XVIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Генная инженерия на дрозофиле
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
На современном этапе развития биологии, в частности генетики и молекулярной биологии, не просто исследуют генетический материал живых организмов, а активно его изменяют, получая гибридные организмы, несущие генетические конструкции. Именно на этих методах основывается генная инженерия. Одним из классических объектов генетики является дрозофила, которая и была взята для нашего исследования.
Цель работы: доказать встраивание генетической конструкции в дрозофил дикого типа.
Задачи работы:
Провести анализ литературных данных
Изучить молекулярно-биологические методы, используемые в генной инженерии
Выделить ДНК из дрозофил
Провести ПЦР
Провести электрофорез полученных ПЦР-фрагментов
Провести анализ полученных данных
Актуальность
Встраивание генетической конструкции в дрозофил является одним из этапов большого исследования, посвященного анализу регуляции экспрессии высоконсервативного гена, контролирующего деление клеток, а при мутациях вызывающего рак. Работы в данной области позволят в будущем создать лекарства, предотвращающие онкологию.
Обзор литературных данных
Строение гена и регуляция экспрессии
Ген – участок молекулы геномной нуклеиновой кислоты, имеющий специфическую для него последовательностью нуклеотидов, способный изменяться путем мутирования. Также ген является функциональной единицей наследственного материала [1].
1.2 МикроРНК
МикроРНК - короткие цепочки, блокирующие синтез того или иного белка, садясь на регуляторные участки генов (рис. 1).
МикроРНК связываются с РНК, в результате чего не происходит синтез белка [3].
Рисунок 1. Роль микроРНК с экспрессии гена
1.3 ПЦР
Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции [3].
Рисунок 2. Общая схема ПЦР.
Стадии цикла ПЦР (рис. 2):
Денатурация
Отжиг праймеров.
Синтез.
Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий искомого фрагмента [1].
При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем (рис. 3).
Рисунок 3. Компоненты ПЦР.
ПЦР используется для увеличения числа копий целевого гена в пробе. Реакцию проводят в специальном приборе – амплификаторе (рис.26). Для постановки ПЦР используются [7]:
ДНК-матрица
Два праймера
ДНК-полимераза
Нуклеотиды
аденин (А) гуанин (Г) цитозин (Ц) тимин (Т)
Ионы магния
Буферный раствор
Для каждого праймера подбираются условия проведения ПЦР с разными температурами, которые отображаются на температурном графике проведения реакции (рис. 4).
Рисунок 4. Температурный график ПЦР.
1.4 Электрофорез нуклеиновых кислот
Это направленное движение коллоидных частиц или макроионов под действием внешнего электрического поля [3] (рис. 5).
Рисунок 5. Электрофорез молекул ДНК.
Электрофорез является одним из широко используемых методов в молекулярной биологии. Происходит разделение в зависимости от размера молекул в пробе при движении под действием электрического тока. (рис.6).
Рисунок 6. ДНК маркер 100 (100-1000 bp).
Для визуализации результата агарозный гель после электрофореза помещают в трансиллюминатор, в котором при действии ультрафиолетового света наблюдается свечение предварительно добавленного в пробу бромистого этидия (рис.7), связанного с молекулами ДНК [7].
Рисунок 7. Образование комплекса бромистого этидия с ДНК.
Генная инженерия
В наследственный аппарат эукариота можно внести искусственные изменения методами генной инженерии, тогда такой организм будет называться трансгенным. Это очень важно, в частности, для селекции, а также для генетической науки.
Для создания организма с введенным в геном чужеродным геном используются пятью основными методами:
1) Введение ДНК в яйцеклетки;
2) Введение ДНК в стволовые клетки;
3) Введение ДНК с помощью векторов на основе вирусов;
4) Непосредственное введение ДНК при помощи трансфекции;
5) Введение ДНК с помощью липосом.
Генетические конструкции
Плазмиды – это внехромосомные молекулы ДНК, которые могут существовать автономно и несут гены для самокопирования (рис.8). В настоящее время плазмиды используются в генной инженерии в качестве векторов, которые привносят целевой ген [5].
Рисунок 8. Плазмида и схема ее вставки в геном.
Ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP)
Зелёный флуоресцентный белок (англ. green fluorescent protein, GFP) — белок, который флуоресцирует в зелёном диапазоне при освещении его светом от синего до ультрафиолетового диапазона. Он широко используется в качестве светящейся метки в клеточной и молекулярной биологии для изучения экспрессии клеточных белков [7].
Дрозофилы
Дрозофила - мелкое насекомое отряда двукрылых (Diptera), семейства плодовых мушек (Drosophilidae). Слово дрозофила древнегреческое и означает «любящий росу». Насекомое причислили к роду Drosophilaморфологически, тогда как современные генетические исследования относят её к роду Sophophora. Род по современным данным насчитывает 1529 видов дрозофил [4]. Дрозофила демонстрирует половой диморфизм: длина тела самки 1,5-3 мм, самца значительно меньше, задняя часть темнее (рис. 9).
Рис. 9. СамецисамкаDrosophila melanogaster (Madboy, 2012)
Множество законов в генетике были выявлены или подтверждены благодаря дрозофиле [1].
Рисунок 10. Филогения рода Drosophila.
