XVIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Изучение полного цикла выращивания картофеля с использованием технологии микроклонального размножения
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Среди важнейших областей современной биотехнологии особое место занимает микроклональное размножение растений, находящее широкое практическое приложение: от фундаментальных научных исследований до производства посадочного материала сельскохозяйственных растений и лесных пород деревьев.
В нашей стране основным продуктом питания, не требующий каких-либо особых условий выращивания является картофель. По данным россстата 2022 год было собрано 18,7 млн тонн [2]. Для того, чтобы увеличивать объем производства, а также возможность более быстро выводить новые сорта, в нашей стране стала активно использоваться технология микроклонального размножения картофеля. Я задумался, а какие макро и микро элементы влияют на микроклональное размножение картофеля. Это и стало отправной точкой моего проекта.
Цель: изучения влиния разных микро и макрокомпонентов на микроклональное изучение картофеля.
Задачи:
Изучить теорию о микроклональном размножении картофеля
Изучить теорию о организации биохимической лаборатории
Пройти необходимый инструктаж для работы с образцами
Размножить образцы, провести эксперемент
Обработать результаты, составить сводную таблицу, сделать вывод
Гипотеза: Выживаемость и развитие картофеля при микроклональном размножении будет выше если в контрольную средудобавить NO3 компоненты
Объект исследования: картофель
Предмет исследования: микроклональное выращивание
Продукт проекта: научный проект
Глава 1: Изучение литературы по теме
Технология микроклонального размножения.
Микроклональное размножение – массовое бесполое размножение растений в культуре клеток и тканей, при котором возникшие формы растений генетически идентичны исходному экземпляру. [1]
Микроклональное размножение представляет собой размножение “in vitro” – в переводе с латыни «за стеклом».
Основоположником микроклонального размножения является французский ученый Жорж Морель. Он в 1960 году разработал этот метод и проэксперементировал его. Он взял верхушку цимбидиума (сем. орхидные), состоящую из конуса нарастания и двух трёх листовых зачатков, из которых при определенных условиях появлялись сферических образования – протокормы. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно получить в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал. [1]
В нашей стране разработка этого метода началась в 60-ых годах в лаборатории тканей растений в Институте физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН.
Микроклональное размножение используют для многих сфер, представленныз в приложении А
Микроклональное размножение в большинстве случаев включает 3 последовательные стадии: получение асептической культуры; мультипликацию, то есть увеличение количества/размножение пропагул; подготовку для адаптации микроклонов в почве. Дополнительно можно выделить подготовку маточных растений к получению из них первичных эксплантов для введения в культуру in vitro, а также завершающую стадию адаптации клонированных растений к условиям ex vitro. Таким образом, можно рассматривать 5 стадий данной технологии.
Способы микроклонального размножения
Стадия 1 – подготовка маточных растений
Ключевая задача данной стадии – снижение потенциального содержания микроорганизмов (главным образом, грибов) в будущем экспланте, облегчение доступа к меристемам, увеличение их размеров и жизнеспособности. В этой связи для некоторых видов, например для древесных растений, часто используется так называемая выгонка молодых побегов непосредственно перед выделением эксплантов – молодых почек, верхушечных побегов и сегментов стебля, содержащих меристемы. Для травянистых форм часто создается первичная культура целых растений из семян, что значительно повышает эффективность дальнейших этапов получения высокопроизводительных систем размножения.
Стадия 2 – введение растений в асептическую культуру
На данном этапе осуществляется стерилизация растительного материала и перенос на питательные среды изолированных эксплантов, которые дают рост микрорастениям или недифференцированной защитной ткани – каллусу.
Обычно первичный прирост наблюдается в период от 3–10 суток (травянистые) до 1–3 месяцев. Задача этапа – получение стерильных и жизнеспособных эксплантов, способных к росту и развитию in vitro. Для некоторых растений достижение необходимой степени стерильности или развитие в таких условиях оказывается невозможным. Данный феномен называется редандностью к культивированию in vitro. У многих древесных растений, таких как дуб, ель, сосна и др., этот показатель высок, что связано с большой развитостью микоризных грибов внутри их тканей.
