II Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РОСТ БАКТЕРИЙ

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Равко А.В. 1

---

1МБОУ СОШ №8 г.Белово

Равко В. 1

---

1ОАО РЖД

Работа в формате PDF

1.3 MB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Кузбасс место огромного количества угледобывающих шахт и разрезов. И, как и в любой отрасли, угледобывающая, сталкивается с определенными проблемами. Одной из самых основных является наличие в шахтах метана. В шахтах метан скапливается в пустотах среди пород, в основном, под кровлей выработок и может создавать взрывоопасные метановоздушные смеси. В старину шахтёры брали с собой в шахту клетку с канарейкой, и пока слышалось пение птицы можно было работать спокойно: в шахте нет метана. Если же канарейка замолкала на долгое время, а еще хуже — навсегда, значит — рядом смерть. В начале XIX века известный химик Х. Дэви изобрел безопасную шахтерскую лампу, затем на смену ей пришло электричество, но взрывы на угольных шахтах продолжались. В настоящее время концентрация метана в рудничной атмосфере контролируется автоматическими системами газовой защиты.

Может ли еще что-то служить анализатором среды? Современные газоанализаторы дороги, использование канареек, на мой взгляд, не гуманно. Мы задались вопросом: можно ли создать анализатор среды на основе бактерий, ведь микроорганизмы очень чувствительны к среде обитания. В первой части своей работы я буду изучать, то как среды могут воздействовать на бактериальные культуры

Гипотезой является предположение о том, что бактериологические культуры реагируют на изменение среды неодинаково

Цель: изучение влияние среды на бактериологические культуры

Задачи:

1. Изучить литературу по данной теме

2. Выбрать методики проведения исследований бактериальных культур

3. Провести эксперименты с бактериальными культурами;

4. Сформулировать требования к бактериальной культуре – анализатору среды;

Объект исследования: факторы среды, влияющие на жизнедеятельность бактериологических культур.

Предмет исследования: характер воздействия факторов среды на рост бактерий.

Методы: эксперимент, наблюдение, математическая обработка данных.

1. Микроорганизмы и факторы, влияющие на их жизнедеятельность

1.  

   1. Микроорганизмы

Микробы (микроорганизмы) представлены неклеточными, или доклеточными, формами (вирусы, вироиды, прионы) и клеточными формами (бактерии, архебактерии и простейшие). По высшему уровню в иерархии классификации среди форм клеточных форм жизни различают три домена («империи»), имеющие ранг «надцарства»:

• домен «Bacteria» - прокариоты. Клетки имеют ядро без ядерной оболочки (истинные бактерии, или эубактерии);

• домен «Archaea» - прокариоты (архебактерии);

• домен «Eukarya» - эукариоты. Клетки имеют ядро с ядерной оболочкой и ядрышком. Включает в себя царства Грибы (Fungi), Растения . [2, с. 37]

1.  

   1. Бактерии. Признаки бактериальных колоний.

Бактерии – одноклеточные микроорганизмы, у которых отсутствует ядро. На этом основании их выделяют в надцарство Прокариоты, или Предъядерные. Размеры клетки у большинства бактерий на порядок меньше, чем у грибов, растений или животных, и колеблются в пределах 0,2-10 мкм. Сегодня известно более 5000 видов бактерий. Несмотря на такие миниатюрные размеры, многие виды бактерий можно увидеть невооруженным глазом. Конечно, речь идет не об отдельных бактериальных клетках, а о колониях бактерий – потомстве клеток одного вида на поверхности твердой питательной среды.

Заслуга в разработке методов выделения и изучения бактерий на твердых питательных средах принадлежит выдающемуся немецкому ученому Роберту Коху. Этот метод исследования микроорганизмов получил название метода чистых культур. В 1882 году Р. Кох впервые соединил преимущества непрозрачных и прозрачных питательных сред в одном методе. Для получения прозрачной твердой питательной среды он добавил к питательному бульону желатин, превратив его в желе. Среды с желатином или агар-агаром и сегодня широко используются для культивирования микроорганизмов.

