Азотфиксирующие бактерии рода Azotobacter из различных почв и их влияние на рост и развитие фасоли обыкновенной

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Трофимов А.А. 1

---

1МБОУ "Гимназия № 117"

Бозаджиев В.Ю. 1

---

1МБОУ "Гимназия № 117"

Работа в формате PDF

382.5 KB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Бактерии рода Azotobacter играют большую роль в жизни растений и повышения плодородия почвы, однако, в Ростовской области эта группа микроорганизмов не достаточно изучена. В этом и состоит основная проблема данного исследования.

Актуальность работы заключается в интересе к азотфиксирующим микроорганизмам, в частности к азотобактеру, который обусловлен необходимостью перехода от химизации сельского хозяйства к биогизации, что требует современных представлений о физиологическом состоянии, адаптационных возможностях и механизмах штаммов рода Azotobacter. Выделение новых почвенных штаммов позволит увеличить плодородие почвы и стимулировать рост растений. Также азотобактер применяют в медицине, пищевой промышленности. Выделение почвенных штаммов- азотфиксаторов очень важно в современном мире.

Цель исследования: выявитьштаммыазотофиксирующихбактерий родаAzotobacter изразличныхпочвРостовскойобласти и установить способность Azotobacter влиять на всхожесть и рост фасоли обыкновенной.

Задачи исследования:

-собрать образцы почв с различных участков;

-провестифизико-химическийанализ образцов почв;

-выделитьизпочвазотфиксирующиебактерии;

-провестимикроскопическоеисследование образцов;

-получить культуральную жидкость для обработки семян фасоли обыкновенной;

-оценить влияние обработки семян фасоли обыкновенной бактерией Azotobacter.

Объект исследования: бактерии рода Azotobacter —почвенные бактерии, фиксирующие свободный атмосферный азот.

Предмет исследования: методы повышения плодородности почв.

Гипотеза исследования: бактерияAzotobacter,выделеннаяизпочвыобладают микробиологическойактивностью на рост и развитие фасоли обыкновенной.

Новизна исследования:данная работа выполнена в гимназии впервые.Отмечено влияние Azotobacter на рост и развитие фасоли обыкновенной, что ранее не отмечалось в литературе.

Значение результатов исследования. Этаработаможетспособствоватьдостижению второй Цели устойчивого развития «Ликвидация голода, обеспечение продовольственной безопасности и улучшение питания и содействие устойчивому развитию сельского хозяйства», разработанных в 2015 году Генеральной ассамблеей ООН в качестве «плана достижения лучшего и более устойчивого будущего для всех».

Обзор литературы.

1. Роль азота в природе

АзотявляетсясоставляющейчастьюДНК,белков,АТФидругихважнейшихорганическихмолекул[1].Онявляетсямакроэлементом,егосодержаниевклеткеоценивается как 1,5-3,0% сухой массы [2]. Основной источник азотадля биосферы –атмосфера (азот составляет примерно 78% воздуха по объему), где он находится в видемолекулN₂,котораяиз-заналичиятрехковалентныхсвязейявляетсяинертной[3],поэтому живые организмы в основном не способны усваивать молекулярный азот [4]. Так,растения могут усваивать лишь ионы аммония и нитраты, а животные получают азоттолько из белков других организмов. Таким образом, наличие растворимых форм азота впочве является важным лимитирующим фактором для экосистемы. Людям необходимополучатьазотспищей,тоестьдляполноценногопитанияобязательносодержаниедостаточного количества азота в пищевой продукции, а значит, его растворимые формыдолжны в достаточном количестве содержаться в почвах, используемых для земледелия[5].

2. Связываниеазота

Существуют несколько способов перевода азота в растворимую форму – его фиксации(связывания):врезультатедействияфизическихсилприроды(напримермолний),промышленногосинтезаибиотическойазотфиксации(рис.1).Впервомслучаепроисходитвзаимодействиеатмосферногокислородаиазотаподвлияниемвысокихтемператур, возникающих во время грозовых разрядов. Промышленный синтез аммиака восновномведетсяспомощьюпроцессаГабера[5].Биогеннаяфиксацияазотаосуществляется прокариотическими организмами, которые могут быть как находится всимбиозесрастениями(Rhizobium),такибытьсвободноживущими(Clostridium,Azotobacter)(табл. 1).

Рис.1.Круговоротазота[5]

Таблица1.Количествоазота,фиксируемогоразличнымипутями (поданным1998г.)[6]

Так как действие физических сил природы непредсказуемо, этот процесс фиксации азотанельзя использовать для повышения плодородности почв. Промышленно фиксированныйазот используется для получения удобрений, которые затем вносятся в почву, однако этоможет привести к отрицательным последствиям: они могут накапливаться в почве и врастениях,делаяихнебезопаснымидляпотребления,ихприменениеможетвызватьэвтрофикациюводоемов[7].Такимобразом,дляобогащенияпочврастворимымиформами азота остается использовать биотический способ фиксации. Возможно внесениебактериальныхудобрений,содержащихазотофиксирующиебактерии(например,ризоторфина,нитрагинаиазотобактерина)[8].Однаковпочвахчастосодержатсяазотофиксаторыибезвмешательствачеловека.Вопросыизучениясоставаазотофиксирующихбактерий,ихжизнедеятельности,ееактивизации,полученияпрепаратов на основе выделенных высокопродуктивных штаммов поднимались в работахмикробиологов с момента открытия способности бактерий фиксировать молекулярныйазот в 1893 году С. Виноградским [9, 10, 11, 12]. Однако, с возникновением современныхметодовсеквенированиягеномов,появилисьновыеперспективыдляпоискавысокопродуктивных штаммов, изучения генетики процессов азотофиксации и, возможно,созданиягенномодифицированныхорганизмов,способныхосуществлятьмикробиологическую фиксацию азота в реакторах для получения связанных форм азотаили биосинтеза необходимых аминокислот для пищевой промышленности, минуя цепочкурастение-продуцент–консумент1-травоядноеживотное.Многообразиебактерийивариабельностьихгеномовоченьвысока,поэтомуоднойиззадач,стоящейпередсовременными исследователями является изучение максимально возможного количестваштаммов бактерий, а для этого их необходимо выделить из различных почв.