Одним из центральных вопросов на этой стадии является подбор обработок для стерилизации оборудоания, которая часто проводится в несколько этапов. Самые основные этапы это обработка спиртом(20-100%), затем пребывание в сухожаре(1-24ч).
Также в этом этапе главную роль играют среды, в которых будет развиваться эксплант. Составы специализированных сбалансированных минеральных сред, таких как «Мурасиге и Скуга», «Као и Михайлюка», «Гамборга», «Ллойда и Маккоуна», «Линдсмайера», «Нитша», «Литвая», «Орхимакс» и др., были разработаны под определенные протоколы культивирования in vitro, виды растений и особые типы экспериментов. Очень часто используются цитокинины (0,05–5 мг/л кинетина, 6-бензиламинопурина, зеатина или др.), так как они стимулируют рост побегов в культуре in vitro, блокируя рост корневой системы. Также могут добавляться вещества, такие как витамины и источники природной органики (дрожжевой экстракт, кокосовая вода, картофельный отвар, фруктовые соки, меласса, патока и др.), которые для некоторых культур стимулируют процессы роста и развития.
Стадия 3 – Мультипликация, увеличение количества органов вегетативного размножения
Данная стадия обеспечивает увеличение количества растений в результате их клонирования. Это реализуется микрочеренкованием in vitro или индукцией соматического эмбриогенеза – формированием эмбрионов в обычных тканях или предварительно полученном каллусе (реже в суспензионной культуре). Для сохранения сортовых признаков, которые часто наследуются эпигенетически или только при наличии интактных меристем, часто используется микрочеренкование, поскольку оно обладает меньшей инвазивностью и влиянием на структуру меристем, чем соматический эмбриогенез. Однако микрочеренкование отличается невысоким коэффициентом размножения/пропагации. Обычно для древесных растений можно получать 4–5 микроклонов из одного в течение 1,5–3 месяцев, то есть при дальнейшем субклонировании («расклоне») около тысячи микроклонов за год. В реальности эта цифра значительно ниже, так как происходит выбраковка растений, зараженных при пересадке, наблюдается непредсказуемое снижение скорости роста, повреждение растений или даже их синхронная гибель (характерно для редандных древесных видов). Для многих травянистых культур используется соматический эмбриогенез, обычно демонстрирующий более высокие коэффициенты размножения.
Стадия 4 – Подготовка для адаптации микроклонов в почве
Перед выведением растений в условия ex vitro – за стеклом – необходимо простимулировать рост корневой системы. В случае размножения микрочеренкованием все чаще используются безгормональные среды, позволяющие формироваться у микроклонов корневой системе.
При соматическом эмбриогенезе из ткани может понадобиться индукция формирования корневой системы, что достигается переводом пропагул со сред, содержащих цитокинины, на безгормональные или содержащие ауксин (0,05–5 мг/л) среды. Так или иначе подготовка к адаптации связана с получением относительно крупных, жизнеспособных и имеющих корень микрорастений. Хотя имеются методики использования растений без корней, они обычно не применяются на практике, так как дают низкий выход жизнеспособных растений. Иногда используется снижение уровня минеральных солей и концентрации сахарозы. Однако такой прием «преадаптации» требует дополнительных трудоемких манипуляций и его эффективность обычно невысока.
