Исследование эффективности синтезированного нанокомпозита на основе серебра и хитозана в борьбе с грибными заболеваниями растений

XIX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке

Личный портфель
  • Главная
  • Список секций
  • Биология
  • Исследование эффективности синтезированного нанокомпозита на основе серебра и хитозана в борьбе с грибными заболеваниями растений

Исследование эффективности синтезированного нанокомпозита на основе серебра и хитозана в борьбе с грибными заболеваниями растений

Макарова С.Ю. 1
1МОУ Лицей № 8 "Олимпия"
Стесякова М.В. 1
1МОУ Лицей № 8 "Олимпия"
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Диплом школьникаСвидетельство руководителя
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Введение:

Актуальность: защита растений от различных болезней в условиях современного мира требует экономически эффективных и экологически безопасных подходов. Традиционные препараты для защиты растений от фитопатогенных грибов зачастую обладают высокой токсичностью и отдаленными экологическими последствиями. Кроме того, вредители сельскохозяйственных культур вырабатывают устойчивость к традиционным препаратам. По данным за первую половину 2022 года, российский рынок средств защиты растений показал существенный рост спроса на зарубежную продукцию, поэтому важнейшей задачей сельского хозяйства является создание отечественных экономически выгодных и более эффективных средств, гарантирующих продовольственную безопасность. Современные наноматериалы могут помочь в решении этой проблемы.

Цель: разработать наноматериал и определить его эффективность в борьбе с фитопатогенным грибом Fusarium oxysporum.

Задачи:

- провести химический синтез нанокомпозита серебро-хитозан;

- выявить эффективную концентрацию и тип наночастиц, угнетающие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum;

- изучить влияние растворов наноматериала различных концентраций на показатели всхожести семян и морфологические особенности проростков пшеницы мягкой сорта «Иволга»;

- изучить влияние концентраций и способа обработки препаратом наноматериала на рост и биохимические показатели семян и взрослого растения пшеницы мягкой сорта «Иволга»;

- определить возможные фитотоксические эффекты нанокомпозита Ag-Chi;

- установить концентрации растворов наноматериала с наиболее выраженными фунгицидными и минимальными фитотоксичными свойствами.

Объект исследования: нанотехнологии в агропромышленности.

Предмет исследования: обеспечение условий для синтеза нанокомпозита Ag-Chi для борьбы с грибными заболеваниями растений.

Глава I. Литературный обзор

    1. Свойства хитозана- простейшей модификации хитина

Хитин- один из самых распространённых в природе полисахаридов, составная часть экзоскелета ракообразных, ежегодно в организмах животных и некоторых растениях образуется и разрушается примерно 10 гигатонн этого вещества. Хитозан представляет собой простейшую модификацию хитина, его сополимер, это аминополисахарид. Его получают промышленным путем деацетилирования хитина, то есть процессом удаления ацетильной группы CH3 из положения С2 в хитине в результате обработки его в жестких условиях раствором щелочи. [1]

В настоящее время природный полимер хитозан находит применение во многих областях медицины, промышленности и сельском хозяйстве, таких как доставка лекарств, инкапсуляция гербицида, противомикробное средство, средство, стимулирующее рост растений, и средство для защиты растений, применяется как диетическое волокно, эмульгатор и загуститель, используется для гранулирования удобрений, добавка к корму птиц для увеличения их привеса, проведение природоохранных мероприятий. Его популярность в настоящее время обусловлена его доступностью, а также уникальными физиологическими и экологическими свойствами, которые присущи именно этому аминополисахариду: растворимость в кислых средах, ранозаживляющие и противовоспалительные свойства, антимикробная, физиологическая активность при отсутствии токсичности, биологическая активность и биосовместимость с живыми клетками, отсутствие токсичности способность к селективному связыванию тяжелых металлов и органических соединений, не загрязняют окружающую среду, так как полностью разрушается ферментами микроорганизмов, способен индуцировать болезнеустойчивость живых растительных клеток за счет образования в них хитин-хитозанового барьера против хитинсодержащих патогенов, является элиситором для растений, а также защищает и стимулирует их рост.

