XVII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Адаптация растений груши и сливы в культуре in vitro в лабораторных условиях

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Захарченко Т.С. 1

---

1ГУО "Гимназия г. Пружаны"

Саскевич Н.С. 1

---

1ГУО "Гимназия г. Пружаны"

Работа в формате PDF

107.5 KB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Плодовые и ягодные растения являются важными пищевыми культурами. Стоимость их мирового валового продукта превышает стоимость картофеля и уступает только зерновым культурам [6].

Косточковые культуры, такие как слива, достаточно широко распространены на территории Западной и Восточной Европы. Однако систематическое повреждение деревьев неблагоприятными факторами окружающей среды, неконтролируемое размножение опасных вредителей и болезней привело к тому, что площади под ними значительно сократились [3].

Основные требования к подвоям следующие: экологическая приспособленность к природным условиям района их использования, особенно устойчивость к неблагоприятным факторам, ограничивающим культуру плодовых растений в данной местности, хорошая совместимость с прививаемыми сортами, способность благоприятно воздействовать на производственные качества культурных сортов привоев или, по меньшей мере, не снижать их. Лучшие подвои должны отвечать всем требованиям.

Семечковые культуры имеют подвои как семенного происхождения (сеянцы диких видов и культурных сортов), так и вегетативно размножаемые.

Клоновые подвои ценятся за небольшие размеры деревьев привитых на них сортов. Они позволяют получать больший урожай с меньшей площади, слаборослые (карликовые и полукарликовые) подвои сокращают вступление в пору плодоношения привитых деревьев по сравнению с сильнорослыми семенными на 2-4 года [10].

Наряду с традиционными методами вегетативного и генеративного размножения растений существует относительно новый метод клонального микроразмножения. Микроклональное размножение – массовое бесполое размножение растений в культуре тканей и клеток, когда возникающие формы растений генетически идентичны исходному экземпляру [1].

При размножении подвоев традиционными способами требуется 2-3 года. При использовании методов клонального микроразмножения этот период сокращается при необходимости до 1 года, при этом при использовании в качестве эксплантов апикальной меристемы возможно оздоровление растений. Культура in vitro в сочетании с другими методами оздоровления, такими как термотерапия, позволяет получить безвирусные растения даже при размножении инфицированных растений, что очень важно вследствие широкой распространённости болезнетворных вирусов на этой культуре [11].

Актуальность исследования.

В настоящее время биотехнологические разработки вносят все более существенный вклад в решение комплексных проблем сельского хозяйства [5].

Производство оздоровленного посадочного материала необходимо для поддержания высокой стабильной продуктивности сортов и здорового фитосанитарного состояния растений, основано на отборе, тестировании, оздоровлении исходных растений, их последующем размножении в контролируемых условиях [7].

Несмотря на высокую стоимость посадочного материала, размноженного в культуре in vitro, во всём мире маточники закладываются именно такими саженцами. Высокое качество таких маточников оправдывает затраты, они окупаются при последующей эксплуатации маточника [11].

Изменение характеристик вегетативного и генеративного развития растений, полученных в культуре in vitro, отмечается исследователями для большинства культур. В немногочисленных исследованиях косточковых культур отмечается, что продуктивность черенкового маточника увеличивается в 1,5-2 раза [3].

Требования, предъявляемые к выращиванию супер-суперэлитных насаждений плодовых культур, определяют необходимость изучения специфики культивирования растений в условиях in vitro и в открытом грунте [3].

Объекты исследований – клоновые подвои:

сливы – Julien GF655/2, ВПК-1;

груши – S₁, 2.31, BA-29.

Цель исследований: разработать элементы технологии адаптации клоновых подвоев груши и сливы in vitro.

Задачи исследований:

1. Изучить влияние температуры как абиотического фактора на адаптацию растений-регенерантов;

2. Изучить влияние субстрата на адаптацию растений-регенерантов;

3. Выяснить влияние света и влажности на адаптацию растений-регенерантов к естественным условиям.

Методы исследования:

- метод верхушечных меристем, наблюдение, сравнение и анализ.

Время проведения опыта: 2021-2022 г. г.

Место проведения: лаборатория биотехнологии РУП «Брестская ОСХОС НАН

Беларуси».

Глава 1. Основная часть

Современное сельскохозяйственное производство требует широкого использования высокотехнологических приемов. С помощью методов биотехнологии можно получить здоровый посадочный материал большинства плодовых культур, свободный от вирусов, устойчивый к бактериозам и грибковым инфекциям. Клональное размножение растений – надежный способ получения идентичного и оздоровленного потомства, который можно использовать для быстрого увеличения популяции ценных гибридов и новых перспективных сортов [1].

