XVIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Изменение морфометрических и плоидометрических показателей ядра гепатоцитов крыс линии Wistar после многократной легкой воздушной гипотермии
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Зависимость большинства процессов жизнедеятельности организма от температуры окружающей среды делает температурные воздействия важнейшим фактором экологии, который может иметь решающее значение для выживания человека. С воздействием низких и сверхнизких температур человеку часто приходится встречаться при работе на различных производствах, а также в силу проживания – в некоторых климатических зонах. При этом пребывание организма в условиях гипотермического воздействия может приводить к значительным метаболическим и функциональным изменениям.
В условиях гипотермии печень как орган, вносящий значительный вклад в термопродукцию, играет очень важную роль [1–3]. За счет сложных биохимических реакций этот орган способен обеспечивать приспособляемость организма к сложным условиям существования. Печень обеспечивает пластические и энергетические процессы, а также регулирует адаптивные компенсаторно-приспособительные процессы, происходящие при воздействии всех экзогенных и эндогенных неблагоприятных процессов, и эта регуляция осуществляется даже тогда, когда повреждающие факторы не обладают выраженным гепатотропным эффектом [4]. Поэтому морфофункциональное состояние печени является отражением не только функционального состояния самого органа, но и реакции организма в целом.
Морфологические изменения органов человека и животных при воздействии неблагоприятных экзогенных факторов широко изучаются в последние годы [5–7]. Однако гистоструктура печени при воздействии гипотермии исследована лишь в ряде работ [8], полученные данные противоречивы. Это касается, в частности, особенностей реакций гепатоцитов на холодовой фактор, характеристики числа двуядерных гепатоцитов и реакции ядер клеток печени в целом [10, 11]. Более того в доступной литературе отечественных и зарубежных ученых мы не обнаружили описания морфологических изменений гепатоцитов при многократной гипотермии мягкой степени.
Таким образом, сведения о влиянии мягкой многократной гипотермии на гистоструктуру печениотсутствуют, а вопросы морфологии клеточного ядра гепатоцитов освещены недостаточно, поэтому необходимо проведение более детального изучения динамики морфологических изменений, происходящих в ядрах гепатоцитов при действии мягкого холода.
Цель исследования: выявить и проанализировать патоморфологические изменения гепатоцитов крыс при многократной мягкой воздушной гипотермии.
Задачи исследования:
-изучить и проанализировать открытые источники литературы о различных вариантах гипотермии в зависимости от темпа охлаждения и среды
-изучить методику и параметры проведения эксперимента, методику моделирования мягкой воздушной гипотермии;
-изучить и самостоятельно применить на практике методики, изготовления и окрашивания гистологических препаратов;
-произвести измерения морфометрических и плоидометрических параметров гепатоцитов после проведения, многократной воздушной мягкой гипотермии.
-провести статистическую обработку полученных результатов.
-формулировать выводы.
Основная часть
Объекты исследования, методика моделирования многократной воздушной мягкой гипотермии
Исследование было проведено на крысах линии Вистар, массой 220–250 граммов (N=10). Животных подвергали мягкой воздушной гипотермии.
Гипотермию моделировали следующим образом: животных, которые находились в индивидуальных клетках, при температуре окружающей среды -7°С. Воздействие холодового фактора прекращали, когда животные достигали мягкой степени гипотермии, критерием которой служило достижение ректальной температуры от +35°С до +32°С. Время воздействия холодового фактора в среднем составляло 40±5 мин.
Непосредственно сразу после прекращения охлаждения и через 2 дня животных выводили из эксперимента декапитацией используя эфирный наркоз.
Контрольную группу составляли крысы, которых в индивидуальных клетках содержали при температуре окружающей среды 22–25°С. Время экспозиции в контрольной группе соответствовало времени экспозиции в опытной группе.
Использование крыс в эксперименте осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, и Директивами 86/609/EEC.
Для гистологического исследования кусочки ткани печени в течение 24–48 часов фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после чего обрабатывали в автомате TISSUETEK VIPTM6 (Sakkura, Nagano, Japan) с последующей заливкой в парафин в станции парафиновой заливки TISSUE-TEK TEC 5 (Sakkura, Nagano, Japan).
Срезы толщиной 5–7 мкм изготавливали на роторном микротоме Accu-Cut SRM (Sakkura, Japan). Препараты окрашивали гематоксилин-эозином в автостейнере TISSUETEK Prisma (Sakkura, Nagano, Japan). Следующим этапом препараты окрашивали по методу Фельгена используя горячий гидролиз в течении 10 минут при температуре 60 °С.
Микрофотографию проводили при помощи микроскопа Leica DM 750 E200 (Германия) с цифровой видеокамерой Leica EC3 (Германия) при увеличении х400. Данные площади, периметра ядер гепатоцитов получали при помощи морфометрической программы ВидеоТест Морфология 5.2. По мимо стандартных морфометрических показателей, рассматривали также параметры формы ядер гепатоцитов. В норме фактор круга должен быть максимально приближен к идеальному кругу и ровняться 1 относительной единице (отн.ед.). При изменении формы значения фактора круга становится меньше Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи программ Microsoft Office 2007 и STATISTICA 6.1.
Результаты исследований и обсуждение
Морфологический анализ структуры гепатоцитов крыс контрольной группы позволяет выявить следующие особенности: большинство гепатоцитов одноядерные, ядра небольших размеров. (Рисунок 1.).
Рисунок 1. Печень крысы. Контрольная группа.
Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400.
Морфологический анализ структуры гепатоцитов крыс испытуемой группы позволяет выявить следующие особенности: ядра гепатоцитов увеличены в размерах, гиперхромные, в ядрах хорошо видны ядрышки, появляются двуядерные гепатоциты, цитоплазма бледная. (Рисунок 2.).
