XVIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Особенности структурно - морфологической реорганизации сердечной мышцы в условиях холодового стресса
Автор работы награжден дипломом победителя I степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Общее охлаждение организма и местная холодовая травма является весьма актуальной проблемой для России. Ввиду расположения большой части страны в суровых климатических регионах (районы Крайнего Севера. Сибири, Дальнего Востока) термические низкотемпературные поражения достигают 20% от всех травматических поражений в мирное время. Проблема холодовой травмы заключается еще в ее осложнениях и отдаленных последствиях в виде нарушения передачи нервных импульсов, нарушения реологических свойств крови с последующими тромбозами и некрозами тканей конечностей и внутренних органов с развитием воспалительных осложнений и присоединением патогенной флоры .
Гипотермия — патологическое состояние биологической системы, которое развивается в ответ на снижение температуры внутренней среды ниже 35,0°С. Выделяют следующие степени гипотермии: легкая, умеренная, тяжелая, крайне тяжелая (глубокая).
После воздействия холода на организм человека запускается целый каскад адаптационно - приспособительных реакций. К проявлениям адаптации можно отнести: уменьшение объема гликогена, как основного энергетического субстрата в миокарде, печени, скелетной мускулатуре и в остальных органах, снижение частоты дыхательных движений и частоты сердечных сокращений, что приводит к понижению давления в сосудистом русле и соответственно понижению скорости тока крови, в результате чего происходит стаз и агрегация эритроцитов с развитием гипоксии тканей и органов.
Доля районов Севера в Российский федерации составляет 70%, где проживает 11,7 млн человек [1]. В условиях Севера воздействие холода является мощным стрессорным фактором, который является пусковым механизмом в развитии изменений метаболических процессов во всем организме и в том числе в сердечной мышце [2]. В тоже время активная индустриализация арктической зоны способствует активному изучению механизмов адаптации человека к холодовому фактору [3].
В основе приспособления человека к условиям внешней среды лежат физиологические, биохимические и социально - бытовые механизмы адаптации [4]. Скорость, темп и характер адаптивных реакций во многом зависит от состояния организма человека [5].
Воздействию на организм человека низких температур на современном этапе уделяется большое внимание [6], но данные исследования в большей мере посвящены изучению вопросов танатогенеза сочетанной патологии, когда выявляется не только действие на организм низкой температуры, но и действие иных физических и химических факторов (травмы, отравления) и соматическая патология.
Важнейшим методом оценки воздействия холодового фактора на организм человека является морфологический метод [7, 8]. На данный момент изученные и представленные морфофункциональные изменения возникающие при холодовой травме достаточно скудны, а большинство из них можно отнести к неспецифичным, встречающимся при смерти от разных причин, а следовательно их использование в полной мере является весьма ограниченным. Серьезной проблемой является проведение дифференциальной диагностики, когда выявленные морфологические признаки не являются специфичными и могут встречаться и при других патологиях [9, 10].
Заслуживают внимания работы, посвященные структурным изменениям ядерного аппарата клеточных элементов и морфофункциональные изменения тучноклеточной популяции при гипотермии [11, 12, 13]. Данные исследования доказывают отрицательное влияние низких температур на структуру ядра и тучные клетки, а морфологические параметры, полученные при исследовании могут быть использованы как специфические и адаптивные.
В литературе имеется небольшое количество работ посвященных морфологии миокарда при гипотермии [14, 15, 16]. Поэтому исследование морфологических изменений миокарда при гипотермии актуально.
Цель исследования: изучить особенности структурно - морфофункциональной реорганизации кардиомиоцитов экспериментальных животных после воздействия глубокой однократной водной гипотермии.
Задачи исследования:
- изучить и проанализировать доступные литературные данные о вариантах танатогенеза при холодовой травме, их морфологических признаках, и дифференциально - диагностическом значении этих признаков;
- изучить методику проведения эксперимента, методику моделирования глубокой гипотермии;
- изучить и применить в практике методику подготовки, изготовления и покраски гистологических препаратов;
- описать и исследовать качественными и количественными методами морфологические изменения происходящие в ядрах кардиомиоцитов крыс в разные периоды после однократной глубокой иммерсионной гипотермии.
Основная часть
Материалы и методы исследования
Для исследования было использовано 15 крыс линии Вистар половозрелого возраста мужского пола. Средняя масса особи составила 200 - 250 граммов. Холодовой стресс моделировался в экспериментальных условиях путем помещения животных (15 особей) в отдельных клетках в емкости с водой на глубину 5 см. Средняя температура воды составляла + 5,0 °С, температура окружающего воздуха составила + 7.0 °С. Время проведения эксперимента в среднем составляло 40 ± 8 минут. Основным признаком достижения глубокой степени гипотермии являлось понижение ректальной температуры до +20... +23 °С. Контрольную группу составляли 5 животных которых помещали в воду температурой +30 градусов на время нахождения в воде для опытной группы.
