XVIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Изучение микрофлоры закрытого грунта

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Удовиченко А.Н. 1

---

1ГОУ ЛНР "АГ им. П.Н. Липовенко"

Беденко О.Г. 1

---

1ГОУ ЛНР "АГ им. П.Н. Липовенко"

Работа в формате PDF

143.1 KB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

ВВЕДЕНИЕ

Среди природных сред почва лучше всех обеспечивает развитие и жизнедеятельность микроорганизмов и изменяется под их воздействием. Почва является средой обитания для многих видов микроорганизмов. Это динамичная, гетерогенная система, которая обеспечивает развитие микроорганизмами различных условий аэрации, влажности, рН, разной концентрации питательных веществ. Ингибирующая масса почвенных микроорганизмов (до 80-90%) находится в адсорбированном состоянии на поверхности почвенных агрегатов, корней растений. Большая часть микроорганизмов находится в почве в неактивном состоянии – в виде эндоспор, микрокист, вегетативных клеток, ведущих фиксированный образ жизни, или испытывающих неблагоприятные условия. [2, 6].

Микроорганизмы распространены во всех типах почв, так как почва является идеальной средой обитания для них, по сравнению со всеми другими природными средами. Почвенная микрофлора представлена грибами, актиномицетами, преимущественно гнилостными, масляной кислотой, азотфиксирующими, нитрифицирующими, денитрифицирующими, целлюлозоразлагающими, серо- и железо-бактериями [4].

Актуальность данной работы заключается в том, что важнейшая роль в биогенной миграции атомов с точки зрения автора принадлежит деятельности бактерий, именно они в значительной мере обеспечивают плодородие почв, до некоторой степени кислотность грунта. Поэтому чрезвычайно важно уметь устанавливать видовое разнообразие микроорганизмов различных экосистем.

Цель исследования: провести анализ качественного и количественного состава почвы, выделение и идентификация одного из видов микроорганизмов, представленных в видовом разнообразии почвы.

Для достижения цели, были поставлены такие задачи: изучение литературы по данному вопросу; учёт микроорганизмов в выбранном образце почвы (качественный и количественный состав); описание морфокультурных особенностей колоний и микроорганизмов; определение и описание некоторых культурно-морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенных видов; идентификация отобранных видов.

Объект исследования: почвенные микроорганизмы.

Предмет исследования: образцы почвы, на которой произрастают комнатные цветы в кабинете №16 ГОУ ЛНР «АГ им. П.Н. Липовенко».

Методы исследования: теоретические (изучение и анализ научной литературы); экспериментальные (взятие проб, проведение лабораторных опытов); наблюдения, анализа и обобщения полученных данных.

Практическая значимость: результаты исследования могут использоваться учащимися на уроках экологии, биологии; будут способствовать лучшему пониманию биологического разнообразия окружающего мира, зависимости здоровья человека от микромира; будут полезны для всех, кто стремится лучше узнать свою ойкумену в целом и свой родной край в частности.

Личный вклад: Работа выполнена самостоятельно автором летом 2022 года.

Раздел 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Распространение микроорганизмов в почве

Почва является благоприятной средой для развития и накопления многих видов бактерий, грибков, вирусов и простейших. Почвенная среда содержит большое количество различных микроорганизмов.

Верхний слой почвы содержит ограниченное количество микроорганизмов из-за воздействия солнечных лучей и высыхания. Их основная масса содержится на глубине 5-15 см, на глубине 20-30 см уменьшается количество микроорганизмов, а на глубине 6-7 метров почва может быть уже стерильной, так как распространение микроорганизмов в глубину затрудняется высокой поглощающей способностью почвы [2, 4].

По происхождению микрофлора подразделяется на: автохтонную (микроорганизмы постоянно присутствуют в этой среде обитания); аллохтонные (интродуцированные); микроорганизмы, которые не встречаются в почве в нормальных условиях [8].

В зависимости от температуры, при которой наблюдается оптимальный рост и развитие, бактерии делятся на мезофилов (15-45◦С), психофилов (ниже 20◦С) и термофилов (45-65◦С). Однако мезофильные формы составляют большинство почвенных бактерий. [7].

Наиболее характерными для почв являются организмы, принадлежащие к родам: Cephalosporium, Gliocladium, Aspergillus, Penicillium, Spicaria, Trichoderma, Trichothecium, Alternaria, Cladosporium, Pillularia, Fusarium.

