«Я утверждаю, что все рождающееся от земли живет за счет земной влаги,
и в каком состоянии находится эта влага, в таком
состоянии находится и растение»
Гиппократ
Ведение
Эти слова, сказанные Гиппократом еще в глубокой древности, не потеряли свою актуальность и сейчас. В наше время общество осознало опасность токсического загрязнения поверхностных вод и пришло к необходимости введения в практику мониторинга совершенно новых нетрадиционных подходов, в частности биологического тестирования. Биотестирование - исследование влияния различных веществ на живые организмы. Широкое внедрение методов биотестирования в практику оценки качества вод – настоятельная необходимость времени, так как никакая даже самая современная аналитическая химия не даст полной информации о токсичности среды. К тому же анализ существующих методов оценки качества природных вод показал, что биотестирование – наиболее точный, быстрый и дешёвый способ охраны природных вод. [1]
В своем исследовании с помощью данного метода мы решили выяснить, в каком же состоянии находится вода нашего города, которую мы пьем и которой поливаем растения, используемые нами в пищу.
Гипотеза: с помощью методов биотестирования можно оценить степень загрязнения
природных вод.
Объект исследования: степень загрязнения природных вод г.Пятигорска.
Предмет исследования: однолетние растения семейства Злаковые (Gramíneae): овёс, ячмень, пшеница, однолетние растениясемейства Капустные, или Крестоцветные (Brassicaceae) - кресс-салат и редис.
Цель данной работы - оценить загрязнение природных вод г.Пятигорска по проросткам различных растений-индикаторов.
Задачи:
провести анализ теоретических подходов в изучении данной темы;
освоить методику биотестирования;
установить сезонную динамику токсичности природных вод г.Пятигорска;
определить зависимость развития тест-растений от токсичности природных вод.
1. Литературный обзор.
Методы биотестирования.
Одной из главных причин негативных последствий антропогенного загрязнения природных сред является токсичность загрязняющих веществ для биоты. Именно присутствие токсикантов в окружающей среде приводит к гибели всего живого, выпадению из состава сообществ организмов обитателей чистых зон и замене их эврибионтными видами. Существуют различные физические и химические методы определения токсичности окружающей среды, но в последнее время стали широко использоваться и биологические методы позволяющие провести оценку состояния живых организмов (Приложение 1).
Ведь говоря о загрязнении воды, почвы, атмосферы, об их токсичности мы имеем в виду, то насколько они благоприятны для обитания в них живых организмов, для здоровья человека.К числу наиболее радикальных приёмов относятся методы токсикологического биотестирования. Под биотестом понимается испытание в строго определённых условиях действия вещества или комплекса веществ на водные организмы посредством регистрации изменений того или иного биологического показателя исследуемого объекта по сравнению с контролем. Исследуемые организмы называются тест-объетами, а опыт биотестированием (Лысенко, 1996). Этот дешевый и универсальный метод в последние годы широко используется во всем мире для оценки качества объектов окружающей среды. В России с 1996 года начат эксперимент по внедрению методов биотестирования сточных вод, сбрасываемых в природные водоемы и подаваемых на сооружения биологической очистки.[5] С помощью биотестирования можно получить данные о токсичности конкретной пробы, загрязненной химическими веществами антропогенного или природного происхождения. Этот метод позволяет дать реальную оценку токсичности свойств какой-либо среды, обусловленной присутствием комплекса загрязняющих веществ и их метаболитов. Живые организмы всегда в той или иной степени реагируют на изменение окружающей среды, но в ряде случаев это нельзя выявить физическими или химическими методами, так как разрешающие возможности приборов или химических анализов ограничены. Чувствительные же организмы – индикаторы реагируют не только на малые дозы экологического фактора, но и дают адекватную реакцию на воздействие комплекса факторов (Груздева, 2002). [3].
