XVI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке. Летняя площадка 2022
Получение и свойства экстракта Bacillus velezensis
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Актуальность темы.
Разработка противомикробных препаратов, необходимых для борьбы с заболеваниями растений, животных и человека, является одним из перспективных направлений фармацевтической индустрии и сельского хозяйства. В настоящее время ведется поиск и изучение новых штаммов бактерий рода Bacillus, продуцирующих широкий спектр биологически активных веществ и проявляющих антагонистические свойства в отношении патогенных бактерий и грибов Антагонистическая активность бактерий Bacillusvelezensis [1].
Ризобактерии (plant growth hоromotingrizo bacteria, PGPR) (J. W. Kloepper, 1980) влияют на многие метаболические процессы в растении, связанные с их ростом и иммунитетом [1, 2]. Супрессивные качества бактерий рода Bacillus по отношению к широкому списку фитопатогенов обусловлены способностью продуцировать множество вторичных метаболитов различной химической природы. Изучение механизмов биологической активности бактерий-антагонистов фитопатогенов способствует целенаправленному отбору штаммов для создания микробиологических препаратов. B. velezensis продуцирует большое количество антимикробных метаболитов: липoпептиды, полипептиды, ферменты, непептидные соединения. [2]
Bacillus velezensis способна вступать в плотный контакт с корневой системой растений и продуцировать широкий спектр биологически активных соединений, обеспечивающих подавление патогенов и стимулирующих рост и развитие растения [1]. В геноме микроорганизмов данной таксономической группы присутствует большое число хромосомных локусов, определяющих синтез антимикробных соединений разной химической природы, образование которых в клетке происходит без участия рибосом. Это липопептиды (сурфактин, фенгицин и бацилломицин), поликетиды (макролактин, бациллен, диффицидин/оксидиффицидин), дипептид бацилизин и сидерофор бациллибактин. Помимо этого, отдельные представители Bacillus velezensis способны синтезировать полипептид/поликетид с неизвестным химическим составом, а также бактериоцины [2]. Благодаря способности подавлять широкий круг патогенов (бактерии, грибы, вирусы) данные бактерии применяются в качестве основы безопасных для окружающей среды биопрепаратов при получении сельскохозяйственной продукции. В хозяйствах Pеспублики Беларусь широко используется созданный на основе бактерий B. velezensis БИМ В-439Д зарегистрированный биопестицид Бетапротектин, эффективно снижающий поражение сахарной и столовой свеклы кагатной гнилью, огурцов и томатов прикорневой гнилью, сосны обыкновенной диплодиозом [3].
Исследование проводилось на базе научно-исследовательской лаборатории антимикробной резистентности Института экологической и сельскохозяйственной биологии (X-BIO) г. Тюмень
Цель: определить влияние экстракта бактерии Bacillus velezensis на грамположительные и грамотрицательные бактерии
Задачи:
Оценить пробиотический потенциал экстракта бактерии Bacillus velenenzis.
Выявить способности производить противомикробные соединения
Установить способность штамма адаптироваться к различным средам обитания
Определить значение экстракта бактерии Bacillus velezensis с точки зрения биотехнологической применимости.
Гипотеза:
Bacillus velezensis— аэробная, грамположительная, формирующая эндоспоры свободноживущая почвенная бактерия, перспективная для разработки биопестицидов, способных подавлять развитие широкого спектра патогенов растений, в том числе бактерий, грибов и нематод.
Материалы и методы:
В качестве сырья для получения экстракта использовали штамм почвенной бактерии Bacullisvelezensis Х - BIO - 1.
Штамм почвенной бактерии Bacullisvelezensis был получен по методике,
разработанной сотрудниками института Экологической и сельскохозяйственной биологии Х - BIO – 1, лаборатории Антимикробной резистентности г. Тюмень.
Приготовление Luria-Bertani (LB) среды для культивирования Bacullisvelezensis Х - BIO – 1:
-пептон дрожжевой порошок – 5г;
- экстракт дрожжевой ультрафильтрованный (порошок) – 2,5 г
- NaCl - 2,5 г
К навеске добавляем 500 мл H2O и перемешиваем на магнитной мешалке Dainas Saintific при 1500 об/мин до однородной среды. Среда стерилизуется в автоклаве при 121 0С в течении 15 минут. После стерилизации охлаждаем среду до 30 0С.
Петлей, обработанной в пламени горелки, захватываем культуру Bacullisvelezensisи помещаемв среду LB. Культивируем на термошейкере Innova 44 в течение 2 суток, при t = 28 0С.
Для проверки активности культуральной жидкости отбираем 500 мкл культуры в пробирки типа эппендорф (2 мл) и центрифугируем при 15000 об/мин 30 минут 0t = 20 0С. Клетки бактерий оседают на дно, сверху – супернатант.
Супернатант фильтруем через фильтры Мillex GV (размер пор 0,22 мкм).
В чашку Петри, содержащую тест-штамм (Staphylococcus aureus) в 0,75% (агар) LB, вносим 10 мкл культуральной жидкости (2 повторности), сушим культуральную жидкость до полного высыхания и помещаем в термостат на 5 ч. t = 37 0С до появления зоны задержки роста культуры (Staphylococcusaureus). В зоне, где находилась культуральная жидкость, рост стафилококка был угнетен.
500 мл культуры Bacillusvelezensis центрифугируем при 11 000 об/мин в течение 40 минут, в трех повторностях. Каждый раз емкости меняем на чистые.
Полученную культуральную жидкость фильтруем через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
Отфильтрованную культуральную жидкость смешиваем с этилацетатом в соотношении 1:1 и в течение 1 часа перемешиваем на магнитной мешалке. В течение этого времени происходит перемешивание культуральной жидкости с органическим растворителем – этилацетатом.
