XIX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Экспериментальное моделирование остеоартроза

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Кривошеева М.Д. 1

---

1Средняя общеобразовательная школа № 40 с углубленным изучением математики им. В. М. Барбазюка

Корочина К.В. 1

---

1ФГБОУ ВО Оренбургский государственный медицинский университет Минздрава России

Работа в формате PDF

731.8 KB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

«Здоровье не ценят, пока не приходит болезнь»

Уильям Шекспир

В любую эпоху многие люди страдают из-за болезней. Болезнь - это нарушение жизнедеятельности организма. В наше время статистика заболеваемости граждан регулярно возрастает, так как организм человека подвергается действию физических, химических, биологических, социальных факторов, что приводит в ряде случаев к развитию патологического процесса. Такое заболевание, как остеоартроз (ОА) не исключение, оно начинает приобретать массовый характер. Это самое распространенное заболевание в России и во всем мире, которое характеризуется хронической болью, нарушением функции суставов, утратой трудоспособности и имеет большое медико-социальное значение. К сожалению, изменение структуры суставов при ОА развивается раньше, чем клинические признаки, поэтому у человека изучение заболевания на ранних стадиях проблематично.

Одним из методов познания сложных механизмов развития патологических процессов в организме является моделирование, а наиболее эффективным и распространенным его методом является биологическое моделирование заболеваний. Исследования, проводимые на животных, позволяют ответить на ряд вопросов, касающихся пусковых механизмов, общих звеньев патогенеза, и принципов терапии и профилактики ряда болезней.

Моделирование ОА коленных суставов на крысах позволяет выявить факторы, влияющие на его развитие, а также определить процессы, происходящие на начальной стадии развития остеоартроза. Для данного заболевания указанный метод моделирования наиболее эффективен по той причине, что невозможно без хирургических вмешательств определить структуру начальной стадии развития заболевания.

Исходя из всего вышесказанного целью нашей работы является: анализ существующих методов моделирования ОА коленных суставов и разработка новой экспериментальной модели на самках крыс линии Wistar.

Для достижения поставленной цели передо мной стоят следующие задачи:

1. Изучить историю развития моделирования заболеваний и проанализировать существующие методы моделирования.

2. Изучить ревматологическое заболевание остеоартроз и проблему его экспериментальной модели.

3. Провести экспериментальное моделирование на самках крыс линии Wistar.

Объект исследования: экспериментальная модель остеоартроза

Предмет исследования: база данных научной литературы, коленные суставы крыс линии Wistar, у которых воспроизводим остеоартроз.

Методы исследования: теоретические - поиск и изучение литературы, анализ и синтез; эмпирические –наблюдение, сравнение, эксперимент, измерение, абстрагирование.

В ходе данного исследования мы будем проводить эксперимент на 6 крысах, который включает в себя два этапа формирования остеоартроза: ежедневное плавание крыс с последующим откармливанием.

Практическая значимость: предложенная нами модель имеет большое практическое значение, так как она является нетравматичной и позволяет изучать заболевания на ранних стадиях его развития.

I. Применение моделирования в биологии и медицине

1.1 Методы моделирования заболеваний и их история развития.

В наше время существует несколько видов моделирования: компьютерное, биологическое и математическое. В век информационных технологий происходит бурное развитие компьютерного и математического моделирования, которые используются для анализа расчетных данных, нуклеотидных последовательностей, кодирующих ген и т.д. «Виртуальные» эксперименты позволяют выдвигать гипотезу, которая требует подтверждения. В этом случае используется наиболее эффективный вид моделирования в медицине - биологическое моделирование. Биологические модели на лабораторных животных воспроизводят определенные состояния или заболевания, которые встречаются у животных или человека. Их использование позволяет изучать при проведении экспериментов механизмы возникновения данного состояния или заболевания, его протекание и исход, воздействовать на его протекание. Экспериментальная модель заболевания - воспроизведение у лабораторных животных искусственного заболевания, имеющего те или иные черты соответствующей болезни человека.

Моделирование заболеваний на животных

Распространенной формой моделирования является воспроизведение отдельных симптомов или синдромов болезни человека у животных. Эта форма дает возможность изучить лишь некоторые аспекты механизма болезни.

Большой интерес представляет так называемая экспериментальная нозология — наименее разработанная область моделирования, целью которой является выяснение в эксперименте на лабораторных животных основных закономерностей патогенеза заболеваний человека. Особой формой моделирования является воспроизведение на животных различных патологических процессов и состояний с целью испытания новых лекарственных препаратов и изучения при этом механизмов выздоровления.

1.2 Экспериментальное моделирование остеоартроза коленных суставов

Что представляет собой остеоартроз коленных суставов

Остеоартроз – это самое распространённое заболевание суставов во всем мире и в России, сопровождающееся хронической болью, снижением функции, утратой трудоспособности, инвалидизацией, низким качеством жизни и демонстрирующее большое медицинское значение. Недавние исследования свидетельствуют о быстром вовлечении лиц трудоспособного возраста с огромными затратами для государства, отражая социальную значимость заболевания. В 2012–2013 годах в России было зарегистрировано более 4 миллионов человек с ОА, заболеваемость имела тенденцию к нарастанию. По разным данным, ближе к 2020 году распространенность ОА составляла от 5 до 18%, причем реальная картина превышала данные статистики в 5 раз.

ОА коленного сустава называется гонартроз и является самой частой локализацией данного заболевания. На него приходится одна треть всех дегенеративных заболеваний, им страдают около 10 % населения старше 55 лет, при этом у 25 % больных развиваются выраженные функциональные нарушения, что в целом определяет актуальность изучения гонартроза.

В настоящее время сустав рассматривается не просто как механическая сумма анатомических структур, но как единый орган с присущими ему метаболическими процессами и реакциями. При ОА патологические изменения происходят в первую очередь на молекулярном уровне, заключаясь в разрушении внеклеточного матрикса хряща, который выполняет ключевую функцию хрящевой ткани. Это активирует неадекватные адаптивные восстановительные реакции клеток хряща хондроцитов, но однажды активированный каскад патологических реакций в итоге становится причиной дальнейших анатомических и физиологических нарушений суставов при развитии ОА. Так как ранние стадии ОА изучать у человека без инвазивных вмешательств проблематично, экспериментальное моделирование играет важную роль в его исследовании.

Методы моделирования остеоартроза на животных

Для экспериментального воспроизведения OA используют различные методы, которые условно можно разделить на несколько групп: использование животных с генетическими признаками, хирургические (оперативные) манипуляции, внутрисуставное введение химических соединений и травмирующих агентов, математическое моделирование, методы опосредованного влияния на сустав (изменением гормонального статуса, нарушением биомеханики, приемом токсических веществ и др.).

В группе методов, предполагающих использование животных с модификацией генетического аппарата, известна модель спонтанного OA, развивающегося у мышей линии STR/OPT. У всех животных в возрасте 32-35 недель развивается преждевременная дегенерация суставного хряща и других тканей коленного сустава, наиболее выраженная в медиальной области большеберцовой кости.

Важными недостатками данной модели являются: длительный период формирования OA (в среднем 6 месяцев), индивидуальная вариабельность поражения тканей сустава, для модели не характерен синовит.

Среди группы хирургических способов получения OA известно нарушение регионального кровообращения сустава пересечением бедренной артерии. В условиях операционной у собак одновременно на двух задних конечностях на уровне средней трети бедренной кости выделяют бедренную артерию и пересекают, затем послойно ушивают операционную рану и иммобилизируют конечности аппаратом Илизарова в течение 28 суток. Выведение животных из эксперимента осуществляют через 28 суток после рентгенологического подтверждения развития OA коленных суставов.

Недостатки модели: развитие грубых деструктивных изменений в суставах, не предполагающих изучение ранних стадий заболевания, сложная техника исполнения (требуются хирургическая бригада, стерильная операционная, оборудование, анестетик, аппарат Илизарова, владение хирургическими навыками), травматизация тканей, риск гибели животных, развития послеоперационных осложнений.

Среди способов моделирования OA внутрисуставным введением химических веществ существует метод, предполагающий использование трипсина. Беспородным белым мышам обоих полов вводился 0.1 мл 0.1% раствора трипсина в коленный сустав под внутрибрюшинным наркозом кетамином и ксалазином, на 14 и 28 дни животных выводили из эксперимента.

Недостатками модели являются: травматизация суставообразующих структур, острое локальное разрушение хрящевой ткани под действием препарата (несоответствие полученной патологии заболеванию человека), ограниченная возможность апробации препаратов для лечения OA, технические сложности при осуществлении метода (условия для манипуляций, препараты для наркоза), риск осложнений после инвазии, развитие моноартроза (у человека OA обычно поражает несколько суставов).

Среди методов неинвазивного влияния на сустав известен способ получения системного стероидного OA у крыс. Для его воспроизведения авторы осуществляли троекратное внутримышечное введение дексаметазона фосфата в дозе 7 мг/кг с интервалом в одну неделю крысам-самцам линии Wistar массой 250-300 г. Ключевым недостатком модели является несоответствие этиопатогенеза кортикостероидной артропатии в эксперименте таковому при OA у человека: хроническая передозировка дексаметазона обеспечивает развитие у крыс вторичного, медикаментозно индуцированного OA. Воспроизведенная патология сопровождается системными побочными эффектами, это препятствует корректному исследованию состояния суставов, в т.ч. при апробации лекарственных средств. Таким образом, имеющиеся модели предполагают специфические триггеры развития OA, отличающиеся от реальных причин его развития у человека, и оптимальной биологической модели раннего OA до сих пор не предложено.

Прототип

В качестве прототипа был использован способ моделирования ОА, заключающийся в воздействии на самцов крыс линии Wistar 8-ми месяцев двух последовательных факторов: ежедневных подкожных инъекций 1% 0.1 мл раствора мезатона с последующим плаванием до утомления в течение двух недель, а также воспроизведения ожирения путем высококалорийного рациона питания. Способ доказал свою эффективность в моделировании нетравматического ОА у самцов крыс, однако в литературе нет данных, насколько эффективен данный способ для воспроизведения заболевания у самок. Следует отметить, что для ОА у человека характерны гендерные различия, например, коленный сустав чаще поражается у женщин, а тазобедренный – у мужчин. Таким образом, возможность моделирования ОА у самок крыс представляет научный интерес и имеет практическую значимость для изучения заболевания.

II. Моделирование остеоартроза коленных суставов на крысах линии Wistar методом неинвазивного влияния на сустав

2.1 Методы и материалы исследования

Исследование проводилось на 6 самках крыс линии Wistar 8 месячного возраста. Животные были разделены на 2 группы по 3 в каждой. Первая группа была контрольной, данные животные находились на обычном рационе, в обычных условиях вивария в течение всего периода эксперимента, затем их вывели из эксперимента передозировкой эфирного наркоза.

Вторая группа крыс была опытной, в ней воспроизводили остеоартроз следующим способом: на первом этапе им проводили ежедневные подкожные инъекции 0,1 мл 1%-ого раствора фенилэфрина (мезатона) с последующим интенсивным плаванием в воде после каждой инъекции в течение 20 минут. Данный препарат активирует гипертензивные механизмы и в сочетании интенсивной физической нагрузкой используется для получения хронической сердечной недостаточности (ХСН) по методу В.И. Инчиной с соавт., 2000. Длительность формирования сердечно-сосудистой патологии составила 2 недели.

На следующем этапе после формирования ХСН крысы были помещены в тесные клетки и в течение 2-х месяцев находились на высококалорийной многокомпонентной диете (пшено, сдоба, жареный на растительном масле картофель, свиное сало, шоколад, фундук, печенье, халва). Животных взвешивали в 1-й, 30-й, 60-й дни пребывания на диете, определяли прирост массы тела.

После эвтаназии эфирным наркозом у всех крыс оба коленных сустава были осмотрены на предмет видимой деформации, отёка, гиперемии, отсепарированы с помощью хирургических инструментов от кожи и прилегающих мышц. Материал оставляли в 10% нейтральном формалине. Внутренние органы (сердце, печень, почки) были взяты для подтверждения сосудистых и метаболических нарушений.

Гистохимический метод. После стандартной гистологической проводки материал нарезали на микротоме с толщиной срезов 5 мкм, окрашивали гематоксилином Майера и эозином, 0,5% толуидиновым синим. Для оценки повреждения хряща использовали Шкалу Mankin H.J. в модификации Kraus V.B. (2010) (Приложение 1), а также Шкалу оценки гистопатологии хряща OARSI (2006). (Приложение 2)

Морфометрический метод. С помощью окуляр-микрометра определяли толщину хряща на увеличении 300, а также относительную объемную плотность хондроцитов при увеличении 600.

Иммуногистохимический метод. С помощью набора реактивов моноклональных антител для иммуногистохимии определяли коллаген II типа, выявляли экспрессию каспазы-3. Степень экспрессии антител к коллагену II типа оценивалась по бальной системе. Количество клеток, позитивных по каспазе-3, определяли в пересчете на 100 хондроцитов и выражали в процентах.

Статистическую обработку полученных данных производили с применением программы «Statistica 10.0». Был произведен подсчет среднеарифметических значений и стандартных отклонения (M±δ). Для проверки достоверности различий между двумя исследуемыми группами использовали t-критерий Стьюдента. Для всех показателей была отвергнута нулевая гипотеза на уровне значимости р < 0,05.

2.2 Результаты исследования:

Морфологическая характеристика внутренних органов животных контрольной группы:

У животных в препаратах миокарда определялись сократительные кардиомиоциты с овальными ядрами, четкими контурами, равномерной окраской, поперечной исчерченностью, между ними находились прослойки межмышечной рыхлой соединительной ткани. В печени клетки-гепатоциты формировали балки, между которыми располагались синусоидные капилляры, направленные к центральным венам, в печеночных балках располагались желчные капилляры. В почках четко определялось мозговое и корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами. Все указанные признаки соответствовали нормальному морфологическому строению внутренних органов животных данной группы.

Морфологическая характеристика внутренних органов животных опытной группы (с ОА):

При микроскопическом исследовании внутренних органов животных с ожирением и сердечной недостаточностью были обнаружены следующие признаки. В микропрепаратах миокарда преобладала соединительная ткань, в ее прослойках - скопления адипоцитов, выявлены участки пересокращения и сближения вставочных дисков в кардиомиоцитах. В печени наблюдался крупнокапельный стеатоз (жировые капли в клетках), часть гепатоцитов подвергалась некрозу.

В почках отмечены признаки дистрофии, скопление адипоцитов в интерстициальной ткани, гиалиновых капель в канальцах. Сосуды были расширены и заполнены эритроцитами, что свидетельствует о явлении венозного застоя в органе. Таким образом, выявленные изменения подтверждают развитие ожирения и сердечно-сосудистой недостаточности у животных данной группы (Рисунок 1).

Рисунок 1. Сердце (слева) и печень (справа) крысы опытной группы с ОА. Обилие жировой ткани вокруг сердца. Пёстрая, «мускатная» печень. Изменения обусловлены нарушением кровообращения (сердечная недостаточность) и ожирением.

Морфологическая характеристика суставного хряща коленного сустава животных контрольной группы

Суставной хрящ крыс контроля соответствовал общим закономерностям строения гиалиновой хрящевой ткани. Уплощенные клетки-хондроциты поверхностной зоны располагались в 1-2 ряда, в промежуточной зоне клетки имели округлую форму и образовывали изогенные группы, большинство ядер имело чёткие контуры. В глубокой зоне определялись гипертрофированные хондроциты. Разволокнение матрикса отсутствовало, базофильная линия была чёткой и непрерывной. Край хряща был неровным, но значимых повреждений не наблюдалось.

При окрашивании микропрепаратов 0,5% толуидиновым синим интенсивность метахромазии фиолетовым цветом была равномерной по всей толще хряща.

Морфологическая характеристика суставного хряща коленного сустава животных опытной группы (ОА)

При исследовании коленных суставов крыс с ХСН и ожирением наблюдались выраженные нарушения гистоархитектоники хряща. Его край был неровным, в наиболее нагружаемых участках определялось множество простых и разветвленных эрозий, достигающих промежуточную зону, клетки поверхностной зоны отсутствовали. Хрящ характеризовался диффузной гипоклеточностью, обилием пустых лакун, оставшиеся хондроциты образовывали небольшие кластеры. Матрикс хряща выглядел негомогенным, базофильная линия фрагментировалась, удваивалась или отсутствовала (Рисунок 2).

В данной группе наблюдалось значительное снижение метахромазии (фиолетовое окрашивание) при окрашивании толуидиновым синим примерно на две трети толщины хряща (Рисунок 3).

Для объективного сравнительного анализа состояния суставов животных были использованы морфологические оценочные системы: шкала полуколичественной гистохимико-гистологической оценки состояния хряща Mankin H.J. в модификации Kraus V.B., шкала оценки гистопатологии хряща OARSI (Таблица 2). Как видно из таблицы, суставной хрящ животных без каких-либо воздействий не имел патологических признаков согласно морфологическим шкалам, что позволяет рассматривать данную группу в качестве контроля, в то время как количество баллов по этим шкалам у крыс опытной группы свидетельствует о развитии экспериментального остеоартроза.

Рисунок 2.Суставной хрящ коленных суставов крыс, контрольная группа (СЛЕВА) и опытная группа (СПРАВА). Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Увеличение 300.

СЛЕВА: 1- поверхностная зона хряща, 2 –группа клеток хондроцитов промежуточной зоны хряща, 3 –клетки- хондроциты глубокой зоны хряща, 4 – межклеточное пространство хряща, 5 – субхондральная кость и костный мозг внутри (полости); стрелками показана базофильная линия, которая отделяет кальцифицирующийся хрящ от некальцифицирующегося.

СПРАВА: 1 - эрозии-дефекты поверхности хряща, 2 – единичные хондроциты промежуточной зоны, 3 –бесклеточные участки хряща, 4 – пустая лакуна после гибели хондроцита, 5 – нарушение целостности базофильной линии, 6 - субхондральная кость.

Рисунок 3.Суставной хрящ коленных суставов крыс контрольной группы (СЛЕВА) и с экспериментальным остеоартрозом (СПРАВА). Окраска: 0,5% толуидиновый синий. Увеличение 300.

Таблица 2. Сравнительная оценка состояния суставного хряща коленных суставов у крыс контрольной (без ОА) и опытной (с ОА) групп

Различия между группами достоверны по всем показателям, так как в ходе статистического анализа был выявлен уровень p<0.05

Далее с помощью морфометрического метода было изучено среднее количество клеток-хондроцитов в поле зрения. Нами было выявлено, что в опытной группе этот показатель достоверно ниже, чем в контрольной, то есть у животных с моделируемым ОА количество клеток хряща снижается. Аналогичные результаты были получены по показателю средней толщины суставного хряща, которые были достоверно ниже в опытной группе.

Далее с помощью иммуногистохимического метода было изучено содержание ключевого белка хряща коллагена 2 типа. Объективизация подсчета в баллах выявила достоверное снижение экспрессии данного коллагена в опытной группе по сравнению с контролем (Рисунок 4). Далее был изучен показатель апоптоза – запрограммированной клеточной гибели в хряще, полученный с помощью окрашивания на каспазу-3. Мы выявили значительное увеличение экспрессии каспазы-3, т.е. активизация апоптоза в опытной группе животных (Рисунок 5).

Рисунок 4. Суставной хрящ коленного сустава крыс контрольной группы (вверху) и с экспериментальным остеоартрозом (внизу). Иммуногистохимическая реакция с Anti-Collagen II. Увеличение 400.

Рисунок 5. Суставной хрящ коленного сустава крыс опытной группы с экспериментальным остеоартрозом. Иммуногистохимическая реакция с Anti-Caspase-3. Увеличение 400.

Вывод: у животных с экспериментальным остеоартрозом, по сравнению с контролем, наблюдается значительное повреждение хряща, которое объективно можно определить по шкалам Mankin в модификации Kraus и OARSI, также у них уменьшается количество клеток- хондроцитов, уменьшается толщина хряща, снижается содержание ключевого белка коллагена 2 типа и протеогликанов. Полученные изменения соответствуют морфологической картине остеоартроза. Таким образом, воспроизведение в эксперименте хронической сердечной недостаточности и ожирения у крыс-самок 8 месяцев является достоверным способом моделирования экспериментального остеоартроза.

Заключение

В заключение хочется сказать, что изучение истории развития моделирования заболеваний и анализ существующих методов моделирования показывают нам актуальность данной темы во все периоды времени.

Создание такой экспериментальной модели как остеоартроз коленных суставов на крысах позволило нам изучить и проанализировать не только проблему экспериментального моделирования данного заболевания, но и структуру остеоартроза на ранних стадиях его развития. Таким образом цель нашей работы была достигнута и модель ждет своей апробации.

Моделирование в медицине играет важную роль в создании новых методов лечения и профилактики заболеваний, а также позволяет создавать новые лекарственные препараты. Данный способ познания патологий позволяет с помощью медико-технических достижений предотвратить развитие заболеваний, что будет способствовать увеличению трудоспособного населения, которое будет приносить пользу миру.

Список использованной литературы

1. Алексеева Л.И., Таскина Е.А., Кашеварова Н.Г.. Остеоартрит: эпидемиология, классификация, факторы риска и прогрессирования, клиника, диагностика, лечение. Совpeменная ревматология. 2019. Т. 13, № 2. С. 9-21.

2. Антюфеева А.А, Лущик М.В. Создание экспериментальных моделей патологических состояний. «Международный научный вестник». 2015. №2 с.110-111

3. Галушко Е.А. Насонов Е.А. Распространенность ревматических заболеваний в России. Альманах клинической медицины. 2018. Т. 46, N 1. С. 32-39.

4. Душкин В. А., Засухин Д.H., Гордеева Л. М., Ющенко A.А. Лабораторные животные. https://бмэ.орг/index.php/ЛАБОРАТОРНЫЕ_ЖИВОТНЫЕ. 31.01.2023

5. Калягин А.Н., Казанцева Н.Ю. Остеоартроз (современные представления о клинике, диагностике и лечении)/ Учебное пособие для интернов, клинических ординаторов, врачей-курсантов/. - 2006 г.

6. Корочина К.В., Полякова В.С., Корочина И.Э. Способ моделирования остеоартроза. Патент на изобретение № 2587039. Заявка № 2015107821. Приоритет изобретения: 05 марта 2015. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20 мая 2016 года.

7. Митрофанов В.А, Жадёнов И.И, Пучиньян Д.М. Остеоартроз: факторы риска, патогенез и современная терапия. Саратовский научно-медицинский журнал. 2008. №2. с 23-30.

8. Чадаев Е.В. «Модельные объекты в медицине и ветеринарии». 2012. №2. с. 140-144.

9. Чернух А.М «Экспериментальная модель болезни». https://бмэ.орг/index.php/МОДЕЛЬ_БОЛЕЗНИ . 31.01.2023

10. Щелкунова Е.И., Воропаева А.А., Русова Т.В., Ионас С. Витаса Штоппис. Применение экспериментального моделирования при изучении патогенеза остеоартроза. Сибирский научно-медицинский журнал. 2019. №2. с. 27-37.

Приложение 1

Шкала оценки состояния хряща по MankinH.J. в модификации KrausV., 2010

Остеофиты подсчитываются по трем краям сустава (медиальное и латеральное большеберцовое плато и латеральный мыщелок бедра). Общийсчет 0–9

Приложение2

Шкалаоценкигистопатологиихряща OARSI, 2006