Колонии бактерий различны по величине, форме, рельефу, консистенции, поверхности и окраске. Все эти признаки можно увидеть либо невооруженным глазом, либо с помощью лупы.

Величина колонии – это ее диаметр. Различают колонии точечные (диаметром меньше 1 мм), мелкие (1-2 мм), средние (3-4 мм), крупные (4-5 мм и более).

Форма колоний бывает правильной (круглой) и неправильной (амебовидной, корневидной, напоминающей переплетающиеся корни деревьев).

Рельеф колонии характеризуется приподнятостью над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Различают колонии: плоские, стелющиеся по поверхности среды; выпуклые, представляющие в разрезе сегмент шара; колонии с вдавленным центром; с приподнятой в виде соска серединой.

Поверхность колонии бывает матовая или блестящая, с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Механизм формирования гладких или шероховатых колоний обусловлен различием процессов клеточного деления.

Окраска колонии определяется пигментом, который производит культура микробов. Колонии могут быть бесцветные или молочно-белого цвета, их еще называют неокрашенными. Пигментообразующие виды микробов могут дать колонии разных цветов: кремовые, оранжевые, синие, красные, черные, желтые, золотистые и др.

Консистенцию колонии микробов оценивают посредством прикосновения или взятия из нее материала специальным инструментом - бактериальной петлей. По консистенции различают вязкие колонии, пастообразные, волокнистые или кожистые, хрупкие, сухие. Рост колоний происходит в термостате при поддержании постоянной температуры после оседания бактерий на питательную среду. [5, c. 62]

1.  

   1. Окрашивание микроорганизмов

Окраска микроорганизмов (крашение микробов) — комплекс методов и приёмов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов. Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности. После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.

Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно — красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны.

Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.

Из сложных способов окрашивания бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю — Нельсону и др.

1.  

   1. Факторы, влияющие на жизнедеятельность бактерий

Все факторы внешней среды, оказывающие влияние на жизнедеятельность микробов, можно разделить на три группы:

1. физические (влажность, температура, свет, концентрация растворенных в воде веществ);

2. химические (реакция среды, окислительно-восстановительные условия, действие различных веществ);

3. биологические (антагонизм между микробами, симбиоз, антибиотики, витамины, фаги)

Развитие клетки и любого организма зависит от влажности среды. Высушивание, приводящее к обезвоживанию, губительно действует на микробов. Поэтому сушку используют как один из методов борьбы с микроорганизмами. На основе гибели микроорганизмов при обезвоживании основан и один из способов запасания продуктов на зиму, например, сушка грибов и ягод.

Температура также влияет на жизнедеятельность организмов. Для уничтожения микробов применяют тепловую обработку продуктов – стерилизацию и пастеризацию.

Губительное воздействие ультрафиолетовых и инфракрасных лучей широко применяется в медицине для обеззараживания воздуха в больничных помещениях, также приборы, создающие такие виды излучения, можно использовать для дезинфекции воды и пищевых продуктов.

Биологические методы борьбы с микроорганизмами основаны на антагонизме между ними. Часто развитие одних организмов угнетает развитие другие, а некоторые способны выделять особые вещества – антибиотики.

1.  

   1. Математические методы подсчета количества КОЕ

По В.Л. Омелянскому на 100 см² поверхности агара в течение 5-10 минут оседает такое количество бактерий, которое содержится в 10 л воздуха. Зная площадь чашки Петри (78,5 см²) и количество выросших колоний можно определить, какое количество микробов выросло бы на данной экспозиции на 100 см² среды:

,

где x – количество микробов на 100 см² питательной среды.

Площадь чашки можно заменить на площадь прикладываемого образца, в случаях когда посев не располагается по всей поверхности питательной среды.

В посевах, подвергшихся обработке, можно определить антибактериальную активность вещества, которым обработаны посевы. Для оценки активности рассчитывается относительное снижение числа микроорганизмов в посеве по сравнению с контрольным опытом. По формуле, предложенной Л.В. Антадзе

,

где К – число микроорганизмов в контроле, О – число микроорганизмов в опыте. [1, c.42]

1. Экспериментальная часть

В ходе эксперимента будут произведено исследование влияние среды на бактериологические культуры

1.  