Исследована и фунгицидная активность наночастиц хитозана против ряда фитопагагенов, таких как Colletotrichumgelosporidies, Phytophthoracapsici, Sclerotiniasclerotiorum, Gibberellafujikuori, S. epidermidis, S. aureus, S. pyogenes, P. aeruginosa, P. tardum, P. chrizogenum, A.Flavus, P. betae, C. herbarum. одного штамма Xanthomonas и трех штаммов Erwinia, также почти полностью ингибировали рост и других фитопатогенов.

1.2 Свойства наночастиц серебра

Наносеребро, или как по-другому еще называют коллоидное серебро, как и другие наночастицы, характеризуется уникальными свойствами.
Это связано с высоким отношением площади частиц поверхности к объему,
а следствием и увеличению поверхностной энергии, что определяет большую эффективность их действия. Частицы серебра при взаимодействии с микробной клеткой поглощаются ее оболочкой. После этого микроб остаются жизнеспособным, но лишается некоторых функций. Изучению биологической активности и бактерицидного действия наночастиц серебра посвящено много монографий и научных статей. Наночастицы серебра стали популярными из-за способности убивать высокопрочные патогены в низких концентрация. Их перспективными областями применения является медицина и здравоохранение, косметика и бытовые изделия.

Кроме того, они обладают фунгицидной активностью в отношении множества фитопатогенов, AgNP может связываться и проникать непосредственно в клеточную мембрану, чтобы убить споры гриба. Наночастицы серебра оказывают стимулирующее действие на ростовые процессы растений на ранних стадиях онтогенеза, энергию прорастания, всхожесть семян и интенсивность дыхания. Но при длительном употреблении способны накапливаться в организме животных.

Нанотехнологии в сельском хозяйстве могут обеспечить широкий спектр применений для устойчивого развития путем разработки наноудобрений, нанопестицидов и наногербицидов. Удобрения на основе наночастиц серебра были разработаны для того, чтобы контролировать высвобождение питательных веществ с поглощением растениями. Эта система помогает сохранить или поддерживать плодородие почвы за счет снижения потерь питательных веществ, загрязнения грунтовых вод и почвы, а также химических реакций между водой, почвой и микробами, которые превращают их в непригодные для использования или опасные химические вещества для растений.

Контроль патогенов, таких как бактерии и грибы, ответственные за причинение заболеваний у растений, может быть достигнут путем распыления растворов наночастиц непосредственно на семена, зерна или листву для предотвращения вторжения патогенов растений. Нанопестициды и наногербициды показали улучшенные свойства с точки зрения растворимости, стабильности, специфичности и проницаемости, поскольку наноструктура может защищать и усиливать активные вещества от ранней деградации, и они обеспечивают активные ингредиенты для борьбы с вредителями в течение более длительных периодов времени.

Грибы являются одним из восстановителей и стабилизирующих агентов, используемых в биосинтезе наночастиц серебра. Опосредованный грибами синтез наночастиц серебра привлек больше внимания из-за его способности производить AgNP серебра с контролируемым размером, морфологией и низкой токсичностью остатков. При синтезе наночастиц серебра с использованием микроорганизмов штаммы грибов предпочтительнее видов бактерий из-за свойств накопления металлов и лучшей переносимости грибов. Механизм синтеза наночастиц с помощью грибов может быть внутриклеточным или внеклеточным. [2]

    1. Свойства и преимущества использования нанокомпозита Ag-Chi

Преимуществом нанокомпозита Ag-хитозан является отсутствие токсичности для личинок, рыб, макрофагов человека и человека в целом, а также объединение свойств наночастиц серебра и хитозана.

Уже исследовано проявление фунгицидной активности нанокомпозита серебра и хитозана в отношении: Fusarium oxysporum (с концентрациями 1000 ppm, 1500 ppm и 2000 ppm Ag-Cs NP); Aspergillus flavus, Rhizoctonia solani, Alterneria alterneta (в концентрации 100 мкг/мл). Нанокомпозит обладает значительной фунгицидной активностью в отношении протестированных грибов, и она проявляется гораздо выше, чем фунгицидная активность наночастиц серебра или хитозана используемых независимо.

    1. Влияние наноматериалов на организм растений

Наноматериалы, в частности нанокомпозит Ag-Chi, улучшают прорастание семян, способствуют укоренению роста и формирования урожая некоторых видов, повышают уровни экспрессии генов устойчивости к абиотическим и биотическим факторам среды, влияют на морфологию и физиологию растения, его всхожесть, энергию прорастания.

