XVIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Поиск азотфиксирующих бактерий, способных активировать рост и развитие растений

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Седых М.С. 1

---

1Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение «Экономический лицей» города Бердска

Зинина В.Л. 1

---

1Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение «Экономический лицей» города Бердска

Работа в формате PDF

1.6 MB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

1. Введение

Стремительный рост населения планеты, сокращение площади пахотных земель и деградация почвы приводят к ухудшению продовольственной ситуации в мире.

Для повышения урожая и восстановления плодородия почв люди применяют удобрения. С их помощью в почву вносятся дефицитные химические компоненты и полезные микроорганизмы. Удобрения бывают минеральные, органические и микробиологические. Микробиологические удобрения содержат живые микроорганизмы, которые помогают растениям усваивать органические и минеральные соединения. Биологические удобрения являются природными и безопасными для здоровья людей. Широкое распространение среди таких удобрений получили препараты, содержащие азотфиксирующие бактерии.

Азотфиксирующие бактерии помогают растениям усваивать азот из воздуха, защищают от грибковых заболеваний, вырабатывают витамины и ростовые вещества. С ними растения растут быстрее, а количество и размер плодов увеличиваются.

Поэтому целью моей работы был поиск азотфиксирующих бактерий, способных активировать рост и развитие растений. В ходе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Сбор образцов почвы около корней различных растений

Получение колоний азотфиксирующих бактерий в питательной среде Эшби

Микроскопическое исследование бактерий

Изучение влияние разных штаммов азотфиксирующих бактерий на прорастание и развитие семян

Я предположила, что разные виды азотфиксирующих бактерий стимулируют рост и развитие растений

2. Литературный обзор

Бактерии — это группа живых организмов, которые первые появились на Земле[5]. Учёные считают, что это произошло более 3,5 миллиардов лет назад и на протяжении почти миллиарда лет после этого на нашей планете обитали только они.

2.1 Строение бактерий

Ядерное вещество

Цитоплазма

Бактериальная клетка обычно устроена наиболее просто по сравнению с клетками других живых организмов. Ее размер обычно составляет от 0,2 до 10 мкм

Клеточная стенка

Ворсинка

Жгутик

Рис. 1. Строение бактерии.

Снаружи клетки бактерий покрыты клеточной стенкой[2], которая защищает ее от внешних воздействий, а также придаёт форму клетке бактерии (Рис. 1). Клеточная стенка бактерий проницаема: через неё питательные вещества свободно проходят в клетку, а продукты обмена веществ выходят в окружающую среду. Бактериальные клетки часто окружает капсула, которая служит защитой от внешней среды и предохраняет бактерию от высыхания. На поверхности некоторых бактерий имеются длинные жгутики (один или несколько) или короткие тонкие ворсинки. Длина жгутиков может во много раз превышать размеры тела бактерии. С помощью жгутиков и ворсинок бактерии передвигаются. Под оболочкой в бактериальной клетке находится цитоплазма, в которой содержатся различные белки и запасные питательные вещества.

2.2 Распространение бактерий

Бактерии обнаружены везде: даже в капле самой чистой родниковой воды, в крупинках почвы, в воздухе, на скалах, в полярных снегах, песках пустынь, на дне океана, в добытой с огромной глубины нефти и даже в воде горячих источников с температурой около 90ºС[3]. Обитают они на растениях, плодах, у различных животных и у человека в кишечнике, ротовой полости, на конечностях, на поверхности тела.

2.3 Почвенные бактерии

Поскольку бактерии распространены практически повсеместно и встречаются в огромном количестве, они во многом определяют различные процессы, происходящие в природе. Осенью опадают листья деревьев и кустарников, отмирают надземные побеги трав, опадают старые ветки, время от времени падают стволы старых деревьев. Всё это постепенно превращается в перегной, благодаря бактериям гниения [4].

В 1 см3. поверхностного слоя лесной почвы содержатся сотни миллионов сапрофитных почвенных бактерий нескольких видов. Эти бактерии превращают перегной в различные минеральные вещества, которые могут быть поглощены из почвы корнями растений.