Процесс оздоровления посадочного материала при использовании методов культуры изолированных тканей и органов является комплексным, т.е. позволяет освободиться с определенной вероятностью от вирусов, некоторых грибковых заболеваний и нематодной инвазии. Особенно ценным качеством этого метода является возможность освобождения от термостабильных вирусов и вирусов, находящихся в латентном состоянии [11]. Кроме того, при размножении подвоев традиционными способами требуется 2-3 года, при использовании клонального микроразмножения этот период можно сократить до одного года, и при этом возможно оздоровление растений [10]. Данный способ размножения растений позволяет быстро размножить единичные элитные растения, используя небольшое лабораторное пространство. Можно длительно хранить и легко пересылать растения на большие расстояния без опасения передачи карантинных болезней [7].

Однако внедрение его в производство сдерживают такие обстоятельства, как сложность подбора питательных сред с учетом индивидуальных особенностей размножаемых растений, проблема стерильности помещений, сред, растительного материала, трудоемкость выполнения отдельных операций, высокая стоимость оборудования, реактивов, материалов [11]. Метод микроклонального размножения требует больших затрат ручного труда, при этом более 50 % времени тратится на работы не связанные с растительным материалом [2].

Метод микроклонального размножения растений in vitro основан на снятии апикального доминирования под действием веществ цитокининовой группы [9].

Процесс микроразмножения растений состоит из ряда последовательных этапов, каждый из которых имеет свою значимость и создает определенные проблемы. Первым этапом является отбор эксплантов и введение их культуру.Верхушечные почки, взятые от материнских растений, очищают от кроющих чешуи, поверхностно стерилизуют 70 % этанолом 8 секунд и промывают в течение часа проточной водой. В ламинар-боксах почки стерилизую 0,1 % раствором сулемы или 0,01 % раствором мертиолата в течение 3 мин. при активном перемешивании стерилизующего раствора. Затем проводится двукратная промывка авто-клавированной дистиллированной водой в течение 7 минут. Применение двойной стерилизации снижает процент инфицирования искусственной среды. Вычленение верхушечной меристемы проводится с использованием микроскопа МБС-9, при 24-48 кратном увеличении, применяя набор микроинструментов, созданных в лаборатории. Апексы размером в 250-300 мкм высаживаются в 16-мм. пробирки, содержащие 10 мл. питательной агаризованной среды на основе минеральных солей по Мурасиге-Скуга с добавлением 2 % сахарозы без добавок витаминов и веществ цитокининовой группы. Через 1-1,5 недели, тронувшиеся в рост апексы пересаживаются на среду, содержащую аскорбиновую кислоту -1,0 мг/л, пиридоксин, тиамин и никотиновую кислоту - 0,5 мг/л, гликокол-10 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л, сахарозу -30 г/л, 6-БАП - 0,2 - 2,0 мг/л в зависимости от пассажа. Пробирки с апексами помещаются в культуральную комнату с верхнебоковым освещением лампами ЛДЦ-80, ДДЦ-40, ЛФР-180. Освещенность в пределах 2,5 - 4,0 тыс. люкс при 16-часовом световом дне и относительной влажности 90 - 95 %. Температура днем 26°С, ночью 24°С. Заданные режимы поддерживаются автоматически. Образовавшиеся конгломераты почек пересаживаются без разделения в колбы объемом 100 - 200 мл, содержащие 50 мл агаризованной питательной среды.

Это наиболее затратный этап микроклонального размножения. Производительность мала, а потери большие. Промышленное микроклональное размножение часто сталкивается с бактериальным и грибным заражением эксплантов. Задача первого этапа не только получить стерильные экспланты, но и экспланты способные к дальнейшему росту [4].

Следующий важный этап культивирования микрорастенийinvitro – собственно микроразмножение. Задача микроразмножения – это получение не только наибольшего числа побегов, но и их оптимальной длины, Известно, что микрорастения короче 1 см укореняются хуже, чем более длинные. Значительные трудности возникают как на данном этапе, когда часто наблюдается витрификация тканей, так и при укоренении побегов in vitro и акклиматизации растений после пересадки в субстрат [8].

Акклиматизация растений к нестерильным условиям является последним этапом клонального микроразмножения invitro. Перенос в нестерильные условия сопровождается стрессом, так как растения должны приспособиться к новым водным, питательным и световым условиям, а также к патогенной нагрузке. Кроме того, у растений после культуры invitro отмечается уменьшение контроля процесса транспирации, корневая система плохо приспособлена к новым условиям питания [4].