Рассмотрим механизм воздействия наноматериалов на растения. Наноматериалы захватываются и транспортируются в растения с помощью поглощения листвой, после чего наноматериал проникает в кутикулу листа, проникает в палисад и губчатый мезофилл через слой эпидермиса и, наконец, проникает в сосудистые пучки или поглощением наноматериала корнями растений при нанесении путем орошения, в следствии чего он проникает в корневые волоски, затем в ксилему и флоэму через эпидермис и кору по апопластическим и симпластическим путям.

1.5 Проявление фунгицидной активности наночастиц

Механизмы действия наночастиц металлов на фитопатогенные грибы:

  1. ионы высвобождаются наночастицами и связываются с определенными группами белков, которые влияют на функцию основных мембранных белков и изменяют проницаемость клеток;

  2. наночастицы ингибируют прорастание конидий грибов и подавляют их развитие;

  3. наночастицы вызывают серьезные повреждения белков, мембран и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и мешают поглощению питательных веществ;

  4. они влияют на потенциал митохондриальной мембраны за счет повышения уровня транскрипции генов в ответ на окислительный стресс (АФК);

  5. АФК индуцируют образование активных форм кислорода, запуская реакции окисления, катализируемые различными металлическими наночастицами, вызывая серьезное повреждение белков, мембран и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и препятствуя усвоению питательных веществ;

  6. ионы наночастиц имеют генотоксический эффект, который разрушает ДНК, тем самым вызывая гибель клеток.

1.6 Фузариоз. Fusarium oxysporum

Гриб Фузариум вызывает заболевания растений, которые называются фузариозами. Фузариоз является опасным патогеном зерновых культур, который вызывает корневую гниль и фузариоз колоса. У пораженных всходов происходит побурение и загнивание корней, а также утончение прикорневой части стебля. Фузариоз также повреждает и семядоли, на них образуются вдавленные красно-бурые пятна, которые при повышенной влажности покрываются бело-розовым налетом гриба. Часто гибель всходов происходит еще до выхода их на поверхность. При заражении растений в более поздние фазы наблюдается отставание растений в росте и развитии. У злаков, кроме загнивания корней, часто происходит отмирание стеблей. Кроме того, пораженные корневой гнилью растения, как правило, легко выдергиваются из почвы. Заболевание встречается повсеместно, но наиболее интенсивно развивается на участках с тяжелыми почвами, а также в местах с избыточным увлажнением. [3]

Причинами фузариоза растений могут являться зараженные семена (гриб часто заносится в почву вместе с семенами при посадке), высокая влажность почты и растительные остатки в почве, которые надолго сохраняют в себе фузариум.

Фузариум может продуцировать токсичные вещества, называемые микотоксинами. Это особенно вредно для пищевых растений, поскольку микотоксины накапливаются в продукции. Снимать урожай с растений с признаками фузариоза не следует, так как потребление микотоксинов приводит к токсическому поражению печени и онкологическим заболеваниям. [4]

Глава II. Экспериментальная часть

Эксперимент проводился на базе лаборатории Имеретинского лицея «Сириус».

2.1 Синтез нанокомпозита Ag-Chi

К раствору хитозана (10 мг/мл) при перемешивании добавляли раствор нитрата серебра, через 15 мин реакционную смесь помещали в автоклав. Был проведен синтез нанокомпозита методом “зеленой химии” путем химического восстановления нитрата серебра хитозаном. Для проведения реакции на аналитических весах взвешено 0,2 г хитозана, параллельно наведен 1% раствор уксусной кислоты и использован в качестве растворителя для хитозана. Хитозан был смешан с раствором CH₃COOH и выдержан 3 часа на магнитной мешалке (500 обор/мин).

После взвешено 2г нитрата серебра AgNO3 и наведен 2% раствор AgNO3, пипеткой прилит раствор нитрата серебра к раствору хитозана, промыт 30% раствором щелочи для нейтрализации остаточных ионов серебра. Далее раствор центрифугировали 15 мин (10000 обор/мин), прицептат обработали дистиллированной водой, высушили при температуре 40 градусов 12 часов и растерли кристаллы в ступке. Произошло восстановление ионов серебра с образованием нанокомпозита Ag-хитозан, представляющих собой структуру металлическое ядро–полимерная оболочка. (приложение 1)

Для того чтобы доказать, что в составе порошка, предполагаемого нами нанокомпозита содержится и серебро, и хитозан, мы воспользовались методом спектрофотометрии. Как видно из графика есть два пика поглощения 275 и 410 нм, что соответствует серебру и хитозану соответственно. (Приложение 2)

После спректрофотомтертрии было исследована поверхность нашего нанокомпозита с помощью сканирующего зондового микроскопа СММ-2000 отечественного производства в режиме атомно-силовой микроскопии с использованием зондов-кантилеверов марки CSG-01 c радиусом закругления острия 6 нм. Средняя шероховатость 3,164 нм. Средний размер зерна 32,54 нм. Дифференциальные кривые распределения частиц по диаметрам были получены с применением грануметрического анализа. (Приложение 3)

2.2 Определение фунгицидной активности нанокомпозита в отношении Fusariumoxysporum

Следующим этапом было определение фунгицидной активности нанокомпозита, используя инфекционно-мицелиальные блоки чистой культуры Fusariumoxysporum TCXA-4. Для этого изначально была приготовлена и проавтоклавирована питательная среда КГА для гриба на основе агара и картофеля, после были приготовлены растворы нанокомпозита разных концентраций от 100 ppm до 1500 ppm. Затем в питательную среду добавлены растворы нанокомпозита, КГА был разлит по чашкам Петри в ПЦР-боксе и посажен фитопатогенный гриб Fusarium oxysporum. (Приложение 4)

На следующем этапе выполнения работы был измерен диаметр колонии грибов на третьи сутки после культивирования и обработки. Проведена статистическая обработка полученных нами данных, по ним можно сказать, показатель опушённости по сравнению с контролем был низким, а на диаметр колонии наиболее сильно повлияли концентрации в 100 и 250 ppm.

(Приложение 5)

2.3 Определение влияния нанокомпозита на всхожесть семян

Для обработки семян был приготовлен широкий диапазон концентраций растворов нанокомпозита Ag-Chi со спиртом от 100 ppm до 1500 ppm.

Мы замочили семена пшеницы мягкой сорта «Иволга» в растворах нанокомпозита разных концентраций на 12 часов, после чего разложили их по чашкам Петри на фильтровальную бумагу. (Приложение 6)

Мы изучали влияние нанокомпозита на прорастание семян, проростки состоят из следующих элементов: главного корня, пары придаточных корней и колеоптиля. На первые сутки после обработки были проклюнувшиеся семена. На вторые сутки мы измерили высоту колеоптиля и длину корней. По сравнению с контрольной у экспериментальной группы не замечалось ни увеличение высоты колеоптиля, ни его уменьшение, но было отмечено, что по сравнению с максимальной концентрацией в 1500 ppm, у семян, обработанных концентрациями от 500 до 1250 ppm, отмечается увеличение высоты колеоптиля. Что касается влияния нанокомпозита на длину корней, то концентрации от 250 до 1250 ppm увеличивают длину главного корня, а концентрации от 100 до 1250 ppm увеличивают длину придаточных корней, что является положительным для дальнейшего развития проростка. На третий день в соответствии с ГОСТом была измерена энергия прорастания семян и было отмечено, что не одна из концентраций не снижает этот параметр. (Приложение 7)

2.4 Определение фитотоксичности нанокомпозита

Нами была подготовлена выборка растений, которые мы будем обрабатывать различными концентрациями нанокомпозита, как видно на диаграмме, растения не отличаются между собой по высоте, то есть наши выборки схожи по этому параметру. (Приложение 8)

На третьи сутки после обработки взрослых растений под корень и по листу мы измерили их высоту и количество настоящих листьев для определения влияния нанокомпозита на рост и развитие растения. По данным диаграмм мы выяснили, что статистических изменений по сравнению с контролем нет. (Приложение 9)

Через неделю после обработки нанокомпозитом мы измерили длину настоящих листьев растений. Из первой диаграммы следует, что длина первого листа по сравнению с контрольной у экспериментальной группы не изменилась, так как этот лист образовался у растений до обработки нанокомпозитом. Длина второго листа отличалась у контрольной и экспериментальной групп, при обработке растений под корень концентрациями 100, 500, 750, 1000, 1250 ppm, обработка по листу различными концентрациями нанокомпозита не повлияла на длину второго листа. Длина самого молодого сформировавшегося на растениях третьего листа сильно отличалась между опытными вариантами и контролем. Не снижали по сравнению с контролем длину листа обработки под корень концентрациями 500, 750, 1500 ppm, по листу – 100 и 1500 ppm. (Приложение 10)

2.5 Определение антиоксидантного статуса растений

Чтобы выявить влияние нанокомпозита на растение, мы решили определить содержание неферментативных антиоксидантов. Нами были построены калибровочные графики для дальнейшего определения содержания флавоноидов, пролина и аскорбиновой кислоты.