Биотестирование позволяет установить районы и источники загрязнения. В качестве тест-объектов используются бактерии, водоросли, высшие растения, пиявки, дафнии, моллюски, рыбы и другие организмы. В порядке возрастания толерантности к загрязнениям организмы располагаются в следующий ряд: грибы, лишайники, хвойные, травянистые растения, листопадные растения. Каждый из них имеет преимущества, но, ни один не является универсальным, самым чувствительным ко всем веществам. Для гарантированного выявления присутствия в природных водах токсического агента неизвестного химического состава нужно использовать набор тест-объектов, представляющих различные группы организмов. При выборе тест-организмов исходят из видовой токсичности возможных загрязнителей, особенностей водоема и требований водопотребителей. Для тест-организмов могут быть выделены частные интегральные тест-функции. Интегральные параметры характеризуют состояние системы наиболее обобщённо. Для организмов к интегральным относят характеристики выживаемости, роста, плодовитости. Частными для организма, например, могут быть физиологические, биохимические и гистологические параметры. [6]
Биотестирование природных вод.
Биотестирование природных вод стало широко применяться в научно- исследовательских работах с начала 80-х годов (Приложение 2). Это объясняется существенным увеличением уровня загрязнения водных объектов и надеждами специалистов на то, что биотестирование сможет хотя бы частично заменить химический анализ вод, так как в водные объекты ежегодно сбрасывается около 55 км3 сточных вод, из которых 20 км3 загрязнен. (Степановских, 2001). До нормативного качества очищается лишь около 10% вод требующих очистки (Яблоков, 2005). [9]
В 1991г. биотестирование введено как обязательный элемент контроля качества поверхностных вод, что предусмотрено «Правилами охраны поверхностных вод» (1991). Показатели биотестирования природных вод включены в перечень показателей для выявления зон чрезвычайной экологической ситуации и зон экологического бедствия (Туманов, Постнов, 1983). [9] Методы биотестирования представляют собой характеристику степени воздействия на водные биоценозы. Так, А.М. Гродзинский Д.М. Гродзинский (1973) описывают ряд биологических проб для тестирования токсичности природных вод. [2] Согласно принятому определению, биотестирование воды – это оценка качества воды по ответным реакциям организмов, являющихся тест-объектами. Тест на прорастание семян применяется для установления воздействия различных физиологически активных веществ. В качестве индикаторов токсичности используются семена сельскохозяйственных растений. Среди сельскохозяйственных культур наиболее чувствительны салат, люцерна, злаковые, крестоцветные, а к нечувствительным видам относят кукурузу, виноград, розоцветные, подорожник (Рамад,1981). [6] Методы биотестирования должны отвечать следующим требованиям: относительная быстрота проведения, получение достаточно точных и воспроизводимых результатов, наличие, пригодных для индикации объектов в большом количестве. В настоящее время хорошо известны методы биотестирования, ориентированные на определение токсичности водной среды, обусловленной присутствием определенных групп химических соединений, в частности фосфорорганических. Наиболее апробирован на природных водах ферментативный метод В.И. Козловской. [4]
Достоинства методов биотестирования.
Главные достоинства биотестирования – простота и доступность приемов ее постановки, высокая чувствительность тест-организмов к минимальным концентрациям токсических агентов, быстрота, отсутствие надобности в дорогостоящих реактивах и оборудовании. По мнению ряда авторов ни один из отдельно взятых организмов не может служить универсальным тест-объектом к веществам различной химической природы, следовательно, для гарантированного выявления в среде токсичного агента должен использоваться набор биотестов (Брагинский и др. 1979; Лесников, 1983; Филенко, 1989). [9]
Методами биотестирования выявляется токсичность, которая является интегральным показателем загрязнения природных сред. Как и все интегральные показатели, они имеют тот недостаток, что не раскрывают индивидуальные загрязняющие вещества, присутствующие в пробе. Работ по биотестированию водной среды опубликовано множество, но они были сделаны главным образом с целью оценки токсичности вновь синтезируемых химических препаратов, препаратов, приобретаемых по импорту, а также при разработке регламентов на химические соединения. Гораздо меньше публикаций по биотестированию сточных вод и ещё меньше – по биотестированию природных вод (Никаноров, Хоружая, 2001). [1]
Методы биоиндикации, позволяющие изучать влияние техногенных загрязнителей на растительные и животные организмы на неживую природу являются наиболее доступными. Биоиндикация основана на тесной взаимосвязи живых организмов с условиями среды, в которой они обитают. Изменения этих условий, например повышение солености или рН воды может привести к исчезновению определенных видов организмов, наиболее чувствительных к этим показателям и появлению других, для которых такая среда будет оптимальной. [2]
Существуют разные биологические индикаторы. О наличии некоторых загрязнителей можно судить по внешним признакам растений и животных. Благодаря «памяти» этих организмов, можно узнать и о роли тех факторов, которые в настоящее время уже не действуют. Например, появление черных пятен на листьях липы рассказывает о том, что в зимнее время дворники чрезмерно увлекались посыпанием снега солью для ускорения его таяния, о выбросах сернистого газа расскажут пятна на листьях подорожника большого. По ширине годичных колец сосен в окрестностях химического предприятия можно определить, в какие годы завод особенно сильно загрязнял среду. В годы сильного загрязнения атмосферы закладываются более тонкие кольца. По высоте некоторых растений можно судить о концентрации солей в воде. Так, например, тростник может достигать высоты 4 м, но если содержание солей в воде высокое — это растение не вырастет более чем на 0,5 м. Индикаторами загрязнения атмосферы являются некоторые мхи и лишайники. Например, при анализе лишайников в Швеции было установлено появление радиоактивной пыли от Чернобыльской АЭС. Существуют специальные живые приборы — бриометры — маленькие коробочки со мхами определенных видов, по которым определяют режим задымления атмосферы. [9]
Практическая часть.