Состав и соотношения между различными группами микроорганизмов варьируются в зависимости от типа почвы, способов ее обработки, содержания органических веществ, влажности, рН. Большинство почвенных микроорганизмов развиваются при нейтральном рН, относительно высокой влажности и температуре 25-45 °C. Микроорганизмы в почве развиваются в воде и коллоидных пленках, покрывающих твердые частицы, и особенно в капиллярной и гравитационной воде, которая заполняет поры между минеральными частицами почвы и содержит растворенные органические и неорганические вещества. [3, 7].

Первые вклады в почвенную микробиологию появились в результате разработки методики аккумулирования сельскохозяйственных культур, разработанной Виноградским и Бейгеринком. Данная технология предполагает посев почвенного инокулята на дифференциальную среду, которая будет способствовать росту определенного вида микроорганизмов. В большинстве случаев это вид микроорганизма, который способен противостоять изменениям химического состава почвы, которые анализирует исследователь. Путем последовательной пересадки полученной культуры в свежие среды достигается доминирование роста определенного вида микроорганизма, который выделяется и анализируется. Именно с использованием этой методики было выделено и описано большое количество микроорганизмов, а также исследован микробиологический характер многих химических превращений, происходящих в почве. [6, 8].

Микроорганизмы в почве находятся в сложном биоценозе, характеризующемся различными взаимоотношениями как друг с другом, так и с растениями. В ризосфере растений бактерии особенно велики. Здесь они образуют зону интенсивного размножения и повышенной активности. Почвенные микроорганизмы выполняют важнейшую функцию – минерализацию сложных органических соединений, превращая их в формы, доступные растениям. Из минералов в почве это нитраты и нитриты, карбонаты, бикарбонаты, сульфаты, хлориды, соединения железа, алюминия, марганца и другие. Ряд веществ, вырабатываемых растениями, а также живая масса корней является одним из основных питательных субстратов. [4].

Основные представители микрофлоры почвы

Основная масса почвенных микроорганизмов сапрофитна и лишь небольшое количество приходится на долю патогенных видов.

Основная масса микрофлоры ризосферы представлена грамотрицательными неспороносными бактериями рода Pseudomonas, микобактериями, грибами, преимущественно базидиомицетами. Грибы образуют симбиоз с корнями растений [2].

Бактерии-аммонификаторы – это микроорганизмы, вызывающие гниение растительных остатков. В процессе распада участвуют аэробные бактерии: Bacillus subtilis, mesentericus, бактерии рода Proteus, грибы рода Aspergillus, Mucor и другие.

Во время активности нитрифицирующих бактерий, обладающих автотрофными свойствами, азотистая кислота окисляется до азотной кислоты и превращается в нитрат.

Азотфиксирующие бактерии, обладающие способностью поглощать атмосферный азот из воздуха, в процессе жизнедеятельности образуют белки и другие органические соединения азота из молекулярного азота, которые используются растениями [3, 6].

В состав почвенной микрофлоры входят группы микроорганизмов, участвующих в различных процессах постепенного разложения органических веществ: протеолитических, липолитических, амилолитических. Среди этих микроорганизмов важную роль играют бактерии и грибы – аммонификаторы. (табл. 1.1).

Таблица 1.1

Микроорганизмы и процессы, в которых они участвуют

Бактерии в почве способны разлагать целлюлозу, гемицеллюлозу, пектин, лигнин и белки (табл. 1.2).

Таблица 1.2

Растительные остатки почвы, разлагаемые микроорганизмами

Для оценки активности почвенного биотопа используется показатель биологической активности почвы. Биологическая активность почвы определяется: подсчетом общего количества почвенных микроорганизмов (из-за несовершенства методов этот метод определения дает лишь условную характеристику биологической активности почвы); определение количества отдельных физиологических групп микроорганизмов, например, нитрифицирующих бактерий; определение углекислого газа, выделяемого почвой – основной биохимический метод определения биологической активности почвы. Чем интенсивнее выделение углекислого газа из почвы, тем активнее в ней протекают биологические процессы, тем лучше условия для обработки сельскохозяйственных культур и тем выше их потенциальная урожайность. Интенсивность дыхания почвы зависит от ее свойств, гидротермальных условий, характера растительности, агротехнических мероприятий. Снижение выброса углекислого газа почвой может ухудшить поступление кислорода в почву, что, в свою очередь, будет способствовать образованию токсичных веществ. [3, 4].

РАЗДЕЛ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Подбор инокулята и посевов на питательные среды

Отбор проб почвы проводился в школьной лаборатории, с использованием стерильного шпателя в стерильной чашке Петри. Дата отбора – 25.07.2022. 5 различных образцов были отобраны из пяти разных цветочных горшков.