Наша работаявляется частью большого проекта, запущенного ИХБФМ СО РАН в рамках изученияазотофиксирующих бактерий Российской Федерации. Провести серьёзные микробиологические исследованияврамкахшкольногопроектанепредставляетсявозможным,поэтому оценка собранных образцов почвы будет произведена с использованием научных методов влабораториюИХБФМ СО РАНдлядальнейшегоизучения.

3. Бактерии рода Azotobacter

Бактерии рода Azotobacter относятся к свободноживущим азотфиксаторам почвы (ризобактериям) и способны, как и клубеньковые бактерии растений (ризобии), с по- мощью нитрогеназного комплекса фиксировать молекулярный азот воздуха, превращая его в ион аммония. Бактерии рода Azotobacter населяют экторизосферу (зона почвы с наружной стороны корня) и ризоплану (поверхность корневой системы) различных видов растений, используя экссудаты корневой системы для питания.

Экссудаты из корней растений - это жидкости, выделяемые через корни растений. Эти выделения влияют на ризосферу вокруг корней, подавляя вредные микробы и способствуя росту собственных и родственных растений. Корневая система растений может вырасти сложной из-за разнообразия видов и микроорганизмов, существующих в обычной почве.

В обмен растение получает азот в виде доступных для усвоения соединений, улучшается фосфорное питание растений благодаря растворению труднодоступных почвенных фосфатов в процессе жизнедеятельности ризобактерий, фитогормоны, вырабатываемые ризобактериями, стимулируют рост растений, бактерии рода Azotobacter подавляют развитие фитопатогенных грибов и бактерий.

Способность разных штаммов Azotobacter chroococcum Beijer. влиять на прорастание семян и развитие проростков различных видов растений изучена недостаточно. Хотя в настоящее время этому вопросу уделяется значительное внимание в связи с поиском эффективных штаммов этого вида с целью использования их для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур. Имеются сведения о том, что некоторые штаммы А. сhroococcum способны вступать в симбиотические отношения с пшеницей мягкой (Triticum aestivum L.).

Известно, что бактерии рода Azotobacter образуют ассоциации с пектинолитическими и целлюлозоразрушающими бактериями рода Bacillus, потребляя продукты разложения полимеров бациллами, снабжая их фиксированным азотом, что приводит к ускорению усвоения полимеров и стимуляции азотфиксации. В связи с этим при изучении способности А. сhroococcum непосредственно воздействовать на состояние растений более объективные данные можно получить в условиях эксперимента при культивировании растений на питательном растворе или торфе, поскольку таким образом можно вычленить взаимодействие в системе «растение – А. сhroococcum» в чистом виде, т. е. без участия других видов почвенных бактерий.

В связи с этим нами была оценена способность А. сhroococcum, выделенного из почвы сельскохозяйственных угодий Ростовской области (Россия), влиять на всхожесть семян и состояние проростков фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.).

4. Описание Azotobacter

Исследование проводилось на примере бактерий рода Azotobacter, который был выбраниз-за своей распространенности, изученности и простоты в культивировании.Это родграмотрицательных бактерий, обитающих преимущественно в слабокислых, нейтральныхи слабощелочных почвах (рост и азотфиксация возможны в диапазоне pH от 4,8 до 8,5,оптимально–7,0–7,5).Бактерииродаазотобактерявляютсясвободноживущимиазотофиксаторами, однако они способны жить в ассоциации с некоторыми растениями.Первым описанным видом этого рода являетсяAzotobacter chroococcum, был открыт в1901годуМартиномБейеринком.Всеговэтомродесодержатся6видов,наиболеераспространеныAzotobacterchroococcum(типовойвид),образующийколониибурого,почтичерногоцвета(рис.2),Azotobacteragilis,длякоторогохарактерныбесцветныеколонии,иAzotobactervinelandii,чьиколониифлуоресцирующейжелтовато-зеленойокраски.Клеткиотносительнокрупные(1-2мкмвдиаметре),какправилоимеютовальную форму, но возможен широкий полиморфизм от палочковидной до сферическойформы.Клеткимогутрасполагатьсяодиночно,парами,неправильнымископлениями,цепочками. Клетки образуют цисты, не образуют спор. В ранних культурах клетки имеютжгутики [13, 14].

Рис.2.КолонииAzotobacterchroococcum(собственнаяфотография,40х)

Бактерии рода Azotobacter относят к грамотрицательным бактериям. Окраска по Граму – метод окраски микроорганизмов, позволяющий дифференцироватьмикроорганизмы по строению клеточной стенки (рис. 6). Этот метод часто используетсядляклассификации бактерий [19].