Исследования проводились по методикам, предложенным А.И. Федоровой и А.Н. Никольской в «Практикуме по экологии и охране окружающей среды», 2003, а также в учебном пособии для вузов «Экологический мониторинг» под редакцией Т.Я. Ашихминой, 2005. [7] [8]
Работа по изучению метода биотестирования токсичности природных вод по проросткам растений индикаторов выполнялась в течение 2015 года.
Все исследования по теме проводились в лаборатории кабинетов химии и биологии МБОУ СОШ №5 г. Пятигорска в дневное время, при сочетании искусственного и естественного освещения в стандартных, оптимальных для тест-растений условиях. Оценить уровень загрязнения водоемов можно, используя тест на прорастание семян. Такое тестирование проводится как предварительное для выявления особенно загрязненных водоемов с целью последующего химического анализа. В качестве тест-растений были использованы проростки высших растений: пшеницы, ячменя, овса, кресс-салата, редиса. Предлагаемый метод биологической оценки токсичности природных вод по проросткам растений индикаторов проводился в двух вариантах:
1.Полив проростков тест-растений испытуемой водой.
2. Накапывание испытуемого раствора между семядолями двудольных растений.
В качестве тест-растений в первом варианте применяли семена пшеницы, овса, ячменя. Во втором варианте были использованы только проростки двудольных растений: кресс-салата, редиса.
Из всех используемых в исследованиях растений кресс-салат обладает повышенной чувствительностью к загрязнению воды тяжелыми металлами. Этот биоиндикатор отличается быстрым прорастанием семян и почти 100% всхожестью, которая заметно уменьшается в присутствии загрязнителей. Кроме того, побеги и корни кресс-салата под действием загрязнителей подвергаются заметным морфологическим изменениям (задержка роста и искривление побегов, уменьшение длины и массы корней) (Голубкина, 2008). [9]. С целью профилактики перед проращиванием семена протравливали. Сухие семена погружали в 1%-ный раствор марганцовокислого калия на 0,5 часа, а затем промывали дистиллированной водой, используя два слоя марли, обсушивали на фильтровальной бумаге на воздухе.
Метод полива проростков тест-растений испытуемой водой
(1 вариант).
За 2-3 дня до опытов (сроки прорастания семян выяснялись заранее) семена тестовых объектов, пшеницы, овса, ячменя, замачивались на сутки в воде. Затем раскладывались пинцетом зародышем вверх (в одном направлении) в кювету, на дно которой был уложен слой гигроскопической ваты, а сверху – два слоя фильтровальной бумаги. Система увлажнялась водопроводной водой до полной влагоёмкости. Для этого вода наливалась под вату, а после её впитывания удалялся избыток. Кювета накрывалась плёнкой, края плёнки подгибались под кювету. Проращивание производилось при температуре +250С - +260С до размера основной массы проростков 10-15мм и появления корней, после чего ростки разделяют на фракции по длине.