Некоторые почвенные бактерии способны поглощать азот из воздуха и переводят его азотсодержащие соединения, которые могут использовать растения. Это азотфиксирующие бактерии. Они могут жить самостоятельно или поселяться в корнях бобовых растений. Проникнув в корни бобовых, эти бактерии вызывают разрастание клеток корней и образование на них клубеньков. От растений бактерии получают углеводы и минеральные соли. Таким образом, между бобовым растением и клубеньковыми бактериями существует тесная связь, полезная как одному, так и другому организму. Это явление носит название симбиоза[1].

2.4 Разновидности азотфиксирующих бактерий

Rhizobium sp. — одна из самых изученных групп азотфиксирующих клубеньковых бактерий. Клубеньковые бактерии –это грамотрицательные подвижные палочки в свободном состоянии и в молодых клубеньках. При дальнейшем развитии они приобретают неправильную форму и превращаются в разветвленные, булавовидные или сферические бактероиды. Видовые названия этих бактерий обычно соответствуют названию того растения, из клубеньков на корнях которого, выделены бактерии. Например, Rhizobium trifolii – растение-хозяин клевер, Rhizobium phaseoli – растение-хозяин фасоль, Rhizobium leguminosarum – растение-хозяин горох[1].

Azotobacter — это род свободноживущих грамотрицательных бактерий, обитающих в почве. Azotobacter chroococcum был впервые выделен в чистой культуре голландским ученым М. Бейеринком в 1901 г. Представители рода Azotobacter чаще всего обитают в нейтральных и слабощелочных почвах, а также в пресноводных водоемах и солоноватоводных болотах. Однако, некоторые представители Azotobacter были обнаружены и в экстремальных условиях: в почвах северного и южного полярного и антарктического региона. Azotobacter нередко образуют симбиотическую связь с растениями и живут в ризосфере – узком слое почвы, прилегающем к корням растения толщиной около 2-5 мм.

Дефицит питательных элементов, засоление почв, наличие тяжелых металлов, ограниченная влажность и сочетание всех вышеперечисленных неблагоприятных условий может приводить к исчезновению популяции азотфиксаторов и изменению микробиоценоза почвы.

Задача поиска штаммов азотфиксаторов, устойчивых к дефицитным (стрессовым) условиям, является очень актуальной. Современные исследователи регулярно находят и описывают новые азотфиксирующие бактерии, однако их внедрение в сельское хозяйство затрудняется их низкой азотфиксирующей активностью в стрессовых условиях.

3.Экспериментальная часть

3.1 Отбор образцов почвы

На первом этапе работы отобрали образцы почвы у корней разных растений (горох, клубника, голубика) и в компосте (Рис. 2). Пинцетом из почвы убрали крупные остатки растительности и мусор.

Рис. 2. Отбор образцов почвы

3.2 Приготовление среды Эшби и посев культур. Анализ обрастания почвенных комочков

Приготовили 250 мл питательной среды Эшби (Таблица №1) и залили рядом с пламенем спиртовки 12 чашек Петри. Среда Эшби, не содержащая минеральных или органических источников азота, является селективной средой для культивирования азотфиксаторов рода Azotobacter.

Таблица №1 Состав среды Эшби

Для приготовления среды смесь перемешали до однородной взвеси и довели до кипения. Далее смесь охладили и залили ровным слоем чашки Петри из расчета 20-25 мл среды на чашку.

Образцы почвы развели водой до получения пастообразной массы. С помощью зубочистки на твердую среду разложили маленькие комочки почвы (Рис. 3). Чашки закрыли крышкой и оставили при комнатной температуре на несколько дней в темноте.

Рис. 3. Приготовление чашек Петри со средой Эшби, посев культур, обрастания почвенных комочков.

Первые обрастания вокруг комочков появились на образцах почвы уже через один день. На 7 день обрастания стали окрашиваться в коричневый цвет.

Рис. 4. Процент обрастания комочков почвы

Наибольшее количество обрастаний было у комочков почвы из компоста, а наименьшее у почвы, в которой росла голубика (Рис. 4).