Рис. 6. Схема строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательныхбактерий

5. Биохимияпроцесса

Фиксация азота – сложный энергозатратный процесс, который начинается при недостаткенитратовиаммиакаикатализируетсяферментомнитрогеназой.СуммарнаяреакциявосстановленияN₂ доNH₃ вклеткеописываетсятакимуравнением:

Этотпроцесспроходитвнесколькостадий:

Каквидноизуравненияреакции,дляеепротеканиянужнаэнергияввидеАТФиисточник электронов, то есть восстановитель. Они синтезируются в результате процессовброжения,дыханияилифотосинтеза.Восстановителемвэтойреакцииявляетсявосстановленный ферредоксин [15], который может иметь различное происхождение взависимостиоттиповпитанияорганизма,например,убактерийродаAzotobacter,являющихся аэробными хемотрофами, это происходит при окислении НАДФH до НАДФ⁺.Такимобразомпроцессфиксацииазотаможносхематичноотобразитьтак(рис. 3):

Рис.3.Схемафиксированияазота[15]

Азотфиксацияингибируетсямолекулярнымкислородом,поэтомуаэробные^{азотофиксаторыприобретаютадаптациидлязащитынитрогеназыотвлиянияО}2^.Этоможетбытьдыхательнаязащита,конформационнаязащита,морфологическаяилиповеденческая адаптация. Бактериям рода Азотобактер свойственна дыхательная защита(они обладают разветвленной дыхательной цепью) и морфологическая адаптация – онивыделяют слизь [16]. Возможно, что выделяемые ими пигменты тоже служат этой цели[14].

Материалыиметоды

ВкачествеобъектовдляисследованиявыбралиобразцыпочвнаразличныхучасткахБрянскойобласти,отличающихсяпоместорасположениюииспользованию.Былиотобраны20 образцовпочввследующихлокациях:

1. 6проб почв из трех районов Ростовской области (для удобства им были даны короткие названия,представленныевскобках) :

Район 1. г. Миллерово и его окрестности – 3 участка:

- ул. Кукушина – городская земля у дороги (Кукушина);

- ул. Маяковского, огород в городской черте (Маяковского);

- хутор Банникова-Алексеевский (пустырь на окраине поселка) (Пустырь).

Район 2. Окрестности села Большие Салы:

- садоводческое товарищество «Дружба» (огород в сельской местности) (Дружба);

- поле после уборки кукурузы у садов «Дружба» (Поле).

Район 3. Полисадник у здания гимназии № 117 в городе Ростове-на-Дону (урбанизированные земли) (Гимназия).

Методыисследования

Исследованиепочвы

Методикавзятияпроб

Для исключения влияния случайных факторов, отбор почв обычно осуществляетсяметодом конверта. Для этого выбирают 5 точек на местности так, что если мысленно ихсоединить, получается рисунок запечатанного конверта (рис. 4). Длина стороны конвертадолжна составлять от 2 до 5-10 м. Далее в местах отмеченных точек берут точечныепробы,которыезатемобъединяют [17].

Рис.4.Схемарасположенияточечныхпроб

Образец почвы помещаем в пакетсzip-lock.

В лаборатории разравниваемпочву, убираемкрупныевключения,высушиваем.

Исследованиемеханическогосоставапочвыиналичиякарбонатов

Дляопределениямеханическогосоставапочвыпочвусмешиваютсводойдополучения вязкой массы, из которой надо попробовать скатать шарик, затем растянуть еговжгутисоединитьвкольцо.Взависимостиоттипа почвы, прискатывании:

А)почванескатаетсявшарик –песчанаяпочва

Б)почванескатаетсявшарик,нослепитсявнепрочныешарики–супесчаная

Почва

В)почваобразуетнепрочныйшарик,которыйвжгутнераскатывается–легкосуглинистаяпочва

Г)почваобразуетсплошнойжгут,которыйразламываетсяприсоединениивкольцо– среднесуглинистаяпочва

Д)почваобразуетсоединениевкольцо–тяжелосуглинистаяпочва

Е)почваобразуетсплошнойжгут,которыйсоединяетсявкольцо–глинистая почва

Определение наличия карбонатов в почве:

С помощью пипетки нанести несколько капель соляной кислоты на почву .

Если в почве находится значительное количество карбонатов, то на срезе будет наблюдаться

вспенивание.

Карбонаты способны реагировать с соляной кислотой по следующей реакции:

CO₃^2-+ 2H⁺ = H₂O + CO₂↑

Определениекислотностисредыпочвеннойвытяжки

Заполнить половину объема пробирки типа «эппендорф» исследуемым образцомпочвы. Оставшийся свободный объем пробирки заполнить водой.Пробиркуплотнозакрыть крышкой. Перемешать содержимое пробирки, интенсивно встряхивая пробиркув течение 5 минут.Дождатьсяполногоосаждениявзвесипочвынаднопробирки.Опуститьиндикаторную бумагувпочвеннуювытяжку.

Определениесодержаниянитратоввпочвеннойвытяжке:

1. Навесахподготовитьнавескувлажнойпочвымассой30г;

2. Перенести навескупочвывколбуидобавьте100 мл воды;

3. Колбузакрытькрышкойиперемешатьеё содержимоевзбалтыванием;

4. Оставить содержимоеколбыприкомнатной температурена20-30минутдляперехода нитрат-ионовиз почвывраствор;

6. Отфильтроватьпочвуотпочвеннойвытяжкиспомощьюворонкисфильтром;

7. Погрузитьтест-полоскувполученнуюпочвеннуювытяжкуна2-3секунды(вводудолженпогружатьсякончиктест-полоскисутолщением);

8. Извлечьтест-полоскуиудалитеизбытокводыстряхивающимдвижением;

9. Положите тест-полоскунабелуюбумагуидождитесьпроявления окраски;

10. Оценитерезультаты

Посевинаблюдениезаростомколоний бактерийAzotobacter

ДляпосевапочвенныхкомочковиспользуетсясредаЭшби.

1)ЧашкуПетри,заполненнуюзастывшейсредой,разместитьнатрафарете,совместивкраячашкисконтуромтрафаретаинанести50почвенныхкомочков.Поместитьвтермостатпритемпературе24⁰С на3-4 дня.

Методикамикробиологическогоисследования навыявлениеAzotobacter

Отобратьпробуотколонийдлямикроскопическогоисследования:спомощьюзубочистки зачерпнуть небольшое количество биомассы, перенести на предметное стекло,размазав по центральной части. С помощью пипеткиПастера на предметное стекло вцентр площади, покрытой образцом, нанести каплю фуксина Циля. В тоже место, что ифуксинЦиля,спомощьюпипеткиПастера,нанестикаплютуши.Зубочисткойперемешать красители и биомассу, находящиеся на стекле, до равномерного тонкого слоягрязно-розовогоцвета. Препаратвысушитьна воздухе.

Изучениепочвенногодыхания

Подготовкапроб:

1. Подготовить 3 одинаковые емкости объемом 1 л с герметичнозакрывающейся крышкой.

2. Навесахподготовьтедвеодинаковыенавескипочвы100г.

3. Перенестинавескипочвывемкости№2и3;

4. Распределитьпочвуровнымслоемподнуемкостей;

5. Внестивкаждуюемкостьдлятитрованияпо10млраствораNaOH0,1М;

6. Поставить открытые емкости для титрования №2 и №3 с раствором NaOH наповерхностьпочвывсоответствующихемкостях№2 и№3;

7. Открытуюемкостьдлятитрования№1срастворомNaOHпоместитьнаднопустойемкости№1(контрольныйэксперимент);

8. Закрытьемкостикрышкойиоставьте насуткиприкомнатнойтемпературе.

Титрование:

Провести титрование 0,1 М раствором NaOH. Добавить в раствор 1 каплю растворафенолфталеина. Разместить емкость для титрования на белой бумаге и, считая количествокапельиперемешиваясодержимоеемкостивращательнымидвижениями,добавлятьвемкостьдлятитрованиясолянуюкислотудополногообесцвечиванияраствора.Зафиксировать количество капель соляной кислоты, которое потребовалось для полногообесцвечивания раствора. Рассчитать объем соляной кислоты, который потребовался длянейтрализациищелочипоформуле:

V_HCl=N_капель*V_капли,гдеN_капель–числокапель,котороепотребовалосьдлятитрования,V_капли– объем однойкапливмл;

Вычислитьколичествомольщелочи,содержащеесявемкостидлятитрованияпоформуле:

n(NaOH)=C_HCl*V_HCl=0,1*V_HCl,гдеV_HCl–объемсолянойкислотывлитрах,потраченныйнатитрование;

9. Аналогичнопровестититрование0,1МрастворомNaOHиземкостей№2и

№3ирассчитайте количествомольщелочи,содержащееся вних;

10. Рассчитатьсреднееколичествомольщелочивемкостях№2и№3поформуле:n(NaOH)_ср = (n(NaOH)₂ + n(NaOH)₃)/2

11. ВычислитьмассуCO₂,выделившегосяврезультатедыханияпочвыпоформуле: m (CO₂) = (n(NaOH)₁ – n(NaOH)_ср)*M(CO₂) где n(NaOH)1 – количество NaOH,содержащееся в контрольной емкости №1, n(NaOH)_ср – усредненное количество щелочи,содержащееся вемкостях №2 и3.

Исследованиелабораторнойвсхожестисемян

1. НавсюповерхностьдначашкиПетрисреднемслоемположитьвату,ватунакрытьфильтровальнойбумагой.

2. Нафильтровальнуюбумагувыложить20семянкультурыизалитьводой(контрольная чашка)

3. Нафильтровальнуюбумагувыложить20семянкультурыизалитьвзвесьюкультурыазотобактера.

4. Наблюдатьзапрорастаниемсемян.

Результаты и обсуждения

СогласноГОСТ17.4.4.02-84[22],почвыдляисследованиябылиотобраныметодомконверта.Дляисследованиябыливыбраны6образцовпочв, указанных выше.Таким образом, изучаемые образцы были отобраны с территорий, испытывающих разнуюантропогеннуюнагрузкуи сразной историей.

1.Изучениесвойствпочвы

Опыт1.Определениемеханическогосоставапочвы.

Для определения механического состава почвы сухая почва (примерно столоваяложка)помещаетсявладонь.

ПипеткойПастеракпочвеприливаетсяводаитщательноперемешиваетсядополучения«теста».

Из полученного «теста» скатываем шарик диаметром 2-3 см и пробуем растянутьеговжгут.Попластичностишарикаи жгута определяемтип почвы.

Результатопыта.