В стаканчики помещают одинаковое количество промытого и покалённого песка, в каждый стаканчик высаживают по 10 одинаковых проростков тест-растений. Песок поливают сверху одинаковым количеством испытуемой воды из разных водоёмов. Повторность – трёхкратная. Контроль – полив отстоянной и очищенной водопроводной водой. После достижения ростками высоты 8-10см их выкапывают, обсушивают фильтровальной бумагой, разделяют бритвой на части (стебель, корни), измеряют и взвешивают. Данные обрабатывают статистически, выражают в процентах к контролю.
Метод полива проростков тест-растений испытуемой водой
(2 вариант).
Воду, взятую из различных источников, концентрируют упариванием в 10 раз, хранят в холодильнике. Стаканчики наполняют одинаковым количеством промытого и прокалённого песка, вставляют стеклянную трубочку до дна, через которую производят полив, отстоянной водопроводной водой. 18-20 штук всхожих семян (кресс-салат, редис) высевают на небольшую глубину. После того, как ростки взойдут и раскроются семядоли, в стаканчиках оставляют по 10 одинаковых растений, остальные выщипывают пинцетом. Полив субстрата для выращивания производят одинаковым количеством воды через трубочку, используя воронку из фольги. Через 2-3 недели осторожно выкапывают проростки, промывают, обсушивают фильтровальной бумагой, измеряют и взвешивают отдельно надземную часть и корни. Данные обрабатывают статистически, выражают в процентах к контролю.
Развитие проростков тест-растений при поливе их испытуемой водой (весенний период).
№ пробы, место взятия пробы |
Тест –растение |
Наземная часть, % |
Корни, % |
||
Длина |
Масса |
Длина |
Масса |
||
1.Река Подкумок |
овес |
61 |
63 |
48 |
46 |
ячмень |
67 |
65 |
45 |
43 |
|
пшеница |
66 |
68 |
49 |
51 |
|
2. Новопятигорское озеро |
овес |
81 |
78 |
82 |
69 |
ячмень |
86 |
85 |
82 |
69 |
|
пшеница |
83 |
81 |
85 |
72 |
|
|
овес |
45 |
43 |
43 |
39 |
ячмень |
47 |
46 |
41 |
38 |
|
пшеница |
48 |
49 |
43 |
39 |
|
4. Контроль - водопроводная вода |
овес |
100 |
100 |
100 |
100 |
ячмень |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
пшеница |
100 |
100 |
100 |
100 |
Токсическое действие пробы считается доказанным, если в эксперименте зафиксирован токсический эффект торможения роста проростков, а именно их корней на 50 % (Груздева, 2002). [9]
Из данных таблицы 1 видно, что наиболее благоприятной для роста и развития проростков тест-растений является проба № 2 – Новопятигорское озеро. Орловка. По степени роста и вегетативной мощности проростков можно сделать вывод о том, что в пробе № 1 (река Подкумок) наблюдается торможение роста корней проростков больше чем на 50 % по сравнению с контролем, следовательно, токсичность пробы № 1 высокая. В пробе № 3 (река Юца), наблюдается торможение роста и надземной части и корней проростков больше чем в пробе №1, поэтому токсичность пробы № 3 очень высокая.
2.4. Развитие проростков тест-растений при поливе их испытуемой водой
(осенний период).
№ пробы, место взятия пробы |
Тест –растение |
Наземная часть, % |
Корни, % |
||
Длина |
Масса |
Длина |
Масса |
||
1.Река Подкумок |
овес |
58 |
82 |
72 |
64 |
ячмень |
65 |
85 |
70 |
62 |
|
пшеница |
59 |
82 |
74 |
66 |
|
2. Новопятигор-ское озеро |
овес |
60 |
82 |
74 |
66 |
ячмень |
61 |
76 |
68 |
62 |
|
пшеница |
62 |
85 |
78 |
69 |
|
3. Река Юца |
овес |
38 |
23 |
23 |
21 |
ячмень |
40 |
26 |
30 |
26 |
|
пшеница |
43 |
35 |
35 |
29 |
|
4. Контроль - водопроводная вода |
овес |
100 |
100 |
100 |
100 |
ячмень |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
пшеница |
100 |
100 |
100 |
100 |
Из данных, представленных в таблице 2, видно, что в осенний период в большей степени наблюдается угнетение развития проростков в пробе № 3 – река Юца, торможение роста корней проростков в данной пробе более чем на 60% по сравнению с контролем. В пробах № 1 – река Подкумок и №2 – Новопятигорское озеро, также отмечается снижение в развитии вегетативных органов проростков.