Использование экспериментальных животных осуществлялось в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте. В целях гуманности и устранения влияния стресса на результаты исследования умерщвление и обезболивание проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Выведение животных из эксперимента происходило сразу после гипотермии, а также на 2, 7 и 14 день после эксперимента методом декапитации под действием эфирного наркоза. Извлечение внутренних органов осуществлялось единым органокомплексом. Для проведения дальнейших гистологических исследований забирались фрагменты ткани сердца размером 0,5 на 0,5 см. Фрагменты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24–48 часов. В дальнейшем фрагменты обрабатывались в автомате с последующей заливкой в парафин в станции парафиновой заливки. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Окраска препаратов осуществлялась гематоксилин - эозином и с целью выявления ишемического повреждения миокарда гематоксилином – основным фуксином – пикроновой кислотой (ГОФП). Препараты изучали и фотографировали при помощи медико - биологического микроскопа Nikon Eclipse E200 с камерой цифровой специализированной DS 1000 при увеличении х 400. При проведении морфометрического анализа кардиомиоцитов использовалась программа «Image Tool 3.0.». Статистическая обработка полученных данных осуществлялась при помощи программы «Statistica 10.0» и программы «MS Excel 2016».
Результаты исследования и их обсуждение
Контрольная группа. Миокард был представлен группами кардиомиоцитов формирующих пучки расположенные плотно друг к другу. Кардиомиоциты были представлены в виде клеток, где на фоне эозинофильной цитоплазмы с отчетливо выраженным рисунком миофибрилл расположены палочковидные ядра, умеренно окрашенные гематоксилином. В строме располагались умеренно полнокровные сосуды. Подавляющее количество кардиомиоцитов имели два ядра. Ядра небольших размеров (Приложение №1, рис. 1 а). Площадь ядер кардиомиоцитов составила 37,2 ± 2 мкм2, периметр ядер составил 27,3 ± 0,8 мкм (таблица 1). При окраске на ишемические повреждения, миокард имел желтоватую окраску, участков фуксинофилии обнаружено не было (Приложение №1, рис. 1 б).
Таблица 1
Морфометрические параметры кардиомиоцитов крыс после проведения однократной глубокой водной гипотермии
|
Параметры |
Контроль (I) |
День эксперимента |
|||
|
Сразу после гипотермии (II) |
2-ой день (III) |
7-ой день (IV) |
14-й день (V) |
||
|
Площадь ядра (мкм2) |
37,2 ± 2 |
22,2 ± 1,3 |
29,5 ± 1,5 |
45,3 ± 1,2 |
28,1 ± 0,9 |
|
Периметр ядра (мкм) |
27,3 ± 0,8 |
24,2 ± 0,7 |
26,7 ± 0,9 |
30.2 ± 0,6 |
27,5 ± 0,6 |
Экспериментальная группа исследования. В ткани сердца сразу после воздействия однократной глубокой иммерсионной гипотермии наблюдается выраженный отек и признаки миолиза кардиомиоцитов, формирование оптических пустот, потеря исчерченности и нечеткость границ мышечных волокон. Ядра мышечных волокон полиморфной формы, гиперхромные, пикнотичные (Приложение №2, рис. 2а).
Площадь ядер кардиомиоцитов составил - 22,2 ± 1,3 мкм2, периметр ядер - 24,2 ± 0,7 мкм. При покраске ГОФП по Lie отмечали крупные, сливающиеся между собой, поля фунсинофильного миокарда. Доля кардиомиоцитов в состоянии ишемии составила - 51,9%±1,8 (Приложение №2, рис. 2б).
Строма вокруг пучков клеток имеет нечеткие границы, отмечаются признаки выраженного интерстициального отека. Выражено неравномерное кровенаполнение сосудов микроциркуляторного русла, полнокровие капилляров и венул. Стенка артерий утолщена за счет отека и набухания.
На 2 сутки постгипотермического периода ткань сердца выглядела умеренно отечной явления миолиза, просветление цитоплазмы, утрата исчерченности, нечеткость границ мышечных волокон сохранялись. Ядра кардиомиоцитов были с нечеткими границами, пикнотичные. Явления интестициального отека уменьшались (Приложение №3, рис. 3а). Площадь ядер кардиомиоцитов увеличивалась до 29,5 ± 1,5 мкм2, периметр ядер возрастал до 26,7 ± 0,9 мкм. Окраска по ГОФП свидетельствовала об уменьшении ишемического повреждения кардиомиоцитов. Доля фуксинофильных кардиомиоцитов составила - 45,5%±5,1 (Приложение №3, рис. 3б).