Стадия 5 – Адаптация микроклонов к условиям exvitro
ультивационных сосудов и прекращение использования стерильных условий. Растения отмываются от гелевой среды и в большинстве случаев обрабатываются корнестимуляторами, содержащими ауксины (10–200 мг/л). Затем они высаживаются в твердый субстрат, который может иметь разнообразный состав: торф, вермикулит, перлит, диатомит, керамзит, песок и др. В большинстве случаев подбирается их смесь. Например, часто используются торф с вермикулитом в соотношении 1:1, 1:2, 2:1, торф, песок и вермикулит – 1:1:1, 1:1:3 и др. Субстрат может стерилизоваться в автоклаве, что всегда способствует лучшему выживанию и укоренению микрорастений, однако это не всегда экономически целесообразно в условиях крупных питомников с большими объемами производства. В течение 2–10 суток после перевода в условия ex vitro микроклоны помещаются в условия повышенной влажности воздуха, что позволяет побегам лучше адаптироваться. Стадия перевода в условия ex vitro часто является лимитирующей для микроклонального размножения растений. Осмотический и механический стресс, а также заражение грибами и бактериями может элиминировать до 100% микроклонов при их адаптации (обычно эта цифра составляет более 50%). Растения при этом ослаблены, их устьичный аппарат недоразвит, они поначалу не способны самостоятельно производить сахара и другие метаболиты. Поэтому на данной чувствительной стадии могут быть использованы биоциды (фунгициды), адаптогены (брассиностероиды, корнестимулирующие и фунгостатирующие бактерии), антиоксиданты (L-аскорбат, восстановленный глутатион и др.). Для различных растений эффективность обработок этими агентами разнится, но в целом при тщательном их подборе отмечается положительный результат [3].
Организация биохимической лаборатории при работе с технологией микроклонального размножения
Микроклональное размножение может проходить только в специальных лабораторных комплексах.
В каждой секции лаборатории должны быть предусмотрены: микробиологический бокс для работы с растениями – изолированный бокс для работы в режиме 100% стерильности, средовая – комната для приготовления различных сред питания, стерилизационная – комната для стерилизации оборудования соответствующими приборами, препораторная – комната для подготовки хим. посуды для растений.
В микробиологическом боксе должен располагаться ламинарий бокс( рис.1) – рабочая зона для производства клонов растений с лабораторными весами ( рис. 2). Также в ламинарном боксе должно присутствовать антисептическое средство для непосредственной стерилизации приборов.
Рис.1 – Ламинарный бокс Рис.2 – лабораторные весы
В стерилизационной комнате для стерилизации приборов, расходных материалов(пробирок, скальпелей, штативов, чашек Петри, используют автоклавы(рис.3) и сухожары(рис.4)
Рис.3 – автоклав Рис.4 – сухожар
Для хранения и прорастания уже начеренкованых образцов используют термостаты (рис.5) – боксы с регулятором температуры, влажности для создания условий пророста растений.
Рис.5 – термостат.
Соблюдение этих правил огранизации позволяет эффективно проводить работу по микрочеренкованию растений
Также важно содержание микро и макро элементов в растений. Проанализровав источники, я составил таблицы(Приложение 1,2 таблицы)
Несмотря на множество типов, я рассмотрю только один, микрочеренкование, который в дальнейшем буду практиковать.
Метод культуры тканей представляет собой микромасштабный и усовершенствованный вариант традиционного черенкования. Асептические добавки и соответствующие питательные добавки позволяют в случае необходимости уменьшить размер экспланта до нескольких миллиметров и увеличить коэффициент размножения. Микрочеренкованием размножают большое количество культур. 10 Клональное микроразмножение картофеля путем черенкования осуществляется следующим образом. Клубни картофеля проращивают 10-15 дней. За это время на них появляются длинные желтоватого цвета побеги с мелкими недоразвитыми листьями. Такие побеги называются этиолированными, они сохраняют ювенильные свойства. Стебли разрезают на фрагменты, содержащие одну почку, стерилизуют и помещают на питательную среду. Вскоре сегменты стебля, находящиеся в пробирках, образуют растения, которые размножают черенкованием. Для этого растения вынимают из пробирки и разрезают на сегменты с одним листом и пазушной почкой. (Приложение 3 схема)
Сегменты переносят в пробирки с питательной средой. Из них образуются растеньица, которые можно переносить в почву, где они превращаются в нормальные растения картофеля. Переместив пробирочные растения на среду иного состава и в иные условия освещения можно вызвать образование крошечных клубней (так называемые «микроклубни»). Данная технология позволяет выращивать большое количество растений в ограниченном пространстве: каждый лоток может содержать до 500 проростков на квадратный метр. В течение шести месяцев отдельный проросток может произвести до 100 000 клонов.