   1. Получение бактериальных культур

Для посева я буду использовать те бактерии, которые окружают нас в обычной жизни. Я возьму мазки с клавиатуры компьютера, телефона, денежной купюры, дверной ручки и телевизионного пульта. Так же, будут сделаны посевы с пальцев рук.

1.  

   1. Техника безопасности

Для работы с непатогенными микроорганизмами нами были разработаны следующие правила техники безопасности

1. К работе с микробиологическими препаратами допускаются лица после прохождения инструктажа по технике безопасности.

2. В помещение с микробиологическими образцами запрещено вносить пищу, питьевую воду, посторонние вещи, запрещается принимать пищу.

3. Наблюдения заносятся в лабораторный журнал

4. На рабочем месте размещаются только необходимые для выполнения конкретной лабораторной работы оборудование и материалы.

5. При работе с микроорганизмами следует использовать средства индивидуальной защиты: респиратор, защитные очки, перчатки

6. При работе с микроорганизмами соблюдать осторожность и придерживаться приемов, исключающих возможность инфицирования.

7. Запрещается прикасаться к микробным культурам руками.

8. Если микроорганизмы случайно попали на стол, следует немедленно удалить их тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. При работе с жидкой культурой пользоваться спецсредствами для забора микроорганизмов.

9. В конце работы привести в порядок рабочее место. Тщательно вымыть руки и обработать ватным тампоном с дезинфицирующим раствором.

1.  

   1. Приборы и материалы

Для посевов будут использованы чашки Петри диаметром 90мм, в качестве среды для посева используется порошок сухого агара. Для отбора проб будут использованы стерильные марлевые салфетки и стерильные резиновые перчатки. Для обработки посевов будут использованы следующие препараты: вода, дегтярное мыло, обычное мыло, глицериновое мыло, жидкое антисептическое мыло Dettol, антисептическое мыло Safeguard, мыло с экстрактом ромашки, отвар ромашки, спирт, гелевый антисептик, противогрибковый препарат широкого спектра действия, антибиотик широкого спектра действия, раствор хлора 50%, раствор сахара. Для работ по наблюденью за посевами будут использованы восьмикратное увеличительное стекло на подставке. В качестве обеззараживающих растворов для утилизации отработанных сред использовался раствор хлора 50%. Для безопасности работ со средами использовались одноразовые резиновые перчатки, респиратор, защитные очки.

1.  

   1. Методика эксперимента

      1. Подготовка питательной среды

Для отбора проб микроорганизмов существует множество разновидностей питательных сред: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среда Лурия-Бертани (среда ЛБ), желточно-солевой агар и другие.

При проведении исследований использована среда, приготовленная из питательного сухого агара.

Для приготовления среды я размешала 25 г порошка в 1 л дистиллированной воды, довела до кипения. Кипячение производила до полного расплавления агара (2-3 мин), потом профильтровала через ватный тампон. Перед розливом в чашки Петри среда была охлаждена до 50⁰ С. По инструкции, среды нужно выдерживать в термостате и автоклаве. Но, так как цель нашей работы не получить чистую культуру, а выявить наличие бактерий, эти пункты были пропущены.

1.  
   1.  

      1. Методика посева образцов

Для посевов №№ 30,31,32,33,34 были взяты мазки с предметов быта. Для этого стерильной марлевой салфеткой были произведены мазки по предмету, после чего салфетка была помещена на некоторое время на питательную среду.

Материал для посева №30 брался с клавиатуры ПК, №31 – сенсорного экрана телефона, №32 – клавиатуры телевизионного пульта, №33 – денежной купюры, №34 – дверной ручки.

Для посевов №№ 1-20 была использована иная методика. Рука, с которой были взяты посевы, была одета в резиновую перчатку. Затем с перчатки срезался один палец. Освобожденным пальцем делалось прикосновение к питательной среде. Затем палец обрабатывался антисептическим раствором, и делалось еще одно прикосновение. Затем процедура повторялась со следующим пальцем. Данные действия были направлены на то, чтобы каждый палец обрабатывался только одним антисептическим препаратом.