На 7 сутки постгипотермического периода ткань миокарда в состоянии умеренно выраженного отека. Явления миолиза и неравномерности просветления цитоплазмы уменьшались. Ядра мышечных волокон выглядели увеличенными (Приложение №4, рис. 4а). Площадь ядер кардиомиоцитов составила - 45,3 ± 1,2 мкм2, периметр ядер - 30,2 ± 0,6 мкм (таблица 1). Отмечалось дальнейшее уменьшение фуксинофилии кардиомиоцитов, доля фуксинофильных мышечных волокон составила - 10,8%±2,5 (Приложение №4, рис. 4б).
На 14 сутки после однократной водной глубокой гипотермии в миокарде явления отека были выражены слабо. Размеры ядер кардиомиоцитов по сравнению с предыдущим сроком имели тенденцию к уменьшению (Приложение №5, рис. 5а). Площадь ядер составила - 28,1 ± 0,9 мкм2, периметр ядер - 27,5 ± 0,6 мкм. (таблица). При окрашивании по ГОФП была отмечена фуксинофилия отдельных мышечных волокон, доля фуксинофильных кардиомиоцитов составила - 4,4±1,2 (Приложение №5, рис. 5а).
Заключение
В исследовании был проведен сравнительный анализ морфо - функциональной реорганизации миокарда крыс после однократной водной глубокой гипотермии. Результаты исследования показали, что гипотермия как неблагоприятный физический фактор окружающей срезы оказывала выраженное повреждающее действие на кардиомиоциты сердечной мышцы экспериментальных животных. При этом сразу после воздействия холодового фактора отмечали выраженные морфологические изменения стромы и ядер кардиомиоцитов крыс: сморщивание, кариопикноз, что может быть связано с повреждающим действием холода. Кариометрические измерения позволили обнаружить, что сразу после воздействия стрессового фактора площадь ядер кардиомиоцитов уменьшилась на 40 %, периметр ядер кардиомиоцитов уменьшился на 12% и объемная доля кардиомиоцитов в состоянии ишемии достигала 51,9% посравнению с контрольной группой. Выявленные изменения могут являться следствием метаболической депрессии миокарда, инактивации анаболических процессов, активации свободно - радикального окисления липидов и гипоксии. В постгипотермическом периоде ядра кардиомиоцитов увеличивались в размере, они были набухшие, светлые, число кардиомиоцитов в состоянии ишемии уменьшалась. На 7 день постгипотермического периода морфометрические параметры ядер были наиболее высоки, что может быть объяснено адаптивной компенсаторно-приспособительной реакцией и активацией синтетических процессов в ядерном аппарате, число кардиомиоцитов в состоянии ишемии при этом уменьшалось в 4,8 раза и составило 10,8%±2,5. На 14 день эксперимента кариометрические показатели практически приходили к норме, кардиомиоциты с ишемическими повреждениями были единичны.
Результаты проведенного исследования подтверждают важность и практикоориентирвоанность изучения морфологических изменений происходящих в органах и тканях при холодовом стрессе. Системное изучение морфо - функциональных особенностей реорганизации ткани в условиях холодовой травмы может позволить прийти к более полному пониманию особенностей развития компенсаторно - приспособительных реакций формирующихся на фоне гипотермического повреждения, сформулировать наиболее четкие критерии (морфологические признаки) подтверждающие смерть от переохлаждения.
Приложения
Приложение №1
Миокард крыс контрольной группы исследования: а - миокард представлен группами кардиомиоцитов формирующих пучки расположенные плотно друг к другу. б – фуксинофильные кардиомиоциты отсутствуют, клетки сердца имеют желтоватую окраску.
Приложение №2
Морфология миокарда крыс сразу после воздействия однократной глубокой иммерсионной гипотермии: а – выраженный отек и миолиз кардиомиоцитов, потеря исчерченности, нечеткость границ мышечных волокон, ядра пикнотичные. б – крупные, сливающиеся между собой, поля фунсинофильного миокарда.
Приложение №3
Морфология миокарда крыс на 2-ой день после однократной глубокой иммерсионной гипотермии: а –явления интестиционального отека уменьшаются. видна утрата исчерченности, ядра кардиомиоцитов пикнотичные. б – число фуксинофильных мышечных волокон уменьшается.
Приложение №4
Морфология миокарда крыс на 7-ой день после однократной глубокой иммерсионной гипотермии: а – ткань миокарда в состоянии умеренно выраженного отека, явления миолиза и просветление цитоплазмы выражены слабо, ядра кардиомиоцитов увеличены. б - уменьшение фуксинофилии кардиомиоцитов.