Итак, после анализа работы можно вывести общие преимущества и недостатки.
Преимущества микроклонального размножения растений в сравнении с обыкновенными методами:
Получение генетически однородного материала;
Выскокий коэффицент размножения: возможно увеличить количество клонов до 100000-1000000 миллионов в год, а при обычном 5-100 клонов за тот же срок;
На выходе получаются «чистые» растения (без инфекций);
Независимость от времен года.[1]
Недостатки микроклонального размножения в сравнении с традиционными методами:
Нет разнообразия растений на выходе.
Глава 2: Практическая часть
2.1. Методика и проведение исследования
Изучение технологии микроклонального размножения картофеля и ее применение
1.На базе регионального подразделения «Сириус» «Курчатов Центр» нам предоставили лабораторию, подходящую для микроклонального размножения. Прослушав инструктаж и теоритическую часть( приложение 3), нас допустили до размножения. Сначала мы оделись в стериальные халаты ( приложение 4,5). Затем куратор показал как продезинфицировать инструменты и мы начали работу.
2.Сначала мы брали материнское растение, доставали из пробирки. Потом его черенковали на 2-3 части, и с помощью пинцета помещали в пробирки с другой средой. Проведя данную операцию 3 раза, мы сделали 3 разных экспланта с разными средами: один рос в среде с преобладанием аммонитов(NH4), один рос в преобладанием азотистых оснований(NO3), один рос в изначальной среде, позже он стал контрольным образцом. Затем поместили все пробирки с растениями в термостат, установим 15 градусов тепла и 75% относительной влажности. Через 2 недели появились первые результаты.
2.2. Анализ результатов и подведение итогов
1.Для наглядного представления мы расставили образцы по штативам( штатив с NH4 средой – приложение Г, штатив с NO3 средой – приложение 6, штатив с контрольными образцами – приложение7,8). Разобрав их на выжившие и хорошие, умершие образцы, мы измерили количество лепестков и длинну стебля. Выбрав 5 самых хороших мы их исследовали и составили таблицу 3.
Таблица 3 – Пробирочные растения без корней, и их анализ.
|
Питательная среда |
№ растения |
Количество лепестков, шт |
Длина стебля, см |
Кол-во выпадов (умерших образцов) |
|
Контроль |
1к |
7-8 |
6 |
3 |
|
2к |
7 |
4 |
||
|
3к |
8 |
4 |
||
|
4к |
9 |
5 |
||
|
5к |
5 |
5 |
Таблица 3. Окончание таблицы
|
Среднее по контрольным образцам |
Всего 16 растений |
7,4 |
4,8 |
% выпада – 19% |
|
Нитраты NO3 |
1N |
7 |
5,4 |
5 |
|
2N |
8 |
4,5 |
||
|
3N |
7 |
5,2 |
||
|
4N |
6 |
5,1 |
||
|
5N |
7 |
5,4 |
||
|
Среднее по нитратным образцам |
Всего 16 растений |
7 |
5,1 |
% выпада – 31% |
|
Аммонитны NH4 |
1А |
4 |
4,5 |
4 |
|
2А |
6 |
5 |
||
|
3А |
5 |
5 |
||
|
4А |
6 |
6 |
||
|
5А |
6 |
5,5 |
||
|
Среднее по аммонитным образцам |
Всего 16 растений |
5,4 |
5,2 |
% выпада – 25% |
Внимательно прогнозировав данным, можно сделать вывод, что для наилучшего размножение картофеля нужно использовать среду контрольную(основную среду для микроклонального размножения)без дополнительных примесей.
Заключение
В ходе моей работы я изучил теоретические аспекты:
Микроклональное размножение растений
Микроклональное размножение картофеля
Стадии микроклонального размножения
Влияние макро и микро элементов на ткани растения
Организацию биохимической лаборатории для микроклонального размножения картофеля.