№образца	Местовзятияпробы	Прискатывании	Типпочвы
Образец№1	с/т «Дружба», садовый участок	Образует шнур, который при сгибании не разламывается, кольцо дает несколько трещин	Тяжелый суглинок
Образец№2	Поле после кукурузы	Образует шнур, который при сгибании не разламывается, кольцо дает несколько трещин	Тяжелый суглинок
Образец№3	Пустырь на окраине поселка	Образует шнур, который при сгибании не разламывается, кольцо дает несколько трещин	Тяжелый суглинок
Образец№4	Кукушина, городская земля у дороги	Образует шнур, который при сгибании не разламывается, кольцо дает несколько трещин	Тяжелый суглинок
Образец№5	Маяковского, огород в городской черте	Образует шнур, который при сгибании не разламывается, кольцо дает несколько трещин	Тяжелый суглинок
Образец№6	Гимназия № 117, палисадник, урбанизированная земля	Образует шнур, который при сгибании не разламывается, кольцо дает несколько трещин	Тяжелый суглинок

Опыт 2. Определение карбонатов в почве.

НаличиекарбонатоввпочвемыопределялиспомощьюHCl0,1М.

3 2 2↑

Если в почве находится значительное количество карбонатов, то при добавлении нескольких капель соляной кислоты на почве будет наблюдаться вспенивание. Карбонаты способны реагировать с соляной кислотой по следующей реакции: CO ² + 2H⁺ = H O + CO

Врезультатереакциивыделяетсяуглекислыйгаз,которыйиобуславливает вспенивание.

Результатопыта.

Во всех образцах почвы карбонаты не обнаружены.

Опыт3.Определениекислотностипочвы.

Половинуобъемапробиркитипа«эппендорф»заполняемпочвой,остальнойобъем

–дистиллированнойводой.

Плотно закрываем крышку и энергично встряхиваем пробирку в течении 5 минут.

Затем оставляем пробирку в вертикальном положении на 25 - 30 минут до полногоосаждениявзвеси почвынадно пробирки.

Опускаем индикаторную бумагу с универсальным индикаторомв почвеннуювытяжкуисравниваемполученноеокрашиваниесэталонной шкалой.

Результатопыта.

№образца	Местовзятияпробы	рНпочвы
Образец№1	с/т «Дружба», садовый участок	7,2
Образец№2	Поле после кукурузы	7,8
Образец№3	Пустырь на окраине поселка	7,8
Образец№4	Кукушина, городская земля у дороги	7,8
Образец№5	Маяковского, огород в городской черте	6,2
Образец№6	Гимназия № 117, полисадник, урбанизированная земля	7,2

Мывыяснили,что земля в огороде в городе Миллерово оказалась слабокислой.

Опыт4.Определениесодержаниянитратов.

Приготовление почвенной вытяжки: навеска влажной почвы массой 30 гпомещалась в колбу. Добавляется 100 мл дистиллированной воды. Колба закрываетсякрышкой, содержимое взбалтывается. Колба оставлялась на 30 минут. Затем фильтруемсодержимоеколбы спомощью воронкисфильтром.

Полученную вытяжку набирали в пипетку Пастера и по 1 капле наносили на тест-зоны тест-полосок определения качества воды по 14 параметрам «Test Strips».

По интенсивности изменения окрашивания тест-зон на тест-полоске судим о содержании анализируемых химических веществ.

Результатопыта.

№образца	Местовзятияпробы	содержание нитратов в почве
Образец№1	с/т «Дружба», садовый участок	250
Образец№2	Поле после кукурузы	100
Образец№3	Пустырь на окраине поселка	100
Образец№4	Кукушина, городская земля у дороги	100
Образец№5	Маяковского, огород в городской черте	50
Образец№6	Гимназия № 117, палисадник, урбанизированная земля	250

Высокое содержание нитратов в почве отмечено для огорода в садах «Дружба». Со слов владельца огорода, он использует минеральные удобрения.

Также высокое содержание нитратов отмечено в почве гимназии № 117, что можно объяснить общим комплексным загрязнением почвы в крупном городе.

Наименьшее содержание нитратов отмечено для огорода в городе Миллерово, где владельцы редко используют минеральные удобрения.

Опыт5.Определение органического углерода в почве.

Опыт проводился по методичке, предложенной в методичке «Охотники за микробами»

Результаты опыта

1 – с/т «Дружба» - 300 Мгр.

2 – поле после кукурузы возле с/т «Дружба» - 300 мГр

3 – х. Банниково-Александрово, пустырь на окраине – 300 мГр

4 – ул. Кукушина – 600 мГр

5 – ул. Маяковского – 300 мГр

6 – Гимназия № 117 – 1000 мГр

Установлено, что почвами с низким содержанием органического углерода (гумуса) являются почвы с огорода «Дружба», поля возле него, и огорода в городе Миллерово. Это можно объяснить полной уборкой растительных остатков осенью, что препятствует естественному восстановлению плодородия почвы.

Неожиданно низким оказалось содержание гумуса в почвах с пустыря х. Банниково-Алексеевский. Возможно это связано с частыми покосами травы на нем.

Высокое содержание органического углерода отмечено у дороги в городе Миллерово, что связано с нечастой уборкой там листового опада и декоративным покосом травы.

Высокое содержание органического углерода в почве с полисадника гимназии № 117 также связано с достаточным количеством мертвой растительной органики, которая повышает плодородие почвы.

Опыт5.Определение «Дыхания почвы»

«Дыхание почвы» - процесс образования СО₂ в результате разложения иокисления органического вещества почвенными микроорганизмами и корнямирастений, что является одним из способовбиотестирования состояния почвы.Измерениедыханияпочвымыпроводиливсоответствиисметодическимирекомендациямикнабору«Охотникзамикробами».Сущностьметода:определениеколичества СО₂,которое выделяет почва.

Длякаждогообразцапочвымыподготовилипо3одинаковыебанкиобъёмом0,5лсгерметичнозакрывающейсякрышкой,промаркировалиихномерами. Подготовили одинаковые навески для всех образцов (100г сухойпочвы).Перенеслинавескипочвывбанки№2и№3,распределилипочвуровнымслоем подну.

Подготовили и пронумеровали по 3 ёмкости для титрования (баночки дляанализов).СпомощьюпипеткиМораперенесливкаждуюёмкостьдлятитрования10млраствораNaOH0,1М,поставилиоткрытыеёмкости№2и№3срастворомNaOHнаповерхностьпочвывсоответствующихбанках0,5л№2и №3.Открытуюёмкостьдлятитрования№1поместилинаднопустойбанки №1(контрольныйэксперимент).

Закрылибанкикрышкойипоставилиприкомнатнойтемпературевтёмныйшкаф насутки.

Черезсуткипровелититрованиерастворомсолянойкислоты0,1М,сдобавлением в раствор NaOH фенолфталеина (раствор приобрёл малиновуюокраску).Титровалидополногообесцвечиванияраствора.ОбъёмHCl,пошедшийнатитрование,занесли втаблицу2.

Результаты опыта

Как мы видим, наиболее «живой» оказалась почва с поля и из садового участка «Дружба», что говорит о высоком содержании микроорганизмов в этих почвах.

Почвы из района города Миллерово, менее богаты микроорганизмами, что связано с недостатками в агротехнике: внесение большого количества минеральных удобрений, осенняя уборка растительных остатков, что препятствует образованию гумуса и ведет с общему снижению её плодородия.

Наиболее «бедной» оказалась почва из палисадника Гимназии № 117, что можно объяснить общими свойствами урбанизированных почв больших городов.

2.Микробиологические исследования

Культивирование азотфиксирующих бактерий проводили традиционным методом обрастания комочков на среде Эшби.

Приготовление вспомогательного раствора

В мерную колбу на 1л налили дистиллированной воды 400мл, высыпали в колбу с водой соли NaCl, K₂SO₄, MgSO₄*7H₂O и K₂HPO₄ и перемешали до полного отсутствия осадка на дне колбы. Довели объём раствора до отметки 1л.

Приготовление среды Эшби.

На весах подготовили навески: СaCO₃-1г, Агара-3г, глюкозы-4г. В химический стакан налили 200мл вспомогательного раствора, перенесли туда все навески. Смесь перемешали до состояния однородной взвеси. Смесь вскипятили на плите, охладили до 50⁰С и заполнили ею чашки Петри.

Увлажнённую почву с помощью одноразовых зубочисток комочками диаметром 3-4 мм по 50 комочков перенесли в каждую чашку с питательной средой. Работу проводили возле горящих спиртовок. Чашки Петри накрыли крышками и убрали в шкаф при комнатной температуре.

Провели наблюдение за ростом колоний на 3, 7 и 10 день после посева.

Микроскопическое исследование бактерий проводили с окрашиванием фуксином Циля и тушью, при увеличении х400 с водной иммерсией.

Протёрли предметные стёкла спиртовой салфеткой для удаления загрязнений и жирового слоя. Прокалили микробиологические петли над спиртовкой, нанесли на стёкла небольшое количество биомассы, с помощью пипетки Пастера добавили по капельке фуксина Циля и туши, перемешали красители и биомассу до равномерного тонкого слоя грязно - розового цвета. Получившийся препарат высушили на воздухе. На препарат нанесли каплю воды и изучили с помощью микроскопа при увеличении х400.

Определили по атласу бактерий наиболее распространенный и хорошо изученный Azotobacter chroococcum (обитает в почвах всех типов, кроме кислых) образует колонии с бурым, почти чёрным пигментом. Клетки бактерий рода Azotobacter относительно крупные (1–2 мкм в диаметре) и, имеют овальную форму. На микроскопических препаратах клетки располагаются одиночно, парами, неправильными скоплениями. Результаты эксперимента сфотографировали (х800); зафиксировали данные наблюдений.

Исследование способности бактерий к накоплению полимерных соединений проводили с окрашиванием суданом чёрным.

На предметных стёклах маркером нарисовали круги, перевернули стёкла, с помощью пипетки Пастера нанесли в центр каждого круга по капле дистиллированной воды, микробиологической петлёй перенесли небольшое количество биомассы с 4 колоний каждого образца почвы, разболтали колонии в воде. Капли подсушили на воздухе до полного исчезновения влаги, зафиксировали препарат с помощью пламени спиртовки. После остывания стекла на каждое пятно нанесли каплю судана чёрного и оставили на 15 минут при комнатной температуре. После высыхания промыли пятна изопропанолом. Проанализировали интенсивность окраски пятен, если после промывки стекла бактерии окрасились в голубой цвет, значит они способны активно накапливать полимеров в своих клетках.

Результаты выявленияспособностибактерийкнакоплениюполимерных соединений

Проведя исследование на поиск колоний Азотобактера, способных разрушать полимеры мы установили, что положительный результат показывают колоний 2- поле у садов «Дружба» и 3-пустырь в хуторе Банниково-Алексеевский.

