка из ПЭТ значительно разрушалась и полностью разлагалась через 6 недель при температуре 30 °С.
Предполагаемый механизм разрушения ПЭТ бактериями Ideonella sakaiensis таков. Вначале внеклеточный фермент ПЭТаза (фермент, гидролизующий ПЭТ) разлагает ПЭТ до моно(2-гидроксиэтил)терефталевой кислоты (основной продукт) и терефталевой кислоты (побочный продукт). ПЭТаза Ideonella sakaiensis имеет лишь 51 % сходства аминокислотной последовательности с другим ферментом, способным гидролизовать ПЭТ - гидролазой бактерии Thermobifida fusca. Моно(2-гидроксиэтил)терефталевая кислота гидролизуется соответствующим ферментом (предполагаемым липопротеином) до терефталевой кислоты и этиленгликоля. Терефталевая кислота доставляется в клетку через специальный белок-переносчик и последовательно катаболизируется двумя ферментами до протокатеховой кислоты. Затем специальная 3,4-диоксигеназа разрушает ароматическое кольцо протокатеховой кислоты.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
2.1 Подготовление пластика
Оборудование: пластиковая бутылка, наждачная бумага, весы.
Практическая часть происходила на территории ДТ «Кванториум» под руководством Садыковой Джамили Зуфаровны.
Итак, в ходе исследовательской работы с помощью наждачной бумаги мы натерли пластиковую бутылку, чтобы в дальнейшем поместить стружку в питательные среды. Стружка пластика получилось весом 1.12 г. без погрешностей. (Приложения 1-3)
2.2 Приготовление питательной среды
Оборудование: чашка Петри, стеклянный стакан, железная ложечка, Агар-агар, картофель, термостат, настольная плита.
Исходные компоненты
1. Вода
2. Кусочек говядины
3. Агар-агар (Агар-агар — это полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей)
Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты – питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т. д.), поэтому их еще называют «средами для культивирования».
Для того, чтобы выросли колонии бактерий и плесневых грибов нам нужна питательная среда, в которой будут нужные вещества для их роста и развития. Процесс приготовления питательной среды заключался в следующих действиях:
В лаборатории мы налили в стеклянный стакан 80 мл чистой воды, положили в нее кусочек говядиныи поставили на 205 градусов Цельсия (через некоторое время увеличили до 350). Через несколько минут вода сильно потемнела, а еще через 5 минут уже начала кипеть. Когда мясо всплыло на поверхность- основа была готова. Вытащив мясо, мы убавили температуру.
Для эксперимента мы загустили основу с помощью агар-агара, а также добавили стружку пластика, помешивая все железной ложечкой, чтобы избежать комки.
Когда жидкость была готова, мы перелили ее в чашки Петри и оставили до полного остывания. (Приложения 1-6)
2.3 Изучение образцов плесени
Всего у нас было три образца: черная плесень со стен, плесень на картофеле и плесень от прошлых экспериментов. Под бинокулярным микроскопом мы рассмотрели каждый образец.
Известно, что черная плесень растет в влажных и теплых местах. Она не поражает продукты питания, поэтому мы считаем, что углерод и другие нужные ей вещества она получает из пластика и подобных ему компонентов. (Приложения 7-9)
2.4 Посев плесневых грибов на питательную среду
Когда вещество остыло, мы, с помощью микробиологической петли, взяли образцы каждой плесени и рассеяли на питательных средах. Между взятием пробы, мы накаливали ушко с помощью горелки, соблюдая инструкцию безопасности. Питательные среды со спорами плесени мы поместили в термостат, где температура не превышала 37 градусов Цельсия. (Приложения 10-12; 17-18)
2.5 Культивирование почвенных бактерий
Взяв почву, мы поместили ее в воду и трясли около 1 минуты. Так в воде остались нужные нам организмы. Взяв мерный стакан, мы налили туда воды, а после добавили воду из пробирки с бактериями. Микробиологическую петлю мы нагрели над горелкой, а после опустили в воду с бактериями и расселили их на питательной среде без пластика на основе мясного бульона. Эту питательную среду мы так же поместили в термостат, где температура не превышала 37 градусов Цельсия. (Приложения 13-16; 17-18)
2.6 Окрашивание бактерий по методу Грама
Через неделю на питательных средах с плесенью выросли колонии бактерий. Самих же плесневых грибов не оказалось, что значит- плесень не способна разлагать пластик. На питательной среде с бактериями также выросли бактерии. (Приложения 19-25). Рассмотрев все образцы под бинокуляром, мы решили узнать какие это бактерии. На предметное стекло мы капнули воды, после чего взяли образец с помощью микробиологического ушка. Распределив бактерии, мы зафиксировали микропрепарат, высушив его над горелкой. На зафиксированный мазок мы нанесли карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового. Когда прошла минута, мы нанесли раствор Люголя и подождали еще 30 секунд.