Далее, пройдя все необходимые теоритические занятия, я на базе регионального подразделения «Сириус» «Курчатов Центр» стал производить микроклональное размножение картофеля. Потернировавшись, мы приступили к эксперименту: мы хотели изучить влияние кол-ва элементов на выживаемость и развитие опытных образцов.
Через 2 недели после размножения мы проанализировали данные и выяснили, что нормализированная средаподходит для микроразмножения картофеля наилучшим образом. Т.е моя гипотеза не потвердилась.
Библиографический список
Деминчик, В. Микроклональное размножение растений / В. Деминчик, М. Черныш, Т. Дитченко, Е. Спиридонович, Д. Прижевальская, В. Падутов // Наука и инновации. – 2019. – № 6 (196) – С. 4 – 11.
Клональное микроразмножение растений: учебно-методическое пособие / О.А. Тимофеева, Ю.Ю. Невмержицкая. – Казань: Казанский университет, 2012. – 56 с.
Данные Росстат – https://rosstat.gov.ru/
Приложение
Приложение 1
Таблица 1. Физиологическая роль маркоэлентов в растениях
|
Элемент |
Форма поглощения эксплантом |
Физиологическая роль |
|
N |
NH4+,NO2- |
Входит в состав белоков и нуклеиновых кислот, хлорофилла, веществ вторичного обмена |
|
P |
H2PO4-, HPO42- |
Входит в соствав нуклеиновых кислот, АТФ, фосфолипидов и обеспечивает энергообмен |
|
S |
SO42- |
Входит в состав аминокислот, белков, К-фермента А, сульфалипеидов |
|
K |
K+ |
Регулирует состояние цитоплазмы, осмоса, не входит в состав органических соединений, активизирует ферменты синтеза крахмала |
|
Ca |
Ca2+ |
Поддерживает структуры клеточных мембран и хромосом, в составе клеточных оболочек, увеличивает вязкость цитоплазмы |
|
Mg |
Mg2+ |
Входит в состав хлорофилла и рибосом, активизирует ферменты цикла Кальвина |
|
Fe |
Fe2+ |
Входит в состав цитоплазмы, капализы, играет роль в персоксидазме ферменты синтеза хлорофилла, восстанавливает нитраты. |
Приложение 2
Таблица 2. Физиологическая роль микроэлемтов
|
Элемент |
Символика |
Содержание,% |
Значения для клетки растения |
|
Хлор |
Cl |
0,05-0,1 |
Важнейший отрицательный ион в клетке |
|
Кальций |
Ca |
0,04-2,00 |
Входит в состав клеточной стенки ратсний |
|
Магний |
Mg |
Входит в составл молекулы хролофилла, а также активизирует энергенитический обмен. |
|
|
Натрий |
Na |
Содержание в клетках только в виде ионов, один из компонентов калие-натриего насоса |
|
|
Железо |
Fe |
Входит в состав многих ферментов, участвует в биосинтезе хлорофилла, в процессах дыхания и фотосинтеза |
|
|
Йод |
I |
Входит в состав некоторых ферментов |
|
|
Медь |
Cu |
Входит в состав некотрых ферментов |
Приложение 3
Схема 2. Использование микроклонального размножения.
Приложение 4
Фото 1 прохождение теоретического материала
Приложение 5
Фото 2 Нахождение в лаборатории
Приложение 6
Фото 3 Выборка из среды с повышенным содержанием NH4
Фото 4 общие образцы NH4 экспланты
Приложение 7
Фото 5 общие образцы контрольной среды
Фото 6 Выборка из контрольной среды
Приложение 8
Ф ото 7 Общие образцы среды с повышенным содержанием NO3
Фото 8 Выборка из среды с повышенным содержанием NO3
Приложение 9
Схема 1. – Типы микроклонального размножения.
В микроклональном размножении существует множество типов. Вот некоторые из них