3.3 Получение чистых культур азотфиксирующих бактерий и их микроскопический анализ

Отобрали 20 колоний, отличающихся по величине, цвету и другим признакам. С помощью зубочисток, не касаясь комочков земли, перенесли их в пробирки со стерильной водой. Стеклянным шпателем разведенные в воде колонии втерли в чистую питательную среду Эшби. Для получения чистых культур бактерий колонии повторно пересаживали в чашки Петри со свежей средой Эшби с помощью микробиологической петли (Рис. 5).

Рис. 5 Чистые культуры бактерий

Провели микроскопический анализ полученных колоний. Отобранные колонии наносили на предметное стекло. На мазок наносили раствор метиленового синего, промывали, наносили раствор фуксина. Стекло промывали водой и высушивали на воздухе. Препарат рассматривали в световом микроскопе при увеличении 1000х.

Были получены чистые препараты, отличающиеся величиной и формой клеток (Рис.6). С помощью ученых Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН был определен род штаммов азотфиксирующих бактерий. Для дальнейших исследований отобрали 8 штаммов бактерий.

Рис. 6. Полученные штаммы азотфиксирующих бактерий

3.4 Изучение влияние азотфиксирующих бактерий на прорастание семян.

Изучили влияние азотфиксирующих бактерий на прорастание семян редиса, укропа, ржи. На дно чашки Петри положили фильтровальную бумагу, добавили 5 мл воды или питательной среды, или раствора бактерий и разложили семена.

рожь

укроп

редис

Чистая вода

Раствор бактерий

рожь

укроп

редис

Рис. 7. Прорастание семян в растворе бактерий и чистой воде.

Проросли только семена редиса. Семена укропа и ржи проростков не дали (Рис. 7). В воде проросло 90% семян, а при обработке питательной средой без бактерий – 0%. В случае обработки семян бактериями семена прорастали, но дальнейшее развитие растений не происходило.

3.5 Изучение влияние азотфиксирующих бактерий на развитие растений

На следующем этапе работы семена редиса, томата и овса посевного замачивали в воде до прорастания. Пророщенные семена растений выдерживали 5 минут в растворе бактерий, воды или питательной среды. После семена высаживали на глубину 1-2 см и поливали водой 1 раз в 2 дня. В ходе эксперимента оценивали рост и массу растений (Рис.8).

Рис. 8. Измерение длины и массы растений

В результате эксперимента увидели, что штаммы бактерий 1, 2, 3, 5, 6 и 7 стимулируют рост всходов редиса. Длина всходов овса была больше при обработке семян штаммами бактерий 2, 3 и 5. Рост томатов улучшали штаммы бактерий 1, 2, 4 и 6, а штамм 3 угнетал (Рис.9).

Рис. 9. Длина всходов растений

Зеленую массу овса увеличивали штаммы бактерий 2, 3, 4, 5, 6 и 8. В эксперименте с редисом масса всех растений была меньше, чем в контроле с водой (Рис.10). Массу томатов не определяли, так как эксперимент с ними продолжается.

Рис. 10. Масса всходов растений

4. Выводы:

1. Из почвы, отобранной с грядок клубники, гороха, голубики и на компостной куче методом обрастания почвенных комочков выделены азотфиксирующие бактерии.

2. Получены чистые культуры 8 штаммов азотфиксирующих бактерий, различающиеся под микроскопом.

3. Обработка семян питательной средой и средой с азотфиксирующими бактериями негативно влияет на прорастание семян. Возможно, из-за жизнедеятельности бактерий в среде накапливаются вредные для зародыша вещества и он погибает.

4. Штаммы азотфиксирующих бактерий Rhizobium и Pseudomonas активируют рост и развитие растений овса. Azotobacter chroococcum, Rhizobium и Pseudomonas стимулирует длину растений редиса. Рост томатов улучшали штаммы бактерии Rhizobium, Paenibacillus agaridevorans и Pseudomonas vancouverensis, а штамм Pseudomonas chlororaphis угнетал.

Таким образом, гипотеза не подтвердилась. Не все азотфиксирующие бактерии стимулируют рост и развитие семян и растений.

Список литературы: