XVII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Выявление аллелей короткостебельности генов “зелёной революции” Rht-B1 и Rht-D1 в сортах мягкой пшеницы

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Садовникова А.С. 1

---

1МБОУ СОШ №12

Орлова И.Н. 1

---

1МБОУ СОШ №12

Работа в формате PDF

688.4 KB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение.

Проблематика и актуальность проекта

Мягкая пшеница (Tríticum aestívum)— ведущая зерновая культура в мире. Занимает первое место по площади посевов и третье место по объему собранного урожая. Это было достигнуто во многом за счет использования короткостебельных сортов.

В чём преимущество короткостебельных сортов?

Снижение высоты растений не только сопровождается повышением их устойчивости к полеганию, что благоприятно сказывается на эффективности механизированной уборки, но и увеличивает число зерен в колосе и число зерен на 1 м2, а все вместе приводит к повышению урожайности.

Рост мягкой пшеницы контролируется генами семейства Rht (Reduced height). Таких генов около двадцати пяти, в моей работе я остановилась на изучении самых используемых из них: Rht-B1 и Rht-D1.

Актуальность моей работы состоит в том, что использование ДНК-маркёров позволяет существенно сократить время для поиска короткостебельных сортов пшеницы и поможет селекционерам быстрее выводить новые сорта.

Цель и задачи проекта

Цель исследования:апробировать ДНК-маркеры для выявления аллелей короткостебельности Rht-B1c, Rht-B1h и Rht-D1b у образцов мягкой пшеницы коллекции ВИР.

   Задачи:

Выделение ДНК

In Silico-анализ аллелей короткостебельности у мягкой пшеницы.

Проведение ПЦР с праймерами, позволяющими выявить  аллели короткостебельности Rht-B1h и Rht-D1b у образцов пшеницы.

Провести рестрикцию ПЦР продуктов ДНК-маркеров для выявления Rht-D1b

Провести электрофорез для разделения ПЦР продуктом.

Растительный материал

Происхождение образцов, наличие у них аллелей Rht-генов я смотрела в базе данных: GRIS. Было изучено 16 образцов мягкой пшеницы, часть из них была с Rht-B1h, Rht-B1c, Rht-D1b.Материал предоставлен ОГР Пшеницы, ВИР.

Описание хода работы над проектом

Выделение ДНК (измельчение образцов, с использованием вортекса и центрифуги, добавление хлороформа и многих других реагентов, инкубация).

Проведение InSilico-анализа аллелей короткостебельности у мягкой пшеницы.

Проведение ПЦР с праймерами, позволяющими выявить  аллели короткостебельности Rht-B1h и Rht-D1b у изучаемых образцов короткостебельной пшеницы.

Проведение электрофореза для разделения ПЦР продуктов.

Выделение ДНК.

Первым этапом работы стало выделение ДНК проростков 16 сортов мягкой пшеницы. Выделение ДНК проводилось набором: «Сорб-ГМО-Б (синтол)», спецификой которого является использование кремниего сорбента, связывающего ДНК. 

ДНК выделяется следующим путём:

Гомогенезация - в ходе процесса уменьшается степень неоднородности распределения химических веществ и фаз по объёму гетерофазной системы.

Лизис клеток и денатурация белков.

Связывание ДНК с кремниевым сорбентом и его промывка.

 Элюция -  извлечение вещества из твердого носителя вымыванием его подходящим растворителем.

InSilico-анализ генов Rht-B1 и Rht-D1.

Поиск и извлечение аллелей генов Rht-B1 и Rht-D1 проводился в цифровом банке NCBI.

Выравнивание аллелей Rht-B1a, Rht-B1c, Rht-B1h проводилось в программе MEGA-11.

Построение схемы генов проводилось в программе SnapGene.

Проведение ПЦР-анализа.

Для выявления аллелей Rht-B1h,c  и аллелей Rht-D1 были использованы праймеры и протокол, представленные ниже.  Для всех исследуемых маркёров была использована ПЦР-программа с функцией «Touch-down».

Используемые в исследовании праймеры (Li et al., 2012; Поротников и др., 2022)

ПЦР микс готовили по протоколу.

Рестрикционный анализ.

Рестрикционный анализ ПЦР-продуктов (праймеры DF/CD1b) проводили по следующему протоколу:

Я готовила микс с рестриктазой BstSFI;

Вносила рестрикционный микс в ПЦР-продукты;

Инкубировала при 60°C.

Проведение электрофореза в агарозном геле.

1. Был приготовлен 1% (для геномной ДНК) и 2% (для ПЦР-продуктов) агарозный гель с добавлением бромистого этидия в качестве красителя.

2. Пробы ДНК вносились в лунки геля, при использовании загрузочного буфера (бромфеноловый синий).

3. Я использовала напряжение 100 V.

4. Фотофиксацию результатов электрофореза проводила при проходящем ультрафиолетовом свете.

Результаты: выделение ДНК.

Выделена ДНК из 16 образцов мягкой пшеницы: 

М9 10 11 12 13 14 15 16 Проверка концентрации выделенной ДНК в агарозном геле

М 1 2 3 4 5 6 7 8

Atlas 66;

Bohmischer Wechsel Winterweize;

Chinese Spring;

Chris Mutant;

Courtot;

Norin 112;

Norin 27;

Zheng 9023;

Александрит;

Akadaruma;

Moro of sind;

Гром;

Tom Thumb;

Горянка;

Геракл;

Сибирка Ярцевская.

Результаты: In Silico-анализ.

В результате моих исследований была успешно выделена ДНК из проростков 16 сортов мягкой пшеницы

Insilico-анализ Rht-B1 показал наличие вставки в 197 п.н., общей для Rht-B1h и Rht-B1c. Вторая вставка в 2026 п.н. была только у Rht-B1c

Анализ Rht-D1 показал у аллеля Rht-D1b однонуклеотидную замену в Экзоне 1, приводящую к стопам кодону.

Схема Rht-B1

Схема Rht-D1

Rht-D1bЗамена нуклеотида, образование преждевременного стоп-кодона TAG. Остановка синтеза белка

Результаты ПЦР: выявление Rht-B1h, Rht-B1c.

Insilico-анализ Rht-B1 показал наличие вставки в 197 п.н., общей для Rht-B1h и Rht-B1c. Вторая вставка в 2026 п.н. была только у Rht-B1c

Анализ Rht-D1 показал у аллеля Rht-D1b однонуклеотидную замену в Экзоне 1, приводящую к стопам кодону.

Апробация InDel-маркера подтвердила наличие аллелей Rht-B1h и Rht-B1c:

У образцов Tom Thumb подтверждено наличие Rht-B1c;

У образцов Atlas 66, Zheng 9023 подтверждено наличие Rht-B1h.

Также у сорта Courtot был выявлена вставка, указывающая либо на Rht-B1h, либо на Rht-B1c. Возможно, данная проба была загрязнена.

На фотографии геля видно, что ПЦР фрагмент большего размера свидетельствует о наличии вставки, характерной для B1-c,h.

ПЦР с праймерами Rht-B1h.F/Rht-B1.2R. Фрагмент большего размера - говорит о вставке в 197 п.н. (Rht-B1h или Rht-B1c)

Я доказала эффективность InDel-маркера в выявлении аллелей Rht-B1h и Rht-B1c. Действительно, для сортов была характерна данная вставка. Исключение составил сорт Courtot, который по данным литературы не должен нести Rht-B1h или С аллели Возможно, была контаминация ДНК проб.

Результаты ПЦР: выявление Rht-D1b.

Аппробация CAPS-маркёра (BstSFI) подтвердила наличие аллеля короткостебельности D1b: у сортов Горянка, Courtot, Zheng-9023. Для этих сортов пцр продукты были опознаны и разрезаны Рестриктазой.

BstSFI (CTGTAG)

Выводы, результаты

Выводы:

Мной была успешно выделена ДНК из проростков 16 сортов мягкой пшеницы.

Анализ Rht-B1 показал наличие вставки в 197 п.н. у Rht-B1h и Rht-B1c. Вторая вставка в 2026 п.н. была только у Rht-B1c.

Анализ Rht-D1 показал у аллеля Rht-D1b однонуклеотидную замену в экзоне 1, приводящую к стоп кодону.

Показана эффективность маркеров в выявлении аллелей Rht-B1h и Rht-B1c и Rht-D1b.

ДНК-маркер для  выявления аллелей Rht-B1h, Rht-B1c, Rht-D1b может быть рекомендован при поиске и создании новых короткостебельных сортов.

Дальнейшее развитие проекта

В будущем я планирую создать новый проект, целью которого является отличить Rht-B1h от Rht-B1c” с помощью ДНК-маркеров.

Также я планирую использовать ДНК-маркеры для выявления других аллелей генов Rht-B1 и Rht-D1.

Источники

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 

http://wheatpedigree.net/sort/show/3077 

https://www.snapgene.com/release-notes/?referrer=SnapGene%20Viewer 

https://www.megasoftware.net/

Li A., Yang W., Lou X., Liu D., Sun J., Guo X., Wang J., Li Y., Zhan K., Ling H.Q., Zhang A. Novel natural allelic variations at the Rht‐1 Loci in wheat. Journal of integrative plant biology. 2013;55(11):1026-1037. DOI 10.1111/jipb.12103

Поротников, И. В., Митрофанова, О. П., & Антонова, О. Ю. (2022). Система молекулярных маркеров для идентификации аллелей генов короткостебельности Rht-B1 и Rht-D1 у мягкой пшеницы. Вавиловский журнал генетики и селекции, 26(2), 128-138.

Растительный материал предоставлен Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Федеральным исследовательским центром Всероссийским институтом генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова»