XIX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Применение растровой электронной микроскопии в исследованиях по биологии
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
1. Введение
Цель работы: получить для биологических объектов увеличенные изображения, имеющие научную ценность, которые позволяют выполнять необходимые измерения, а также производить расчёты и теоретические обоснования, используя необходимые сведения из физики.
Задачи работы: изучить теоретический материал о растровом электронном микроскопе. Получить серии фотографий биологических объектов, используя напыление на их поверхности металлических плёнок в вакуумной камере. Произвести ряд измерений и расчётов. Рассмотреть теоретический материал по интерференции света на наноструктурах биообъектов.
Данная тема актуальна, так как современная наука (и в частности биология) перешла на уровень изучения микромира и наномира. Практическая значимость проекта состоит в том, что собранный материал можно использовать в учебном процессе, а также непосредственно в профориентационной работе.
Объект исследования – микроскопы и получаемые на них изображения.
Предмет исследования – вопросы качества изображения, достаточного для решения тех или иных конкретных задач, стоящих перед исследователем.
Методы работы – работа с литературой, проведение экспериментов, фиксирование результатов с помощью фотографий и расчётов, проведение теоретических обоснований связанных с интерференцией света, разработка технологии получения изображений высокого качества. В процессе работы над проектом были использованы учебники по физике, биологии и вакуумной технике, а также справочные материалы из интернета.
Новизна работы – получены изображения биологических объектов, произведён ряд измерений и вычислений размеров объектов и их деталей по фотографиям с растрового электронного микроскопа, а также исследование по интерференции света на трабекулах крыльев чешуекрылых.
2. Виды современных микроскопов
Световые микроскопы можно классифицировать, например, по количеству оптических блоков или типу освещения. Для любителя подойдет монокулярный световой микроскоп с максимальным увеличением в 400 раз. Более сложные аппараты используются в узких областях науки [1,2].
Также существуют электронные и атомные микроскопы, которые в основном используются для научных исследований. Обычный просвечивающий электронный микроскоп похож на световой, за тем исключением, что объект облучается не световым потоком, а пучком электронов. Увеличение просвечивающего электронного микроскопа может достигать миллиона. Для атомно-силовых микроскопов и более.
Такие микроскопы позволяют вести исследования на молекулярном и даже атомном уровне, что привело к последним достижениям в областях генной инженерии, медицины, биологии и других науках.
3. Почему выбрана данная тема исследований?
Интернет позволяет получать разнообразную информацию. И в данном случае, изучая тему «Обыденные вещи под микроскопом», мы увидели удивительные изображения действительно обычных вещей, но увеличенные во много раз.
Но так как сфера наших интересов – биофизика, то мы решили использовать микроскопы для данной исследовательской работы, изучая и совершенствуя технологию получения высококачественных изображений с максимально возможным увеличением, которое доступно на нашем оборудовании, а также варьируя и апробируя технологию подготовки биологических объектов к исследованиям на растровом электронном микроскопе.
Мы ориентировались на фотографии из интернета (рис.1) [3].
4. Конструкции и принципы работы растрового электронного микроскопа
Растровый электронный микроскоп (РЭМ) состоит из электронно-оптической системы для получения электронного зонда, манипулятора образца со столиком для его размещения, детектора вторичных электронов для сбора вторичных электронов (или детекторов других сигналов, получаемых из образца), блока отображения изображения и операционной системы для выполнения различных операций.
Электронно-оптическая система состоит из: электронной пушки, конденсорной линзы, объективной линзы для получения электронного зонда, отклоняющей системы, состоящей из катушек отклонения луча по направлениям X и Y для сканирования электронным зондом и других компонентов. Электронно-оптическая система и пространство окружающее образец находятся в вакууме. Основные узлы на примере микроскопа с термоэмиссионной пушкой схематически показаны на рисунке 2 [4].
Принцип действия растрового электронного микроскопа (РЭМ) состоит в следующем. Электроны, генерируемые пушкой, проходят через систему электромагнитных линз и других устройств, которые в итоге фокусируют узкий пучок электронов, так называемый электронный зонд, сканирующий поверхность исследуемого объекта. То есть, сканирующие катушки отклоняют зонд в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Диаметр сканирующего пучка от 5 – 10 нм и до единиц нм. Чем меньше диаметр электронного пучка, тем лучшего пространственного разрешения РЭМ можно добиться. В результате взаимодействия электронов пучка с поверхностью образца генерируются вторичные электроны, которые собираются детектором вторичных электронов.
В камере образцов РЭМ исследование образцов происходит в вакууме, так как иначе пучок электронов рассеивался бы на молекулах атмосферы и не долетал бы до образца. Влагосодержащие образцы теряют влагу в вакууме. Поэтому биологические образцы подвергаются специальной обработке.
5. Подготовка биологических образцов для электронного микроскопа
В отличие от подготовки образцов для светового микроскопа [5] биологические объекты подвергаются металлизации, то есть напылению наноплёнок в вакуумной установке. Атомы металла летят из испарителя, который нагревают электрическим током (рис. 3 а, б). Оседая на поверхности образца, они создают плёнку, которую сканируют электронным лучом [6].
6. Изображения, полученные на растровом электронном микроскопе
Трутовик настоящий.(Fomes fomentarius.) Трутовики – грибы, развивающиеся обычно на древесине. В данном случае плодовое тело сидячее. Гименофор – часть плодового тела, несущая на поверхности тонкий спороносный слой [7]. В данном случае это – трубочки. Рис. 4 – изображения гименофора с разной степенью увеличения.
Комар-пискун, или комар обыкновенный (Culex pipiens). Размером от 3 до 7 мм. Самки питаются соками растений (для поддержания жизни) и кровью (для развития яиц), то есть являются переносчиками заболеваний. Самец питается соками растений [8].. На РЭМ голова комара и фасетки – рис. 5, 6 . Хоботок – рис. 7. Лапка – рис. 8. Крыло – рис. 9.
Малый мучной хрущак. Tribolium confusum Duv. Когда-то хрущаки обитали в дуплах и под корой деревьев. Их пища была растительного и животного происхождения. Теперь их пища: зерно, мука, сушеные фрукты, орехи и другие продукты [9]. Рис. 10 – коллаж «Малый мучной хрущак».
7. Обработка результатов экспериментов
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ ОБЪЕКТОВ
Размеры фото 9см х 12 см.
Если увеличение было в 10 000 раз, то реальные размеры участка (по длине)
12см : 10 000= 0,12 м : 10 000=0,000012м = 12 ● 10-6 м = 12 мкм.
Реальные размеры сканированного участка 9 мкм х 12 мкм.
ТРУТОВИК НАСТОЯЩИЙ
Возьмём увеличение в 500 раз. Найдём диаметр трубочки в гименофоре трутовика. Сделаем необходимые измерения. Получим пропорцию.
Длина фото на экране монитора 80 мм– реальная длина фотографий 120 мм.
Диаметр трубочки на экране 32 мм– реально на фото =48(мм).
Реальный диаметр трубочки гимена трутовика настоящего в 500 раз меньше.
d= 48 мм : 500= 0,096 мм =96 мкм.
КОМАР ОБЫКНОВЕННЫЙ
Фасетки
Возьмём увеличение в 500 раз. Найдём диаметр фасетки.
Длина фото на экране монитора 120 мм– реальная длина фотографий 120 мм.
Диаметр фасетки на экране 8 мм — реальный размер на фото х = 8 мм
Реальный диаметр фасетки в 500 раз меньше. d= 8 мм:500= 0,016 мм =16 мкм.
Крыло
Перепончатые крылья укреплены жилками и покрыты волосками и чешуйками. Они повышают скорость. Для каждого вида комаров свой рисунок.
Возьмём увеличение в 10 000 раз. Найдём длину волоска.
Длина фото на экране монитора 80 мм — реальная длина фотографий 120 мм.
Средняя длина волоска на экране 5-6 мм — реальный размер на фото х.
(мм) (мм)
Реальная длина волоска в 1 000 раз меньше.
ℓ= 7,5 мм: 1 000 = 0,0075 мм = 7,5 мкм. ℓ= 9 мм: 1 000 = 9 мкм.
ВЫВОД: Длина у волосков разная. Это видно на фотографиях. Кроме того у волосков есть изгиб, который необходимо учитывать при измерениях. Но в целом результаты проведения измерений следует считать достаточно обоснованными.
МАЛЫЙ МУЧНОЙ ХРУЩАК
Фасетки
Возьмём увеличение в 1000 раз. Найдём диаметр фасетки.
Длина фото на экране монитора 100 мм —реальная длина фотографий 120 мм.
Диаметр фасетки на экране 12 мм — реальный размер на фото х.
(мм)
Реальный диаметр фасетки в 1000 раз меньше.
d= 14,4 мм : 1 000= 0,0145 мм =14,5 мкм.
ВЫВОД: Размеры фасеток у хрущака меньше, чем у комара ≈ в 1,2 раза.
Если взять средние значения 17: 14= 1,2.
Дыхательная трубка
Возьмём увеличение в 7500 раз. Найдём диаметр трубки.
Длина фото на экране монитора 100 мм– реальная длина фотографий 120 мм.
Средняя длина волоска на экране 80 мм — реально на фото (мм).
Реальный диаметр трубки в 7500 раз меньше.
d = 96 мм: 7 500 ≈ 0,013мм = 13 мкм.
ВЫВОД: Размеры фасеток и диаметр дыхательной трубки хрущака сопоставимы.
Коготь кошки британской породы
На новых фотографиях, полученных на РЭМ впечатаны основные параметры изображения: масштабный отрезок, размер сканируемого участка, дата и время съёмки – рис. 11.
8. Изучение интерференции света на крыле мотылька
Интерференция волн – сложение в пространстве волн, при котором образуется постоянное во времени распределение амплитуд результирующих колебаний [10 -11].
Условие максимумов (минимумов): амплитуда колебаний в данной точке максимальна (минимальна), если разность хода двух волн (Δd =d2 –d1), возбуждающих колебания в этой точке, равна
целому числу длин волн Δd =± kλ
( нечётному числу полуволн Δd = ± (2k+1)λ/2), где k= 0,1,2, ...
Соответствующие изображения представлены на рис. 13 а, б.
Было проведено исследование с фотографией чешуйки крыла мотылька, который отсвечивал синим (рис.12). Применяя способ рядов, мы получили среднее значение расстояний между трабекулами – 700 нм. Далее, используя теорию об интерференции света, по чертежу (рис. 13 в) видим, что разность хода в 2 раза больше. Она составляет 1400 нм. Для усиления света нужно, чтобы на ней укладывалось целое число длин волн. 1 длина волны – 1400 нм и 4 длины волны – 350 нм. Такие длины волн мы не видим. Если разность хода – 3 длины волны, то 1400:3≈467 нм. Это синий цвет. 1400: 2= 700 нм – это красный конец спектра. Этот цвет мы наблюдаем, как смешение с синим (в виде фиолетового отлива на крыле). При этом надо учитывать, что расстояния между трабекулами различаются. Значит, длина волны λ будет 700±100 нм (нанометров). То есть часть света уже не видно. А 467±100 это – в любом случае видимый диапазон [12].
.
9. Заключение
В результате работы были получены и исследованы фотографии на растровом электронном микроскопе, где размеры объектов измеряются в микрометрах и нанометрах. По фотографиям биообъектов были произведены измерения и вычисления размеров самих объектов или их деталей. При этом применялась особая методика подготовки биологических образцов – термическое напыление металлов в вакууме на поверхность, подлежащую исследованию. В работе также дано обоснование цвета на крыле мотылька с использованием теории об интерференции света на наноструктурных деталях крыла.
10. Список литературы
1. Пёрышкин, А. В. Физика – 8./ А.В. Перышкин. – М.: Дрофа, 2020. – 238 с.
2. Световой микроскоп
– URL: http://www ru.wikipedia.org/wiki/(дата обращения: 10.05.2022).
3. URL: http://www Pingback: Обычные вещи под микроскопом |
emky.net/.../(дата обращения: 1.05.2022).
4. Растровый электронный микроскоп
– URL: http://www ru.wikipedia.org/wiki/(дата обращения: 10.04.2022).
5 .Методы приготовления препаратов для микроскопии...
–URL: http://www himsnab-spb.ru/.../( дата обращения: 15.05.2022).
6. Магкоев, Т. Т. Физические основы растровой электронной микроскопии/ Т.Т. Магкоев, И. В. Силаев, И. В. Тваури, Т. И. Радченко, Сапунова Н. В., Созаев З.Т. – Владикавказ: ИПЦ СОГУ, 2022. – 187 с.
7. Трутовик настоящий (Fomes fomentarius) фото и описание
– URL: http://www ru. WikiGrib.ru/trutovik-nastoyaschij/ (дата обращения: 9.09.2022).
8. Комар обыкновенный
– URL: http://www ru.wikipedia.org(дата обращения: 9.09.2022).
9. Хрущак малый мучной — Википедия
– URL: http://www ru.wikipedia.org(дата обращения: 5.09.2022).
10. Инфоурок. Интерференция (дата обращения: 25.09.2022).
11. Мякишев Г. Я., Буховцев Б. Б., Чаругин В. Физика-11. – М.: Просвещение, 2020. –320 с.
12. Видимое излучение — Википедия
– URL: http://www ru.wikipedia.org/wiki/Видимое_излучение(дата обращения: 18.09.2022).
Приложения
Рис. 1 а) клетки крови; б) лапка мухи; в) долгоносик
Рис.2. Растровый электронный микроскоп
1-вольфрамовый термоэмиссионный катод; 2 – электрод Венельта; 3 - анод; 4 – электронный луч; 5 – конденсорная система линз; 6 – катушки отклоняющей системы; 7 – объективная линза; 8 – образец; 9 – детектор сигналов; 10 – герметичный корпус; 11 – электроника осуществляющая управление микроскопом, сбор, анализ и визуализацию результатов сканирования образца
Рис. 3. Вакуумные камеры. 1. Колпак; 2. Испаритель и испаряемое вещество; 3. Подложка и нагреватель подложек
Рис. 4. Трутовик: х300, х3000, х10 000
Рис.5. Голова комара: х50 Рис. 6. Фасетки комара: х500
Рис. 7. Хоботок комара: х100, х1000 Рис. 8. Лапка комара: х5000
Рис. 9. Крыло комара: х100, х10 000
Рис. 10. Малый мучной хрущак
Рис. 11. Кошка и ее коготь. Увеличение в 50 и 500 раз
Рис. 12 а - в. Крыло мотылька: х100, х500, х10 000
Рис. 13 а, б, в. Интерференция света