Несмотря на огромное количество опытов, промышленное микроклональное размножение сталкивается с большими потерями при пересадке в нестерильные условия. Таким образом, адаптация – ключевой этап успешного размножения растений invitro. Растения, выращенные в любых условиях, адаптированы к этим условиям. Растения, которые перемещаются в другие условия, должны либо адаптировать старые части растения к новым условиям, либо расти достаточно быстро, чтобы выросли новые. Желательно, чтобы эти два процесса происходили одновременно. Поэтому необходимы специальные меры предосторожности при пересадке пробирочных растений в нестерильные условия [3].

Таким образом, метод клонального микроразмножения, как и всякий метод размножения, имеет свои преимущества и недостатки, которые должны учитываться в соответствии с целями работы [11].

Во всем мире маточники закладываются саженцами, размноженными invitro. Высокое качество таких маточников оправдывает затраты. Отмечено, что с размноженных в культуре тканей маточных растений получают в 2 раза больше саженцев, причем их качество выше, чем у подвоев, полученных с материнских растений, размноженных традиционными способами. Такая тенденция сохраняется и в последующие годы эксплуатации маточника [11].

Метод оздоровления растений через культуру меристем, позволяющий максимально освобождать растения от системных патогенов и нематод, имеет большое преимущество и весьма перспективен [11]. Размножение садовой земляники invitro позволяет получить большое количество оздоровленных реювенилизированных растений, которые могут служить превосходным материалом для закладки маточников. Растения, полученные путём микроклонального размножения, по сравнению с традиционно размноженными лучше растут, адаптируются к внешним условиям и плодоносят уже на первый год развития [11].

§1.1. Объекты, условия исследований

Лабораторные условия. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии РУП «Брестская ОСХОС НАН Беларуси» на протяжении 2021-2022 г.г. Объектами исследования служили растения-регенеранты: груши – S₁, 2.31, ВА-29; сливы – Julien GF 652/2, ВПК-1.

Описание подвоев:

S₁- сеянец айвы Анжерской. Подвой по силе роста превосходит исходную форму, хорошо укореняется, лучше совместим с промышленными сортами. Несовместимость может проявляться в поздние сроки в саду, в таком случае рекомендуется посредник.

Одним из недостатков S₁ является длительный период вегетации, что приводит к недостаточному вызреванию подвоев и их подмерзанию.

ВА-29 (QBA-29) - полукарликовый вегетативный подвой груши, отобран из айвы Прованской на Анжерской опытной станции (Франция). Имеет высоту до 110 см и диаметр условной корневой шейки около 9 мм; средне- или сильноразветвленный. Укоренение отводков начинается на 30-35-й день после их окучивания и составляет 3,5 балла.

Укорененные отводки в питомнике приживаются хорошо (98-100 %) и почти все подходят к окулировке. Для подвоя характерны быстрые темпы роста отводков в первом поле питомника в сочетании с низкой степенью поражения бурой пятнистостью. Подвой ВА-29 морозостойкий, совместим с большим количеством сортов, менее требователен к плодородию почвы; деревья груши на этом подвое более устойчивы к хлорозу.

Для этого подвоя характерна скороплодность в условиях сада. Деревья начинают плодоносить на 3-4-й год после посадки однолеток.

Julien GF 655/2 - сеянец Julien d’Orleans Prunus insititia, 2n=48. Выведен во Франции в местечке Pont-De-La-Маyе, на исследовательской станции La Grande Ferrade. Совместимость с сортами хорошая. Начало плодоношения раннее.

Маточный куст среднерослый, прямостоячий. В первый год роста в маточнике образует 13-15 побегов (преимущественно с боковыми ответвлениями) на 1 погонный метр. Высота надземной части стандартного побега до 80 см. В маточнике укоренение слабое (около 25 % укоренённых отводков). Хорошо размножается одревесневшими черенками.

В маточнике укоренение слабое (около 25 % укоренённых отводков). Хорошо размножается одревесневшими черенками.

ВПК-1 (оригинатор: НИИ садоводства Сибири им. М.А. Лисавенско, Россия) - подвой вегетативно размножаемый (клоновый), среднерослый. Маточный куст раскидистый. Средний балл укоренения в отводковом маточники – 3,5. Зимостойкость высокая. Устойчив к болезням. Хорошо укореняется в отводковом маточнике. Технологичен для окулировки. Совместим со всеми изучаемыми сортами слива и алычи.

§1.2. Методика исследований

При адаптации растений-регенератов изучали влияние следующих факторов: температура, субстрат, световой режим и влажность.