Из отобранного образца взвешивали 1 г почвы (смешанный образец почвы). Мы подготовили серию последовательных десятикратных разбавлений почвенного экстракта от 10^-2до 10^-5.

Материал высевали стерильным стеклянным шпателем с твердым газоном на 6 питательных средах: среде Ashby, среде Endo, среде Chapeka, среде Saburo, агаре картофельном, крахмало-аммиачном агаре. Инокулят на всех средах культивировали в течение 5-7 дней при температуре 28 ◦С, инокулят на эндо-среде культивировали при температуре 37◦С в течение дня.

Каждая из сред использовалась для выделения определенной группы микроорганизмов:

Среда Чапека – для выделения грибов и актиномицетов;

Среда Эшби – для выделения олигонитрофильных бактерий и некоторых дрожжей;

Крахмально-аммиачная среда (КАС) – для высвобождения актиномицетов и бактерий;

Cреда Сабуро – для выделения дрожжей;

Картофельный агар (КА) – для выделения фитопатогенных бактерий.

2.2. Учет микроорганизмов, посеянных из закрытого грунта

2.2.1. Определение КОЕ закрытого грунта

Общее количество КОЕ в 1 г почвы рассчитывается по формуле 2.1.

Формула 2.1.

а – количество клеток в 1 г почвы;

б – 22 – среднее количество колоний на чашку Петри;

в – 10^-5 – селекция, из которой производился посев;

г – 0,1 мл – объем суспензии, которая была нанесена на питательную среду;

д – 1 г – вес почвы, которая была выбрана для анализа.

2.2.2. Селекция чистой культуры

Выделение чистой культуры проводили методом изнурительного удара с использованием стерильной петли на картофельном агаре (КА). Посевной материал культивировали в течение 7 дней при температуре 28 ◦С. Агрессивный рост наблюдался на среде, в течение двух дней культивирования. Для изоляции отдельных колоний проводили повторное культивирование из полученных колоний в тех же условиях.

2.3. Определение физико-биохимических особенностей чистой культуры микроорганизмов исследуемого биотопа

Среди физико-биохимических особенностей выделенной чистой культуры микроорганизмов исследована способность изолята ферментировать углеводы. Его изучали с использованием сред, содержащих глюкозу, мальтозу, маннит, лактозу и сахарозу и ряд показателей, с помощью которых удалось установить биохимическую активность микроорганизмов (табл. 2.3).

Таблица. 2.3

Изменение цвета среды Гисса в зависимости от применяемого индикатора

Эти среды культивировали в течение 7 дней при температуре 32 °C.

Следующей особенностью является устойчивость микроорганизмов к антибиотикам. На поверхность чашки Петри со средой АХО и посеянными микроорганизмами, используя метод «сплошного газона», помещали бумажные диски с антибиотиками: тетрациклином (15 мкг), ампициллином (10 мкг), эритромицином (15 мкг), линкомицином (15 мкг) и канамицином (30 мкг). Наблюдаемый ингибированный рост бактерий действием антибиотиков [1].

Для изучения способности микроорганизмов гидролизовать крахмал изолят высеяли на картофельный агар и культивировали при температуре 32°С в течение 7 дней. Места гидролиза крахмала определяли путем обработки йодсодержащими соединениями.

Был проведен тест на способность изолята продуцировать оксидазу и каталазу. Каталазная активность осуществлялась с помощью перекиси водорода, и образование каталазы выявлялось путем образования пузырьков газа на поверхности колоний. Для обнаружения оксидазы в культурах использовали стандартные диски, насыщенные хромогенным субстратом. Положительную реакцию можно было определить по изменению цвета диска, а именно темно-фиолетового, после введения на него исследуемого изолята.

Для определения грамположительности или грамотрицательности выделенной культуры использовали экспресс-метод с использованием 3% раствора KOH. Грамотрицательные микроорганизмы характеризовались образованием слизистых тяжей, для грамположительных микроорганизмов – их отсутствием. [1].

РАЗДЕЛ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование качественного и количественного состава биотопа закрытого грунта

Всего была выделена 41 колония из 5 различных сред. В окружающей среде Эшби не наблюдалось никаких колоний, хотя ожидалось, что на ней будут получены дрожжевые колонии. Это возможно из-за недостаточного количества наносимой суспензии к среде (таблица 3.1).

Таблица 3.1

Количественный состав колоний микроорганизмов замкнутого грунта

Общее количество микроорганизмов в замкнутом грунтовом образце составляет 0,82×10-5 КОЕ в 1 г почвы.