Приложение №5
Морфология миокарда крыс на 14-ой день после однократной глубокой иммерсионной гипотермии: а - явления отека выражены слабо, размеры ядер карциомиоцитов уменьшены. б – мелкие очаги фуксинофилии мышечных волокон.
Список литературы
Карпин В.А. Медицинская экология Севера: актуальность, достижения и перспективы (обзор литературы) // Экология человека. 2021. №8. С. 4-11.
Заднипряный И.В., Сатаева Т.П., Третьякова О.С. Патоморфологические изменения миокарда крыс при воздействии гипобарической холодовой гипоксии // Оперативная хирургия и клиническая анатомия. 2019. №2. С. 13-18.
Грибанов А.В., Аникина Н.Ю., Гудков А.Б. Церебральный энергообмен как маркер адаптивных реакций человека в природно-климатических условиях Арктической зоны Российской Федерации // Экология человека. 2018. №8. С. 32-40.
Салтыкова М.М. Физиологические механизмы адаптации к холоду // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2016. № 4. С. 5-12.
Бобров И.П., Лепилов А.В., Долгатов А.Ю., Крючкова Н.Г., Бакарев М.А., Молодых О.П. Влияние среды охлаждения на плоидометрические параметры гепатоцитов белых крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. № 2. С. 163-168.
Бобров И.П., Лепилов А.В., Крючкова Н.Г., Долгатов А.Ю., Гулдаева З.Н., Орлова О.В., Шепелева Н.В., Лушникова Е.Л., Бакарев М.А., Молодых О.П. Морфофункциональная характеристика ядер гепатоцитов печени крыс после воздействия гипотермии // Современные проблемы науки и образования. 2019. № 6. URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=29375 (дата обращения: 02.08.2022).
Шигеев В.Б., Шигеев С.В., Колударова Е.М. Холодовая смерть. М., 2004. 184 с.
Витер В.И., Халиков А.А. Смерть от действия низкой температуры // Судебная медицина в лекциях. Уфа, 2003. С. 159-163.
Збруева Ю.В., Джуваляков П.Г., Букешов М.К., Богомолов Д.В., Федулова Судебно-медицинская оценка танатогенеза при переживания механической и термической травмы // Судебно-медицинская экспертиза. 2012. №5. С. 24-26.
Фролова И.А. Судебно-медицинская диагностика действия холодового фактора в случаях наступления смерти поступивших в стационаре // Судебная медицина. – 2016. – Т.2., №4. – С. 18 – 20.
Бобров И.П., Лепилов А.В., Гулдаева З.Н., Долгатов А.Ю., Алымова Е.Е., Крючкова Н.Г., Лушникова Е.Л., Молодых О.П. Тучноклеточная инфильтрация легких крыс после гипотермии // Современные проблемы науки и образования. 2019. № 1. URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=28446 (дата обращения: 02.08.2022).
Луценко М.Т., Луценко М.М., Шматок М.И. Повреждающее действие низких температур на миофибриллы кардиомиоцитов // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2013. Т. 48. С. 56-62.
Трофимова А.В., Чиж Н.А., Белочкина И.В., Волина В.В., Сандомирский Б.П. Морфологические характеристики сердца после индукции терапевтической гипотермии и введения мезенхимальных стволовых клеток в терапии экспериментального инфаркта миокарда // Морфология. 2016. №3. С. 288-292.
Бобров И.П., Лепилов А.В., Долгатов А.Ю., Корсиков Н.А., Гулдаева З.Н., Крючкова Н.Г., Соседова М.Н., Долгатова Е.С., Лушникова Е.Л., Бакарев М.А. Тучные клетки миокарда при воздействии гипотермии // Современные проблемы науки и образования. – 2021. – № 5. URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=31160 (дата обращения: 02.08.2022).
Корсиков Н.А., Лепилов А.В., Бобров И.П., Долгатов А.Ю., Долгатова Е.С., Бабкина А.В., Гервальд В.Я., Бульбенко М.М., Бычкунов В.А., Чикменев А.В., Лушникова Е.Л., Бакарев М.А. Некоторые особенности структурно - морфологической реорганизации миокарда крыс при глубокой гипотермии в эксперименте // Современные проблемы науки и образования. 2022. № 4.
Бабкина А.В., Долгатов А.Ю., Лепилов А.В., Бобров И.П., Корсиков Н.А., Казарцев А.В., Долгатова Е.С., Невмержицкая А.И., Раевская В.В., Соседова М.Н., Бульбенко М.М. Особенности морфофункциональных изменений миокарда в условиях гипотермического повреждения // Современные проблемы науки и образования. 2022. № 2.