  1. Определение содержания пролина (Приложение 11)

При определении содержания пролина в растениях после обработки нанокомпозитом мы выяснили, что наш нанокомпозит снижает в большинстве случаев содержание данного антиоксиданта в растении. То есть, адаптация к условиям оксидативного стресса вероятно происходила за счет накопления других антиоксидантов.

  1. Определение содержания общей суммы флавоноидов (Приложение 12)

Флавоноиды – группа следующих неферментативных антиоксидантов, содержание которых мы измеряли. При обработке растений по листу содержание флавоноидов снижалось в большинстве вариантов снижалось, а при обработке под корень в большинстве случаев увеличивалось, что свидетельствует об адаптации растений за счет увеличения синтеза данных антиоксидантов.

  1. Определение содержания аскорбиновой кислоты (Приложение 13)

Аскорбиновая кислота является одним из самых мощных и распространенных антиоксидантов, это одно из основных соединений, нейтрализующее активные формы кислорода. Повышенное ее содержание отмечалось у растений обработанных нанокомпозитом в концентрации 250 ppm по листу. Синтез ее не отличался по сравнению с контролем у таких вариантов обработки как 750 и 1500 ppm как под корень, так и по листу, а также еще у ряда концентраций, как можно увидеть на диаграмме.

Описание результатов

В результате проекта удалось синтезировать нанокомпозит на основе наночастиц серебра и хитозана, а также определить его влияние на прорастание семян и морфологию будущих ростков пшеницы мягкой сорта «Иволга». Установлена фунгицидная активность, то есть влияние нанокомпозита Ag-Chi на рост гриба Fusarium oxysporum. Была определена его фитотоксичность нанокомпозита и содержание неферментативных антиоксидантов в обработанных растениях. Также был проведён литературный обзор отечественных и зарубежных источников

Заключение

На основе проведённых экспериментов мы пришли к выводу, что обработка семян раствором нанокомпозита Ag-Chi с концентрацией от 250 ppm до 1250 ppm положительно сказывается на первых этапах онтогенеза растений пшеницы – увеличивается длина корневой системы проростков. Обработка взрослых растений пшеницы под корень нанокомпозитом также положительно сказывается на росте и биохимических показателях, в особенности концентрации 500 ppm и 750 ppm. Все изученные концентрации оказали ингибирующую активность на рост фитопатогена, значительно снижалась опушенность колонии и в ряде концентраций и ее диаметр. Помимо этого, мы рассчитали экономические показатели, стоимость реализации проекта - 3 899 012 руб., цена продукта составит 950 руб./уп.

В будущем планируется расширить определение антиоксидантного статуса растений, а именно содержания каталазы, супероксиддисмутазы, аскорбатперокидазы, пероксидазы, общей суммы фенольных соединений. А также проверить влияние нашего нанокомпозита Ag-Chi на заражённое фузариозом растение.

Список источников и литературы:

  1. Наночастицы хитозана как носители биологически активных веществ [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.dissercat.com/content/nanochastitsy-khitozana-kak-nositeli-biologicheski-aktivnykh-veshchestv?ysclid=l53sl39zyf405835760 (Дата обращения 14.08.2022)

  2. Обзор синтеза наночастиц серебра с помощью растений и микроорганизмов, роли растительных метаболитов и их применения [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8775445/(Дата обращения 05.07.2022)

  3. Фузариоз зерновых культур [Электронный ресурс]. – Режим доступа:https://zapoved-mordovia.ru/biblio/mycology/gagkaeva2011_fuzarioz_zernovyh_kultur.pdf (Дата обращения 10.07.2022)

  4. Биоразнообразие и ареалы основных токсинопродуцирующих грибов рода Fusarium [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://cyberleninka.ru/article/n/bioraznoobrazie-i-arealy-osnovnyh-toksinoprodutsiruyuschih-gribov-roda-fusarium/viewer (Дата обращения 08.08.2022)

Просмотров работы: 27