После этого мы промыли под водой, а после обесцветили этиловым спиртом, пока не прекратились отхождение фиолетовых струек фиолетового. Промыв еще раз водой, мы докрасили водным раствором фуксина, который смыли водой по истечению одной минуты. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный. (Приложения 26-34)
Полученные зафиксированные микропрепараты мы рассмотрели под микроскопом. На образцах с черной плесень. и плесенью с прошлых экспериментов выросли спорообразующие бактерии, которые способны к термоустойчивости в неблагоприятных условиях. Можно сделать вывод о том, что получившимся бактериям трудно выживать в условиях, которые мы создали, но при этом они способны к этому. Из этого следует, что выращенные нами бактерии способны к разложению пластика. (Приложения 35-38)
2.7 Посев почвенных бактерий на питательную среду с пластиком
Приготовив питательную среду с пластиком на основе мясного бульона, мы налили ее в чашку Петри и стали ждать ее остывания.
Параллельно с этим, с помощью микробиологической петли, мы поместили бактерии в дистиллированную воду.
Когда питательная застыла, с помощью продезинфицированной трубочки мы проделали пять отверстий, куда налили раствор с бактериями. После выполненной работы мы поставили образец в термостат на неделю. (Приложения 39-42)
РЕЗУЛЬТАТЫ
Спустя неделю бактерии на питательной среде с пластиком проросли и образовали несколько разных колоний. Из-за аварийного отключения света на территории проведения эксперимента нам пришлось переделать питательную среду, но уже без лунок.
Колонии бактерии, которые выросли на питательной среде с пластиком доказывают, что питательных веществ из окружающей среды и состава пластика достаточно для их выживания. (Приложение 43)
ВЫВОД
Путем проведения нескольких экспериментов, мы выяснили, что плесень, которую мы взяли для опыта, не способна расщеплять пластик. Почвенные бактерии показали хороший результат. Так же интересно то, что бактерии, которые выросли вместо плесени, так же способны к выживанию в не самых благоприятных условиях и, возможно, тоже могут разлагать пластик.
Поставленная цель, о выявлении биологических объектов, которые способны к биоремедиации, выполнена, наша гипотеза подтвердилась.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
«IDEONELLA SAKAIENSIS – БАКТЕРИЯ, ПИТАЮЩАЯСЯ ПЛАСТИКОМ» [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://polymer.by/news/ekologiya/ideonella-sakaiensis-bakteriya-pitayushchayasya-plastikom/
«Ideonella sakaiensis» [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://ru.wikipedia.org/wiki/Ideonella_sakaiensis
«Сколько лет разлагается пластик и эффективна ли его переработка?» [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://trends.rbc.ru/trends/green/609d07649a7947794e789e2c
«Биоремедиация» [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B8%D0%BE%D1%80%D0%B5%D0%BC%D0%B5%D0%B4%D0%B8%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1
Приложение 2
Приложение 3
Приложение 4
Приложение 5
Приложение 6
Приложение 7
Приложение 8
Приложение 9
Приложение 10
Приложение 11
Приложение 12
Приложение 13
Приложение 14
Приложение 15
Приложение 16
Приложение 17
Приложение 18
Приложение 19
Приложение 20
Приложение 21
Приложение 22
Приложение 23
Приложение 24
Приложение 25
Приложение 26
Приложение 27
Приложение 28
Приложение 29
Приложение 30
Приложение 31
Приложение 32
Приложение 33
Приложение 34
Приложение 35
Приложение 36
Приложение 37
Приложение 38
Приложение 39
Приложение 40
Приложение 41
Приложение 42
Приложение 43