Полученный экстракт помещаем в делительную воронку на 3 часа, в которой происходит разделение раствора на две фазы: верхняя - этилацетат с экстрагированными веществами; нижняя – культуральная жидкость после экстракции.
Этилацетат с экстрагированными веществами вновь центрифугируем (в фальконах по 30 мл) 6000 об/мин 10 минут.
Чистый этилацетат выпариваем досуха. (весь этилацетат выпарится, а метаболитные вещества останутся на стенках колбы. Затем в колбу добавляем 5 мл ацетонитрила (СН3СN). Ацетонитрил используется в качестве растворителя. 5 мл полученного экстракта перемещаем в пробирку типа эппендорф и замораживаем в жидком азоте (t = -80 0С). В крышке пробирки делаем отверстие. Пробирку после заморозки помещаем на лиофильную сушку. 24 часа в вакууме, при t = -85 0С. Образец после лиофильной сушки сохраняет активность.
Высушенное вещество растворяем в 1мл 100% ДМСО (диметилсульфоксид)
Для оценки антимикробной активности полученного экстракта, тестируем его на Грамположительных и Грамотрицательных бактериях. Для этого заливаем чашки Петри средой 0,75% (агар) LB + 50 мкл тест-культуры (в 4 повторностях). В качестве тест-культур были использованы: Escherichiacoli, Fusariumsolani, выращенные на картофельно - глюкозном агаре.
Растворенный в ДМСО экстракт, разбавляем в 10 раз Н2О (дист.). По 10 мкл капаем в чашку с тест – штаммами. После высыхания капель помещаем чашки Петри с тест – штаммами в термостат на 5 ч:
- Escherichia coli - t = 37 0С
- Fusarium solani - t = 28 0С, 5 дней.
Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК). МИК определяли для Escherichiacoli (грам -). В качестве вещества, подавляющего метаболическую активность бактерий, использовали экстракт, полученный из Bacullusvelezensis. Экстракт с концентрацией 44 мг/мл разбавили в 10 раз, концентрация стала равна 4.4 мг/мл. Экстракт с концентрацией 4.4 мг/мл развели методом двукратных серийных разведений. Опыт ставим с каждой культурой в трех повторностях.
В начале в 96-луночный планшет вносим чистую среду по 80 мкл (с 1 по 12 лунки). Далее вносим по 10 мкл экстракта (разведен методом двукратных серийных разведений) с 1 по 10 лунки. 11 лунка – это контроль (среда бульон для питания LB + культура), 12 – бланк (только чистая среда LB).
Перед внесением культуры доводим оптическую плотность до стандартного значение (0,015-0,016). Оптическую плотность (OD) определяли на спектрофотометре, OD исследуемой культуры измеряли против контроля (только чистая среда LB).
Далее в 96-луночный планшет, в котором уже содержатся среда и экстракт, вносим по 10 мкл культуры с установленным OD. Культуру вносим в лунки с 1 по 11.
Заклеиваем планшет парафилмом и убираем в термостат на 37 0С на 24 часа.
Через 24 часа планшет с исследуемыми культурами помещаем в спектрофотометр.
Определяли минимальную ингибирующую концентрацию для исследуемых культур.
Таблица 1. Результаты микротитрования экстракта культуральной жидкости Bacillusvelezensis(определениеМИК). Показатели оптической плотности клеточных суспензий при их росте с разными концентрациями исследуемого вещества.
|
концентрация мкг/мл |
440 |
220 |
110 |
55 |
27,5 |
Контроль |
Бланк |
|
Escherichia coli |
0,04 |
0,15 |
0,44 |
0,50 |
0,57 |
0,54 |
0,04 |
Рис.1 Показатели оптической плотности клеточных суспензий при их росте с разными концентрациями исследуемого вещества в мкг/мл
Выводы:
Тестирование экстракта Baculisvelezensis, позволили качественно зафиксировать антимикробную активность экстракта культуральной жидкости Bacillusvelezensis.
Количественное выражение антимикробной активности экстракта культуральной жидкости Bacillusvelezensis было получено в опыте по определению значений минимальной ингибирующей концентрации в опыте по микротитрованию в планшете. Экстракт Bacillusvelezensis был протестирован на грамотрицательных бактериях, таких как Escherichiacoli, соответственно. Минимальная ингибирующая концентрация в отношении эшерихий составила 4,4 мг/мл. Экстракт Bacillusvelezensis оказывает антимикробное воздействие преимущественно на грамотрицательные бактерии.
В дальнейшем планируем определить минимальную биопленкообразующую концентрацию (МБК).
Литература:
Антагонистическая активность бактерий bacillusvelezensis автореферат бакалаврской работы
Хроматографические профили антигрибных экзо- и эндометаболитов бактерий bacillus velezensi Таврический вестник аграрной науки *№ 2(26) *2021
Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 4, стр. 366-377. Молекулярно-генетический и функциональный анализ генома бактерий bacillus velezensis бим в-439д.
Садунова, А. В. Общая характеристика бактерий рода Bacillus [Электронный ресурс]: http://scienceforum.ru/2014/article/2014001198 (дата обращения 29.05.2020). Загл. с экрана.
Аэробные спорообразующие бактерии. Род бациллус (Bacillus) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://molbiol.ru/wiki.
Яковлева, О. В. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus
Cohn продуценты поверхностно активных веществ: дис. … канд. биол. наук: 03.00.07: защищена 10.02.2005 : утв. 21.11.2006 / Ольга Валерьевна Яковлева;науч. рук. Л. Ю. Кузьмина; Ин-т биологии Уфим. науч. центра РАН – Уфа, 2004
– 117 с.
Приложение