Пробы №№ 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19 – посев пальцем без обработки.

Проба №2 – обработка водой, №4 - дегтярным мылом, №6 – обычным мылом, №8 – глицериновым мылом, №10 – антисептическим мылом Dettol, №12 – антисептическим мылом Safeguard, №14 – мылом с содержанием ромашки, №16 – отвар ромашки, №18 – спиртом, №20 – гелевым антисептиком.

В ходе работы с чашками, каждая из них была пронумерована.

После проведения посевов чашки Петри были перевернуты и помещены в темное место со стабильной температурой. Для фиксации происходящих изменений был создан журнал наблюдений.

1.  

   1. Работа с микробиологическими культурами

1.  
   1.  

      1. Выделение бактериальных культур.

Так как посевы производились с неизвестными заранее микробиологическими культурами, то велика вероятность того, что в чашки, наряду с бактериями могли попасть грибковые культуры. Часто развитие одних организмов угнетает развитие другие, а некоторые способны выделять особые вещества – антибиотики.

Для устранения такого влияния, после того как в чашках появились видимые невооруженным глазом колонии микроорганизмов, чашки были обработаны противогрибковым средством широкого спектра действия.

В результате наблюдения было установлено, что рост части колоний остановился, что позволило сделать следующие выводы:

1.  
   1.  
      1.  
         1.  
            1.  
               1.  

                  1. Часть микробиологических колоний являлись грибковыми.

                  2. Увеличение числа КОЕ и рост размеров колоний, свидетельствует о снижении конкуренции между грибковыми и бактериологическими культурами

2.5.2. Проверка влияния антисептических растворов бактериальную активность

Для этого этапа были взяты посевы №№1-20

Таблица количества КОЕ в разные дни для посевов №№1-20 представлена в Приложении 1.

В посевах, подвергшихся обработке, определим антибактериальную активность вещества, которым обработаны посевы. Для оценки активности рассчитывается относительное снижение числа микроорганизмов в посеве по сравнению с контрольным опытом. По формуле, предложенной Л. В. Антадзе

,

где К – число микроорганизмов в контроле, О – число микроорганизмов в опыте

Таблица значений антибактериальной активности веществ, которыми были обработаны посевы №№1-20, представлена в Приложении 2.

Диаграмма антибактериальной активности веществ использованных для посевов №№ 1-20 представлена в Приложении 2.

Как видно из таблицы (диаграммы), все не антисептические растворы значительно уменьшают количество выживших после обработки бактерий.

2.5.3. Проверка влияния сред на бактериальную активность

Для этого этапа были взяты посевы №№30-34

Для проверки влияния среды я выбрала следующие факторы

1. Температурный фактор: чашка с образцами была вынесена на мороз (посев №32)

2. Биологический фактор (антибиотики): чашка была обработана антибиотиком широкого спектра действия (посев №31)

3. Химическая фактор: чашка была обработана раствором хлора (посев №30)

4. Фактор среды (положительный): в чашку добавлен раствор сахара (посев №33)

5. УФ воздействие: чашка подвергалась УФ облучению (посев №34)

Таблица количества КОЕ в разные дни для посевов №№30-34 представлен в Приложении 1.

В следствии этих воздействий, мы получили следующие результаты.

1. Температурный фактор: Количество КОЕ не изменилось, размер колоний не изменился. Следовательно, значительное снижение температуры прекращает рост бактерий

2. Биологический фактор (антибиотики): Количество КОЕ уменьшилось, размер колоний уменьшился. Следовательно, антибиотики значительно влияет на количество бактерий. Оставшиеся колонии можно объяснить устойчивостью к данному антибиотику.

3. Химическая фактор: бактериальные колонии практически исчезли. Следовательно, агрессивное химическое воздействие может полностью уничтожить колонии бактерий.