3.Изучение влияния А. сhroococcum на прорастание, рост и развитие растений

БактерииродаAzotobacterнаселяютэкторизосферу (зона почвы с наружной стороныкорня) и ризоплану (поверхность корневойсистемы) различных видов небобовых растений [22], используя экссудаты корневой системы для питания. В обмен растение получаетазот в виде доступных для усвоения соединений, улучшается фосфорное питание растенийблагодарярастворениютруднодоступныхпочвенныхфосфатоввпроцессежизнедеятельности ризобактерий, фитогормоны,вырабатываемыеризобактериями,стимулируют рост растений, бактерии родаAzotobacterподавляютразвитиефитопатогенныхгрибовибактерий(Феоктистоваидр.,2016).СпособностьразныхштаммовAzotobacterchroococcumBeijer.влиятьнапрорастание семян и развитие проростковразличныхвидоврастенийизученанедостаточно(Кириченкоидр.,2010).Хотявнастоящее время этому вопросу уделяется значительное внимание в связи с поиском эффективныхштаммовэтоговидасцельюиспользования их для повышения продуктивностисельскохозяйственных культур (Кириченко,Коць, 2011). Имеются сведения о том, чтонекоторые штаммы А. сhroococcum способны вступать в симбиотические отношения спшеницей мягкой (Triticum aestivum L.) (Кириченко, 2016).

По плану нашего эксперимента с AzotobacterchroococcumBeijer был заложен опыт по прорастанию и развитию семян фасоли обыкновенной (сорт красный).

Для наблюдения за влиянием азотобактера на скорость прорастания и развития растений, мы взяли семена фасоли.

Предварительно до эксперимента сухие семена фасоли поместили в кусочек марли, смочили водой и оставили для набухания на одни сутки.

Набухшие семена фасоли посадили по 10 штук в три горшка:

- контроль: 10 набухших семян без обработки;

- вариант 1: 10 набухших семян обработаны культурой Азотобактер;

- вариант 2: 10 набухших семян обработаны культурой Азотобактер + в землю внесена культура Азотобактер с водой.

Для контроля несколько семян фасоли оставлены без обработки. Прочие обработаны полученным азотобактером.

Почва, смесь торфа, песка и керамзитовой крошки, была куплена в магазине для садоводов и предназначена для рассады. В каждый горшок помещено по 100 грамм почвы.

В процессе эксперимента земля регулярно увлажнялась путем полива 25 мЛ воды.

В процессе эксперимента проводилось по два наблюдения в одно и тоже время (5.00 и 17.00 часов).

На 21 день после начала эксперимента, когда растения вступили в фазу 3 листа, проведено сравнение экспериментальных и контрольных образцов.

Результаты опыта

Результаты опыта показывают, что Вариант 1 показал наименьшую всхожесть семян (50%). Наибольшая всхожесть семян отмечена в Варианте 2 (80%).

Растения в Варианте 2 показали наивысшие показатели по общей длине растений и общей биомассе (урожайность), по длине и биомассе корней, по биомассе листьев.

Растения в Варианте 1 показали наивысшие результаты по показателям: средняя длина стебля и среднее количество листьев. Однако, растения в Варианте 2 по этим показателям продемонстрировали близкие, хотя и более низкие значения.

Общим выводом по данному опыту можно считать следующий:

1. Результаты опыта показали, что AzotobacterchroococcumBeijer. оказывает влияние и на бобовые растения, что уточняет ранее известные данные (Ерофеева, 2019).

2. Результаты опыта (Вариант 1-всхожесть 50 %) подтвердили, что AzotobacterchroococcumBeijer может оказывать ингибирующее влияние на прорастание семян фасоли обыкновенной. Однако, однозначно это пока нельзя утверждать, так-так имеются противоречия с результатом опыта в Варианте 2 (всхожесть 80 %). Возможно, в Варианте 2 имеет место влияние AzotobacterchroococcumBeijer, который был внесен в почву с поливом.

3. Результаты опыта подтвердили, что AzotobacterchroococcumBeijer оказывает стимулирующее влияние на развитие проростков фасоли обыкновенной.

4. Результаты опыта показали, что внесение AzotobacterchroococcumBeijer в почву при посадке фасоли обыкновенной ведет к увеличению всхожести на 10 % и общей урожайности на 141,45 % по сравнению с Контролем.

С целью проверки достоверности результата опыта было проведено микробиологическое исследование на наличие микробов AzotobacterchroococcumBeijer. в чашки Петри было весеяно по 20 комочков почвы по стандартной методике «Охотники за микробами». На четвертый день было проведено изучение образцов почвы. Результаты опыта следующие:

Контроль - обрастаний AzotobacterchroococcumBeijer. – 0, комочки посеянные плесенью – 8;

1 вариант - обрастаний AzotobacterchroococcumBeijer. – 2 (10%), комочки посеянные плесенью – 2;

2 вариант - обрастаний AzotobacterchroococcumBeijer. – 20 (100%), комочки посеянные плесенью – 0;

Общим выводом по данному опыту можно считать следующий: для достижения повышения урожайности фасоли обыкновенной необходимо вносить культуру AzotobacterchroococcumBeijer непосредственно в почву.