Проанализировав эти таблицы, можно сделать вывод, что наиболее распространенными микроорганизмами закрытого грунта являются грибы. Разница в количестве актиномицетов по сравнению с микроорганизмами бактериального происхождения довольно мала.

3.2. Морфо-культурные особенности изолята

Выбранная для идентификации бактериальная культура характеризовалась неправильной формой колоний серовато-белого цвета, с морщинистой поверхностью, приподнятым профилем, ризоидными краями и пастообразной консистенцией. При проведении микроскопии неподвижного лекарственного средства выделенной культуры наблюдались грамотрицательные палочковидные бактерии, среднего размера, размещенные поодиночке. Выделенные микроорганизмы обладали способностью образовывать эндоспоры и имели капсулы.

Исследуемая культура разлагала 2 из 5 используемых субстратов, а именно сахарозу и глюкозу, с образованием кислоты, без газа. На его среде наблюдался поверхностный рост в среде Гисса с мальтозой, что свидетельствует об облигатной аэробикности бактерий (табл. 3.2).

Таблица 3.2

Способность ферментировать углеводы

При определении чувствительности к антибиотикам наблюдалась задержка роста до: тетрациклина, ампициллина и линкомицина. Не наблюдалось чувствительности к эритромицину и канамицину (табл. 3.3), (рис. 3.2).

Таблица 3.3

Чувствительность тест-культуры к антибиотикам (мм диаметр зоны задержки роста)

Диаграмма 3.2

Чувствительность исследуемой культуры к антибиотикам (мм диаметр зоны задержки роста)

При изучении способности культуры продуцировать каталазу наблюдалось появление каталазной активности, которую можно обозначить как один плюс из четырех. Культура также дала положительный результат в исследовании амилолитической активности, которое оценивалось двумя из четырех профессионалов. Реакция на оксидазу была положительной (появление фиолетового цвета на диске) (табл. 3.2.3)

Таблица 3.2.3

Морфокультурные и физиолого-биохимические свойства выделенной культуры

Следовательно, основываясь на данных в таблице, полученный изолят выявил наибольшее сходство с родом Alcaligenes и видом Alcaligenes faecalis. Согласно определителю Берджи, этот тип микроорганизмов относится к группе 4, подгруппе 4а: грамотрицательные, аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки. [5].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования почвенной микрофлоры показали наличие большого разнообразия микроорганизмов, а именно: бактерий, грибов, актиномицетов.

Количество КОЕ исследуемого закрытого грунта составляет 0,82×10-5 г из 5 сред. Ни одна колония не была найдена в окружении Эшби.

По результатам экспериментов этот изолят способен продуцировать следующие ферменты: каталазу, амилазу, оксидазу и расщепление углеводов с образованием кислоты: глюкозы, сахарозы.

Исследования чистой культуры к антибиотикам показали чувствительность к ампициллину, резистентность к тетрациклинам, линкомицину и нечувствительность к канамицину и эритромицину.

Выделенный почвенный микроорганизм показал наибольшее сходство

с бактериями рода Alcaligenes, а именно с видом Alcaligenes faecalis.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Михальский Л.О., Радченко О.С., Степура Л.Г., Домбровская И.В., Фуртат И.М. Практикум по общей микробиологии // Учебник. – К.: Издательско-полиграфический центр «Киевский университет». – 2002. – 110 с.Buscot F., Varma A. Microorganisms in soils: roles in genesis and functions // Springer Berlin Heidelberg New York. – 2005. – 419 p.

Casida, Jr. Abundant Microorganism in Soil[Electronic resource] // Applied Microbiology, Мау 327-334, 1965: Proceedings. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1058252/?page=7

John Eric Cooper Molecular approaches to soil, rhizosphere and plant microorganism analysis // Department of Applied Plant Science. – 2006. – 297 р.

John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H. A. Sneath. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Ninth edition // Williams and Wikins. – Vol. 1. – 1997. – 434 p.

Kirk L.J., Beaudette L.A., Hart M.B. Methods of studying soil microbial diversity // Journal of Microbiological Methods. – 2004. – Vol.58. – P. 169 – 188.

Svend Binnerup Microorganisms asіndicators of soil health Soil[Electronic resource] // Microbial Ecology and Biotechnology, January, 2002: Proceedings. – Mode of access: http://www2.dmu.dk/1_viden/2_publikationer/3_fagrapporter/rapporter/fr388.pdf

Wear E. Breaking Down Pesticides: Soil Bacteria Play Essential Role // Journal of young investigators. – April, 2010. – Vol. 19, № 22. – P. 133-152.