Рисунок 2. Печень крысы после многократной воздушной мягкой гипотермии
Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х100 и х 400 соответственно.
Анализ структуры печеночной ткани окрашенной по методу Фельгена после двух дней воздействия многократной мягкой воздушной гипотермии позволяет сделать следующие выводы: ядра становятся более интенсивно окрашены по сравнению с нормой соответственно происходит увеличение количества ДНК в ядре гепатоцитов, при этом в контрольной группе генетический материал представлен эухроматином, а в экспериментальной группе преобладает гетерохроматин. (Рисунок 3,4).
Рисунок 3. Печень крысы контрольной Рисунок 4. Печень крысы после двух
группы окраска по методу Фельгена дней многократной мягкой воздушной
увеличение х 1000. гипотермии. Окраска по методу Фельгена
увеличение х 1000.
Изменение морфометрчисеких параметров гепатоцитов крыс при многократной мягкой гипотермии в течении двух дней.
|
ИНДНК(с) |
площадь |
периметр |
диаметр |
Фактор круга |
Фактор эллипса |
удлиненность |
|
|
Норма |
4,1±0,1 |
25,3±0,9 |
18,1±0,4 |
6,1±0,3 |
0,971±0,003 |
0,998±0,0001 |
1,19±0,03 |
|
Через 2 дня |
8,0±0,2 |
66,1±1,7 |
29,6±0,4 |
9,3±0,1 |
0,937±0,004 |
0,997±0,0003 |
1,13±0,02 |
Распределение клональной пролиферации гепатоцитов контрольной группы выглядело следующим образом. Гапатоцитов с плоидным набором 1С было5%, 2С – 57%, 4С – 26%, 5С – 8, 6С – 4.
Гистограмма распределения клональной пролиферации ядер гепатоцитов контрольной группы.
Через 2 дня после проведения ежедневной воздушной мягкой гипотермии среднее значение плоидности было равно 8,0±0,2. По клеточной гетерогенности было выявлено шесть основных клон гепатоцитов по количеству содержания ДНК в ядре.
Ядер с плоидным набором 6С было выявлено 3,5%, 7С – 11,1%, 8С – 47,6%, 9С – 31,6%, 10С – 3,4%, 11С – 2,8.
Гистограмма распределения клональной пролиферации через 2 дня после проведения многократной воздушной мягкой гиперемии.
Заключение
Значительное увеличение плоидометрических и морфометрических показателей после действия многократной воздушной мягкой гипотермии свидетельствует о формировании краткосрочных адаптационно-приспособительных реакций.
Изменение формы ядра гепатоцитов после двух дней гипотермии, показывает нам, что ядро подвержено динамическим изменениям в ответ на воздействия окружающей среды.
Необходимо дальнейшее изучение действия длительного холодового воздействия для раскрытия механизмов формирующихся адаптивных реакций.
Список использованной литературы
Асмолова Н.Д. Микроскопические изменения миокарда при смерти от действия низкой температуры / Н.Д. Асмолова // Судебно-медицинская экспертиза. – 1982. –№ 4. – С. 28.
Бобров И.П., Лепилов А.В., Гулдаева З.Н., Долгатов А.Ю., Алымова Е.Е., Крючкова Н.Г., Лушникова Е.Л., Молодых О.П. Тучноклеточная инфильтрация легких крыс после гипотермии // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – №1. – [Электронный ресурс]. URL : https : // www.science - education.ru /ru /article /view?id (датаобращения: 30.07. 2021)
Бобров И.П., Лепилов А.В., Гулдаева З.Н., Долгатов А.Ю., Алымова Е.Е., Соседова М.Н., Крючкова Н.Г., Орлова О.В., Лушникова Е.Л., Бакарев М.А., Молодых О.П. Морфофункциональная характеристика тучноклеточной популяции легких крыс при однократной и многократной глубокой иммерсионной гипотермии // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – №2. – [Электронный ресурс]. URL : https : // www.science - education.ru /ru /article /view?id (датаобращения: 01.08.2021)
Витер В.И. Общее переохлаждение организма. Посмертное промерзание трупа: практическое пособие / В.И. Витер, В.В. Пудовкин, В.В. Юрасов. – М., 2013. – 96 с.
Долгатов А.Ю., Бобров И.П., Лепилов А.В., Крючкова Н.Г., Алымова А.А., Лушникова Е.Л., Молодых О.П. Морфофункциональная характеристика тучноклеточной популяции печени белых крыс при глубокой иммерсионной гипотермии (экспериментальное исследование) // Бюллетень медицинской науки. 2018. №3. С. 24-28.
Черданцева Т.М., Бобров И.П., Авдалян А.М., Климачев В.В., Казарцев А.В., Крючкова Н.Г., Климачев И.В., Мяделец М.Н., Лепилов А.В., Лушникова Е.Л., Молодых О.П. Тучные клетки при раке почки: клинико-морфологические взаимосвязи и прогноз // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2017. Т. 163. № 6. С. 768-773.
Шигеев В.Б. Холодовая смерть / В.Б. Шигеев, С.В. Шигеев, Е.М. Колударова. – М., 2004. – 184 с.
Бобров И.П., Лепилов А.В., Крючкова Н.Г., Долгатов А.Ю., Гулдаева З.Н., Орлова О.В., Шепелева Н.В., Лушникова Е.Л., Бакарев М.А., Молодых О.П. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДЕР ГЕПАТОЦИТОВ ПЕЧЕНИ КРЫС ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ГИПОТЕРМИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – № 6. ;