Опыт №1. Влияние t° на адаптацию растений-регенерантов:

При проведении опыта первоначально было взято по 50 растений каждого подвоя, которые были укоренены. В дальнейшем их поместили в условия с низкой температурой (+4 °С) сроком на 30 дней.

Был проведен опыт с открыванием пробок в пробирках на 5 дней в целях адаптации к окружающей среде. Этот вариант оказался не эффективен, так как при данном методе наблюдалось общее увядание и дальнейшее усыхание растений.

Опыт №2. Влияние субстрата на адаптацию растений-регенерантов:

Растения высаживали на адаптацию в период с 20 января по 31 марта 2022 года.

В качестве субстратов использовали:

торф;

перлит;

БИОНА-311.

На адаптацию было высажено 325 штук растений-регенерантов груши, в том числе: S₁, 2.31, BA-29 на торф и перлит по 40 штук, на БИОН-311 – S₁, BA-29 по 30 штук, 2.31 – 35 штук.

Растений-регенерантов сливы на адаптацию высадили 225 штук: из них Julien GF 655/2, ВПК-1 на торф и перлит по 40 штук, на БИОНУ-311 – Julien GF 655/2 30 штук, ВПК-1 – 35 штук.

Опыт №3. Влияние света и влажности на адаптацию растений-регенерантов:

При пересадке растений-регенератов груши и сливы с питательной среды на субстрат адаптация проходила при температуре 21-23 °С, с 16/8 часовым световым периодом и освещении не более 2,5 тыс. лк. Влажность в период адаптации составляла 96-98 %.

В течение первых 10-15 дней после пересадки в субстрат растения закрывали полиэтиленовой пленкой для создания влажной камеры. Затем растения ежедневно проветривали, а через 2-3 недели пленку снимали. Субстрат регулярно увлажняли дистиллированной водой.

Глава 2. Результаты исследований

§2.1. Лабораторные исследования

При проведении исследований было установлено, что наиболее устойчивыми к снижению температуры воздуха до +4°С перед адаптацией растений являются подвои: сливы – Julien GF 655/2, так как их гибель составила 15 %, и менее устойчивые к снижению температуры подвои сливы – ВПК-1; груши – ВА-29, так как их гибель составила 75 %. Однако, следует сделать вывод, что снижение температуры отрицательно влияет на выживаемость растений.

Так же изменение температурного режима повлияло на увеличение каллуса на подвоях: груши 2.31, S₁, сливы ВПК – 1, и образование каллуса на подвое груши ВА-29, сливы Julien GF 652/2. Гибель растений проявилась в усыхании.

При окончании адаптационного периода количество растений, прошедших адаптацию, составило: груши 2.31, S₁ – 95 %, ВА-29 – 100 %, сливы ВПК-1 – 95 %, GF 655/2 – 84 %. В дальнейшем рост растений был замедлен.

Был проведен опыт с открыванием пробок в пробирках на 5 дней в целях адаптации к окружающей среде. При данном методе наблюдалось общее увядание. В дальнейшем растения высаживались на адаптацию. Все этапы адаптации изучаемые растения не прошли. Гибель составила 100 %.

Таким образом, следует сделать вывод, что наиболее оптимальным вариантом для адаптации растений является высадка подвоев исключив стадию покоя.

Для укоренения in vitro клоновых подвоев груши и сливы использовался торфяной субстрат, перлит, БИОНА-311. Растения высаживали на адаптацию в период с 20 января по 31 марта. За данный период было высажено 325 растений-регенератов груши и 225 сливы.

Результаты адаптации растений-регенерантов груши (табл.1):

а) 100 % гибель всех типов подвоев при высадке на адаптацию в субстрат – торф;

б) 40 % гибель всех типов подвоев при высадке на адаптацию в субстрат – БИОНА-311;

в) 70 % гибель всех типов подвоев при высадке на адаптацию в субстрат – перлит.

Таблица 1 – Результаты адаптации растений - регенерантов груши

Результаты адаптации регенерантов сливы (табл.2):

а) 100 % гибель всех типов подвоев при высадке на адаптацию в субстрат – торф;

б) 40 % гибель всех типов подвоев при высадке на адаптацию в субстрат – БИОНА-311;

в) 70 % гибель всех типов подвоев при высадке на адаптацию в субстрат – перлит.

Таблица 2 – Результаты адаптации растений - регенерантов сливы

По истечении 30 дней была отмечена гибель подвоев: груши 2.31 и S₁ – 53 %, ВА-29 – 75 %, сливы GF 655/2 – 15 %, ВПК-1 – 75 %.