Ras-ген
Протоонкогены – гены при нарушении функционирования которых развивается онкогенез. Большинство протоонкогенов относятся к семейству Ras. Они высококонсервативны и их нуклеотидная последовательность мало изменчива от дрожжей до человека. Синтезируемые на их основе белки Ras, участвуют в клеточном делении. Данная особенность позволяет использовать в качестве модельного организма дрозофилу, у которой присутствует представитель данного семейства ген Dras1. На его примере будут рассмотрены особенности регуляции экспрессии протоонкогенов. Семейство RAS–генов имеет большое число представителей (рис.11).
Рисунок 11. Семейство Ras белков.
Ген Dras1 является представителем протоонкогенов семейства Ras и встречается у дрозофил, на что указывает первая буква в названии (рис.12).
Рисунок 12. Экзон–интронная структура гена Dras1.
Материалы и методы
Дрозофилы
Рисунок 13. Коллекция дрозофил
В ходе исследования были использованы линии дрозофил группы virilis дикого типа, взятых из коллекции (рис. 13) Института биологии и развития им. Н.К. Кольцова РАН (рис.14).
Рисунок 14. Дрозофилы группы virilisна стандартном корме.
Рисунок 15. Сайт посадки микроРНК.
У дрозофил группы virilis в 3`-некодирующей области гена Ras85D были обнаружены сайты посадки кластера микроРНК (92, 310, 311, 312, 313) (рис. 15).
Рисунок 16. Схема генетической конструкции.
Рисунок 17. Дрозофилы, c экспрессией гена GFP
Рисунок 18. Экспрессия гена GFP в глазах дрозофилы
Выделение ДНК
ДНК экстрагировали из гомогената живых мух, согласно методике Gloor (1992) (рис.19, 20).
Рисунок 19. Оборудование для молекулярного анализа.
Рисунок 20. Выделение ДНК из дрозофил.
ПЦР
Для проведения полимеразной цепной реакции использовался термоциклер PCH-3 (Techne, United Kingdom)
Рисунок 21. ПЦР продукт
Электрофорез ДНК
Использовали набор Bluegel от фирмы Phywe (рис. 22) [9].
Рисунок 22. Набор для электрофореза
Используемый маркер (11 фрагментов от 100 до 1500 п.н.) (рис. 23) [8]/
Рисунок 23. Маркер длины фрагмента ДНК
Результаты
Выделили ДНК из дрозофил, несущих генетическую конструкцию с геном GFP. Провели ПЦР по участку, несущему сайт связывания с микроРНК, используя соответствующие праймеры. В результате электрофореза доказано наличие целевого фрагмента длиной 200 пар оснований в пробах (рис. 24).
Лунки:
1 – маркер 100bp
2 – контроль (дикий тип)
3, 4, 5, 6 – повторности опыта (дрозофилы с генетической конструкцией)
Рисунок 24. Результат электрофореза.
Выводы
Из трансгенных дрозофил выделена ДНК.
Методом ПЦР увеличено количество копий целевого гена.
Методом электрофореза ДНК в агарозном геле доказано встраивание генетической конструкции в дрозофил дикого типа.
Заключение
Генная инженерия в наше время является актуальным направлением в молекулярной биологии. Если раньше исследовали имеющийся генетический материал, то теперь человек научился изменять исходные признаки организмов.
В ходе нашей работы было показано встраивание генетической конструкции в дрозофил дикого типа. Работы в данной области позволят в будущем создать лекарства, предотвращающие развитие онкологических заболеваний.
В дальнейшем мы планируем освоить и другие методы, такие как проведение ПЦР в реальном времени, для сравнения степени экспрессии исследуемого гена под влиянием отдельных видов микроРНК.
Данная работа поддержана грантом РФФИ № 16-34-00840 мол_а.
Список использованной литературы
Гайсинович А.Е. Зарождение и развитие генетики / Москва, Наука, 1988, с. 424
Гончаренко Г.Г. Аллозимная диагностика видов-двойников Drosophila группы virilis // ДАН СССР, 1987, Т. 295. N 4, с. 976–980.
Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика / Новосибирск, Издательство Новосибирского университета, 2002, с. 459.
Козак М.Ф. Дрозофила – модельный объект генетики / Методическое пособие, Астрахань: Издательский дом: «Астраханский университет», 2007, с. 87
Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. 2-е изд., перераб. и доп. / Учебник для вузов. СПб: Изд-во СПбГТУ, 2002, с. 522.
Сивопляс Е.А., Чекунова А.И., Куликов А.М. Сравнительная характеристика эволюционной изменчивости гена Dras1 у видов групп D.melanogaster (Sophophora) И D.virilis (Drosophila) // Сборник тезисов Всероссийской конференции «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы», Москва, 8-10 ноября 2016, с. 282.
Ф. Айала, Дж. Кайгер. Современная генетика. В трёх томах / Москва, «Мир», 1988, Т. Т. 1.
https://www.helicon.ru/catalog/reagenty/elektroforez/markery-dliny-dnk-100bp-dna-ladder-11-fragmentov-ot-100-do-1500-p-n-/#close
https://www.phywe.eu/biology/microbiology-and-genetics/molecular-genetics/bluegel-gel-electrophoresis-unit-with-integrated-illuminator_10765_11752/
Приложение