В ходе последующей обработки материалов, по результатам, полученным в первом варианте исследований, были построены диаграммы биотестовых испытаний.
Рис. 1 Соотношение длины проростков тест-растений при поливе их испытуемой водой (весна, осень 2015г.)
Рис. 2 Соотношение массы проростков тест-растений при поливе их испытуемой водой (весна, осень 2015г.)
Таким образом, из результатов, полученных в 1 варианте, можно сделать выводы:
токсичность природных вод в весенний период наиболее высокая в реках Подкумок и Юца;
наиболее чувствительны к токсичности воды проростки овса.
2.5. Развитие проростков тест-растений (весенний период).
№ пробы, место взятия пробы |
Тест –растение |
Наземная часть, % |
Корни, % |
||
Длина |
Масса |
Длина |
Масса |
||
1.Река Подкумок |
Кресс-салат |
60 |
62 |
49 |
42 |
Редис |
70 |
67 |
53 |
47 |
|
2. Новопятигор-ское озеро |
Кресс-салат |
80 |
75 |
56 |
48 |
Редис |
82 |
78 |
58 |
50 |
|
3. Река Юца |
Кресс-салат |
45 |
43 |
32 |
26 |
Редис |
47 |
46 |
36 |
31 |
|
4. Контроль - водопроводная вода |
Кресс-салат |
100 |
100 |
100 |
100 |
Редис |
100 |
100 |
100 |
100 |
По изменению надземной массы в опытных пробах по сравнению с контролем можно судить о токсичности данной пробы воды. Сильное угнетение надземной части растений тест-растений, более 20% по сравнению с контролем, показывает высокую степень токсичности пробы воды (Голубкина, 2008). [9] Высокая токсичность наблюдается в пробе №3 – река Юца. У проростков наблюдается торможение развития надземной части на 53-55% больше чем в контрольной пробе. Пробы №1 – река Подкумок и №2 – Новопятигорское озеро также токсичны, но в меньшей степени.
2.6.Развитие проростков тест-растений (осенний период).
№ пробы, место взятия пробы |
Тест –растение |
Наземная часть, % |
Корни, % |
||
Длина |
Масса |
Длина |
Масса |
||
1.Река Подкумок |
Кресс-салат |
65 |
60 |
59 |
52 |
Редис |
78 |
72 |
60 |
53 |
|
2. Новопятигор-ское озеро |
Кресс-салат |
86 |
80 |
65 |
58 |
Редис |
90 |
84 |
67 |
62 |
|
3. Река Юца |
Кресс-салат |
48 |
41 |
40 |
31 |
Редис |
50 |
45 |
42 |
35 |
|
4. Контроль - водопроводная вода |
Кресс-салат |
100 |
100 |
100 |
100 |
Редис |
100 |
100 |
100 |
100 |
Из данных таблицы 4 видно, наиболее токсична проба №3 – река Юца. Токсична проба воды №1 – река Подкумок. Проба №2 – Новопятигорское озеро имеет очень слабую токсичность.
По результатам, полученным во 2 варианте исследований, были построены диаграммы биотестовых испытаний.
Рис. 3 Соотношение длины проростков испытуемой (весна, осень 2015г.)
Рис.4 Соотношение массы проростков испытуемой водой (весна, осень 2015г.)
По результатам исследований можно сделать выводы:
соотношение длины и массы проростков тест-растений зависит от токсичности природных вод, чем больше токсичных веществ в пробе воды, тем меньше длина и масса проростков тест-растений;
наибольшую чувствительность к токсинам проявляет растение кресс-салата.
токсичность природных вод выше в весенний период в пробах воды взятых из рек Подкумок и Юца;
менее токсична проба воды из Новопятигорского озера.
В результате проведённых исследований была освоена методика биотестирования токсичности природных вод, проведен анализ теоретических подходов в изучении данной темы и сделаны следующие выводы:
Выяснили, что токсичность природных вод водоемов г. Пятигорска изменяется по сезонам: в весенний период она больше, в осенний период токсичность уменьшается;
Установили, что развитие и рост проростков тест-растений напрямую зависят от степени токсичности природных вод, наибольшую чувствительность к токсинам проявляют растения кресс-салата и овса;
Определили, что при поливе проростков тест растений испытуемой водой в большей степени угнетается развитие корневой системы;
Опытным путем установили, что наибольшей токсичностью характеризуются пробы воды рек Юца и Подкумок, менее токсична вода из Новопятигорскаго озера.