4. Фактор среды (положительный): в чашку добавлен раствор сахара

Количество КОЕ увеличилось, размер колоний увеличился. Следовательно, повышение и/или изменение питательности среды значительно влияет на количество бактерий. Новые КОЕ можно объяснить изменением питательной среды

1. УФ воздействие: Количество КОЕ уменьшилось, размер колоний уменьшился. Следовательно, УФ излучение значительно влияет на количество бактерий. Оставшиеся колонии можно объяснить недостаточным временем воздействия.

В посевах, подвергшихся обработке, определим антибактериальную активность вещества, которым обработаны посевы. Для оценки активности рассчитывается относительное снижение числа микроорганизмов в посеве по сравнению с контрольным опытом. Опять используем формулу предложенную Антадзе.

Таблица значений антибактериальной активности веществ которыми были обработаны посевы №№30-34 представлена в Приложении 2.

Диаграмма антибактериальной активности веществ использованных для посевов №№30-34 представлена в Приложении 2.

Как видно из таблицы (диаграммы), воздействие раствором хлора, антибиотиком и УФ-излучением значительно уменьшили количество бактерий в посеве. Добавление же раствора сахара значительно увеличило количество КОЕ, добавив бактериям питательной среды. Нулевое значение воздействия после помещения посева в условия низкой температуры не означает, что не произошло антибактериального воздействия. Просто для исчезновения имеющихся колоний бактерий или появления новых КОЕ должно пройти большее время. Но холод полностью остановил рост уже имеющихся КОЕ.

Заключение

Изучив литературу, я смогла грамотно подойти к выполнению исследования. Подбор методики позволил провести эксперимент и получить достоверные результаты. Проведенный эксперимент помог сформировать мне список требований к бактериальной культуре, которая могла бы служить анализатором среды

Большинство сред, так или иначе, воздействует на бактериальные культуры. Фактор среды может замедлить, ускорить или полностью уничтожить бактерии. Это позволяет сделать следующий вывод: существует возможность подобрать бактериальную культуру, которая будет реагировать на необходимое изменение среды и не реагировать на остальные факторы, тем самым выполняя роль маркера.

Моя гипотеза полностью подтвердилась. На рост бактерий факторы среды оказывают значительное влияние. Выполнение данной работы помогло сформировать мне список требований к бактериальной культуре, которая могла бы служить анализатором среды. Например, такая культура могла бы определять содержание метана в шахте.

Культура – анализатор среды, должна удовлетворять следующим условиям:

1.  
   1.  
      1.  

         1. Быстрый рост

         2. Непатогенность

         3. Видимый маркер (фосфоресценция или яркая окраска)

         4. Резистентность (нетребовательность к условиям роста, кроме определяемого вещества)

         5. Эвритермность (нетребовательность к температурному диапазону)

Подбор данной бактерии требует исследований только в лабораторных условиях, зато этот способ позволил определять вещества, определение которых другими способами дорого или невозможно.

Список источников

1. Антадзе Л.В. Фитонциды в медицине, сельском хозяйстве и пищевой промышленности. – Киев: 1960.

2. Воробьев, Воробьев А.А., Быков А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для студентов медицинских вузов. – М.: Медицинское информационное агентство, 2003. – 236 с.: ил. Быков, 2003

3. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологического исследования. – М.: «Медицина», 1978. – 394 с.: ил.

4. Методическое пособие по учету, отчетности и организации СанЭпидСтанции. – Архангельск, Ротапринт, 1974. – 81с.

5. Шапиро Я.С. Микробиология: 10 – 11 классы: учебное пособие для учащихся общеобразовательных учреждений. – М.: Вентана-Граф, 2008. – 272 с.: ил

Приложение 1. Таблицы

Таблица количества КОЕ в разные дни для посевов №№1-20

Таблица количества КОЕ в разные дни для посевов №№30-34

Таблица значений антибактериальной активности веществ которыми были обработаны посевы №№1-20

Таблица значений антибактериальной активности веществ которыми были обработаны посевы №№30-34

Приложение 2. Диаграммы

Диаграмма антибактериальной активности веществ использованных для посевов №№1-20

Диаграмма антибактериальной активности веществ использованных для посевов №№30-34

Приложение 3. Журнал наблюдений