Лучшим субстратом для пересадки растений является БИОНА-311. Приживаемость растений составила 60 %.

Полученные результаты являются промежуточными. В дальнейшем результаты будут использованы для получения оздоровленных подвоев семечковых и косточковых культур.

Выводы и заключение

Снижение t° отрицательно влияет на выживаемость растений.

Лучшим субстратом для высадки растений является БИОНА-311. Приживаемость растений составила 60%.

Оптимальным световым периодом для адаптации растений является 16/8 часовой световой период и освещение не более 2,5 тыс. лк. при влажности 96-98 %.

Адаптация – ключевой этап успешного размножения in vitro. В момент пересадки растения, прежде всего, подвергаются водному стрессу, что приводит к обезвоживанию тканей и разрушению клеточных мембран. Было показано, что стресс, вызываемый воздействием отрицательных температур, также сопровождается обезвоживанием тканей, поэтому лучшая приживаемость растений в нестерильных условиях, подвергнутых воздействием определенное время низкими температурами, возможно связано с частичным повышением устойчивости к водному стрессу. Несмотря на огромное количество проведенных опытов промышленное микроклональное размножение сталкивается с большими потерями при пересадке в нестерильные условия. Проведенные исследования позволяют повысить процент адаптированных к нестерильным условиям микрорастений, что приведет к получению большего количества оздоровленного посадочного материала плодовых культур.

Проведенные исследования могут быть использованы при составлении методических рекомендаций по микроклональному размножению плодовых культур.

Литература

Деменко В.И. Теоретические основы микроклонального размножения/ В.И. Деменко // Микроклональное размножение садовых растений: учебное пособие. – МСХА им. К.А. Тимирязева. – Москва, 2007. – С.4-9.

Корнацкий С.А. Взаимосвязь качества периода покоя и особенностей роста и развития адаптированных микрорастений косточковых культур/ С.А. Корнацкий // Плодоводство: науч. тр./ РУП «Ин-т плодоводства»; редкол.: В.А. Самусь (гл. ред.) [и др.]. – Самохваловичи, 2002. – Т. 14. – С.128-135.

Кухарчик Н.В. Вегетативная продуктивность клоновых подвоев вишни и черешни, полученных в культуре invitro / Н.В. Кухарчик, Т.А. Красинская // Плодоводство: науч. тр./ РУП «Ин-т плодоводства»; редкол.: В.А. Самусь (гл. ред.) [и др.]. – Самохваловичи, 2010. – Т. 22. – С.148-154.

Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / Е.Н. Джигадло, М.И. Джигадло, Л.В. Голышкина; под ред. М.И. Джигадло. – Орел: ВНИИСПК, 2005. – 50 с.

Методические указания к практическим занятиям по плодоводству / Микроклональное размножение плодовых и ягодных культур. – М.: Изд-во МСХА, 1997. – 20 с.

Методы ускоренного размножения сортов плодовых и ягодных культур / Г.В. Еремин, А.В. Исачкин И.В. Казаков и др. // Общая и частная селекция и сортоведение плодовых и ягодных культур / под ред. Г.В. Еремина. – М.: Мир, 2004. – С.85-87.

Положение о производстве посадочного материала плодовых и ягодных культур в Республике Беларусь / РУП «Институт плодоводства»; разраб.: В.А. Самусь, Н.В. Кухарчик. – Самохваловичи, 2009. – С.3.

Программа и методика сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур / ВНИИСПК; под общ. ред. Е.Н. Седова и Т.П. Огольцовой. – Орёл: ВНИИСПК, 1999. – 606 с.

Радюк А.Ф. Выращивание саженцев плодово-ягодных культур./ А.Ф. Радюк, В.А. Самусь, А.И. Пуцило, Л.В. Бондарь, Р.Ф Матвеева – Мн.: Ураджай, 1991. – 254°с.

Самусь В.А. Предварительные результаты инициации культуры invitro районированных подвоев яблони / В.А. Самусь // Плодоводство: науч. тр./ РУП «Ин-т плодоводства»; редкол.: В.А. Самусь (гл. ред.) [и др.]. – Самохваловичи, 2002. –Т. 14.–С.22-29.

Семенас С.Э. Клональное микроразмножение подвоя яблони ПБ-4 / С.Э. Семенас // Плодоводство: науч. тр. / РУП «Ин-т плодоводства»; редкол.: В.А. Матвеев (гл. ред.) [и др.]. – Самохваловичи, 2005. – Т. 17. Ч.1 – С.67-71.