Выводы

1. собранные образцы почвы относятся к тяжело суглинистым безкарбонатным;

2. земля в огороде в городе Миллерово оказалась слабокислой;

3. высокое содержание нитратов в почве отмечено для огорода в садах «Дружба» и палисадника Гимназии № 117;

4. что почвами с низким содержанием органического углерода (гумуса) являются почвы с огорода «Дружба», поля возле него, и огорода в городе Миллерово;

5. наиболее «живой» оказалась почва с поля и из садового участка «Дружба», что говорит о высоком содержании микроорганизмов в этих почвах;

6. все почвенные образцы содержали Azotobacter chroococcum;

7. колоний Azotobacter chroococcum № 2- поле у садов «Дружба» и № 3-пустырь в хуторе Банниково-Алексеевский показали способность к накоплению полимерных соединений;

8. AzotobacterchroococcumBeijer. оказывает влияние и на бобовые растения, что уточняет ранее известные данные;

9. результаты опыта подтвердили, что AzotobacterchroococcumBeijer может оказывать ингибирующее влияние на прорастание семян фасоли обыкновенной. Однако, однозначно это пока нельзя утверждать, так-так имеются противоречия с результатом опыта в Варианте 2 (всхожесть 80 %). Возможно, в Варианте 2 имеет место влияние AzotobacterchroococcumBeijer, который был внесен в почву с поливом;

10. результаты опыта подтвердили, что AzotobacterchroococcumBeijer оказывает стимулирующее влияние на развитие проростков фасоли обыкновенной;

11. результаты опыта показали, что внесение AzotobacterchroococcumBeijer в почву при посадке фасоли обыкновенной ведет к увеличению всхожести на 10 % и общей урожайности на 141,45 % по сравнению с Контролем.

Гипотеза исследования подтверждена.

Список литературы

1. Чернова Н. М. , Былова А. М. Общая экология. : Дрофа, 2004. – 416 с.

2. Биология. 10-11 классы: учеб. для общеобразоват. организаций: углубл. уровень: в 2. ч., ч. 1/ [П. М. Бородин, Л. В. Высоцкая, Г. М. Дымшиц и др.] под ред. В. К. Шумного и Г. М. Дымшица. – М. : Просвещение, 2014. – 303 с.

3. Азот [Электронный ресурс]: Википедия. Свободная энциклопедия. – URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/азот (дата обращения: 10.01.2021).

4. Азотфиксация [Электронный ресурс]: Википедия. Свободная энциклопедия. – URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Азотфиксация (дата обращения: 10.01.2021).

5. Биология: в 3-х т. Т. 1.: Пер. с англ./ [Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор] под ред. Р. Сопера. – М.: Мир, 1993. – 368 с., ил.

6. The Microbial World: The Nitrogen cycle and Nitrogen fixation. Produced by Jim Deacon [Электронный ресурс]: http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/nitrogen.htm (дата обращения: 10.01.2020)

7. Азотистые удобрения [Электронный ресурс]: Википедия. Свободная энциклопедия. – URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Азотистые_удобрения (дата обращения: 10.01.2021).

8. Бактериальные удобрения [Электронный ресурс]: Википедия. Свободная энциклопедия. – URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Бактериальные_удобрения (дата обращения: 10.01.2021).

9. Виноградский С.Н. Об усвоении свободного азота атмосферы микробами // Архив биологических наук. 1895. Т. 3. Вып. 4.

10. Красильников М.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения, Изд. АН СССР, М. 1958, 463 с.

11. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв, М. ИКЦ, «Академкнига», 2002, 282 с.

12. Логинов О.Н. Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Наука, 2005, - 166 с.

13. Методические рекомендации и инструкции по применению набора «Охотник за микробами»

14. Азотобактер [Электронный ресурс]: Википедия. Свободная энциклопедия. – URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Азотобактер (дата обращения: 10.01.2021).

15. Я. Денисов. Одиссея азота. [Электронный ресурс]: Биомолекула. – URL https://biomolecula.ru/articles/odisseia-azota (дата обращения: 10.01.2021).

16. Лекции по курсу «Физиология микроорганизмов». Лектор доцент Лысак В.В. http://www.bio.bsu.by/microbio/kursy_physiology_of_microorganisms.html Тема 4 – фиксация молекулярного азота

17. Отбор почв [Электронный ресурс]: Аналитический центр МГУ им. М. В. Ломоносова – URL: https://eco.chem.msu.ru/proto/help-info.pdf (дата обращения: 10.01.2021).

18. ГОСТ 17.4.4.02-84. Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб дляхимического,бактериологического,гельминтологическогоанализа.[Электронныйресурс]: Электронный фонд правовой и нормативно-технической документации – URL:http://docs.cntd.ru/document/gost-17-4-4-02-84(дата обращения:10.01.2021).

19. Кириченко Е. В. Биологическая активность ризосферной почвы пшеницы яровой в ассоциации с бактериями Azotobacter chroococcum Т79, модифицированными N-ацетил-D-глюкозамином // Микробиология и биотехнология. 2016. № 3. С. 30–42.

20. Кириченко Е. В., Коць С. Я. Использование Аzotobacter chroococcum для создания комплексных биологических препаратов // Биотехнология. 2011. Т. 4. № 3. С. 74–81.

21. Кириченко Е., Титова Л., Коць С. Эффективность бактеризации семян пшеницы яровой новым штаммом Аzotobacter chroococcumT76 // Stiinta Agricola. 2010. № 1. С. 21–24.

22. Ерофеева Е. А., Речкин А. И., Савинов А. Б. Всхожесть семян и состояние проростков пшеницы Triticum aestivum в условиях воздействия на них суспензии клеток Azotobacter chroococcum // Принципы экологии. 2019. Т. 8. № 2. С. 4–11.