Таким образом, гипотеза о возможности оценки с помощью методов биотестирования степени загрязнения природных вод нашла свое подтверждение. На данном этапе работы в результате проведенного эксперимента без специального дорогостоящего оборудования, приборов и реактивов были установлены уровни загрязнения воды г. Пятигорска.
Наша работа может иметь продолжение в следующем учебном году. Для устранения погрешностей результата, на базе лаборатории можно провести химический анализ воды и еще раз проанализировать ситуацию.
Данный метод анализа природных вод можно рекомендовать садоводам-любителям и всем интересующимся данной проблемой жителям нашего города.
Список литературы.
Вишнякова В.Ф. Экология Ставропольского края. – Ставрополь, 2000.
Голубкина Н.А. Лабораторный практикум по экологии.-М.,2008.
Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. – Киев; Наукова думка, 1973.
Груздева Л.П. биоиндикация качества природных вод. // Биология в школе. 2002, № 6 с. 10
Денисова С.И. Полевая практика по экологии. – Минск, 1999.
Кулеш В.Ф., В.В. Маврищев Практикум по экологии. Минск, 2007.
Лысенко Н.Л. Биоиндикация и биотестирование водных экосистем.// Биология в школе.1996, № 5 с.12
Никаноров А.М.,. Хоружая Т.А. Экология. – М., Приор, 2001.
Рамад Ф. Основы прикладной экологии. – Л.: Гидрометеоиздат, 1981.
Трифонова Т.А., Селиванова Н.В., Мищенко Н.В. Прикладная экология. М., Академический проект .,2007.
Савельева В.В. География Ставропольского края. – Ставрополь, 2003.
Степановских А.С. Охрана окружающей среды.- М.: ЮНИТИ-ДАНА, 2001.
Теоретические вопросы биотестирования. - Волгоград , 1983.
Фёдорова А.И., Никольская А.Н. Практикум по экологии и охране окружающей среды. – М., Владос, 2001.
Филенко О.Ф. Методы биотестирования качества водной среды. – М.: МГУ, 1989
Яблоков А.В. Экология России: состояние перспективы. 2005.
Приложение 1
Таблица 1
Основные характеристики методов оценки токсичности вод
Признак |
Химические методы |
Биологические методы |
|
Биоиндикация |
Биотестирование |
||
Тип индикации |
Индикация воздействия |
Индикация отклика |
Индикация воздействия |
Объект анализа |
Вода |
Водные сообщества |
Вода |
Цель анализа |
Измерение концентрации химических веществ |
Оценка состояния природных сообществ |
Интегральная оценка токсичности на тест-организмах |
Показатели токсичности |
Превышение установленных регламентов |
Негативные изменения в сообществах |
Развитие патологических (вплоть до гибели) изменений у тест-организмов |
Регламенты |
Предельно допустимые концентрации |
Не установлены |
Отсутствие острого и хронического токсического действия |
Метрологические характеристики |
Погрешность, сходимость, воспроизводимость |
Не установлены |
Сходимость, воспроизводимость |
Таблица 2
Область применения методов биотестирования токсичности водной среды
Объект биотестирования |
Цель биотестирования |
Тест-организм |
|
Химические вещества |
Рыбохозяйственное нормирование; контроль токсичности в международной торговле |
Гидробионты – представители основных трофических уровней водных экосистем. Стандартный набор тест – организмов |
|
Производственные, технологические и сточные воды (точечные источники загрязнения) |
Оценка эффективности очистки, выявление опасных компонентов, регламентация сброса, экологическая паспортизация предприятий |
Наборы биотестов |
|
Природные воды (неточечные источники загрязнения) |
Проверка соответствия качества воды установленным регламентам. Оценка токсикологического состояния водных объектов. Выявление зон экологического бедствия и чрезвычайных ситуаций |
Наборы биотестов |
Приложение 2
Фото№1. Проростки кресс-салата Фото№2. Проростки кресс-салата
(контроль) (опыт)
20