XX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Особенности реорганизации кардиомиоцитов (изменение морфометрических показателей и интегральной оптической плотности ядер кардиомиоцитов) в постгипотермическом периоде
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Проблема холодовой травмы на данный момент является весьма актуальной и социально значимой, что обусловлено ее высокой долей в структуре причин смерти. Ежегодно от холодовой травмы в мире погибает более 30 000 человек [5].
Доля смерти от холодовой травмы в структуре причин насильственной смерти В России составляет около 5,5–7,0%, а в некоторым регионам Сибирского федерального округа достигает уровня не менее 11% [6]. Высокая доля холодовой травмы в структуре причин смерти связана с особенностями климата (Россия – страна с относительно холодным климатом, это с вязано с тем, что к заполярным территориям относится около 64% всей площади страны), высоким уровнем этилизации социально - неадаптированных слоев обществе, а также индивидуальными особенностями организма (снижение устойчивости к низким температурам, снижение общей резистентности организма и др.) [5, 9].
В настоящее время изучению вопроса воздействия низких температур на организм человека и животных посвящено большое количество исследований. Основное место в этих исследованиях отводится диагностике и дифференциальной диагностике общего переохлаждения при сочетании этого вида смерти с различными интоксикациями, заболеваниями и иными состояниями. Однако несмотря на большое количество опубликованных на данный момент работ изучение процесса танатогенеза в результате воздействия низких температур от переохлаждения остается сложным и малоизученным процессом.
Основным методом диагностики смерти от переохлаждения является морфологический метод. На данный момент известно огромное количество морфологических изменений (как макро- так и микроморфологического характера) которые можно обнаружить при изучении случаев смерти от низких температур, но большинство из них низкоспецифичны, а следовательно в полной мере использоваться не могут [3, 4].
Действие холодового фактора на организм человека и животных вызывает различные функционально – морфологические изменения в тканях. Данные изменения зависят от огромного количества факторов внешней и внутренней среды и в некоторых случаях носят фатальный характер. Особым условием для сохранения жизнедеятельности при действии низких температур является повышение кровоснабжения тканей и органов, которое в первую очередь зависит от функциональной активности миокарда.
На данный момент выяснено, что именно адекватное кровоснабжение органов и тканей, которое может осуществляться только при длительной адекватной функциональной активности миокарда, является одним из важных условий выживания в условиях пониженных температур. В этом случае в сердечно –сосудистой системе развиваются определенные функциональные изменения в виде следующих стадий: компенсации и декомпенсации. Стадия компенсации (развитие тахикардии, увеличения уровня систолического и диастолического артериального давления, увеличение сердечного выброса, повышение периферического сопротивления). Стадия декомпенсации (брадикардия, снижение уровня артериального давления, уменьшение сердечного выброса, возникновение нарушений ритма. Чаще всего смерть наступает в результате фибрилляции желудочков сердца или развития прогрессирующей брадикардии переходящей в асистолию [1]. Факт прямой связи между возникающими вышеперечисленными изменениями и действием на организм низких температур был доказан T. Tveita лишь в 1994 году [10].
Впервые системно и последовательно к подробному изучению микроскопических изменений возникающих в миокарде подошли Асмолова Н.Д., Ривенсон М.С. [2]. Они смогли выделить следующие микроскопические изменения которые возникают в паренхиме, строме и микроциркуляторном русле миокарда:
- Изменения в кардиомиоцитах: набухание (отек) мышечных волокон с явлениями миолиза: неравномерное просветление цитоплазмы, образование оптических пустот, утрата исчерченности; плотное прилегание мышечных волокон друг к другу, нечеткость их границ, образование мышечных пластов; возникновение явлений кариопикноза или, напротив, набухания и просветления, ядра мышечных волокон пикнотичные, гиперхромные или набухшие, светлые, с огрубевшим или расплавленным хроматином; многие ядра деформированы;
- Нарушения микроциркуляции, в большинстве случаев возникающие именно в местах отека кардиомиоцитов: выраженное неравномерное наполнение кровью артерий, утолщение стенок артерий за счет отека и набухания, выраженное полнокровие капилляров и венул, сегрегация крови на компоненты;
- Изменения стромы: сдавление соединительнотканной стромы миокарда, возникновения явления стертости ее границ, базофиилии; огрубение и базофилия периваскулярной стромы; развитие в ядрах ядра соединительнотканных клеток гиперхромии, кариопикноза, штрихов;
- Образование полос пересокращения [2].
Необходимо отметить, что большинство исследователей описывали лишь единичные, отдельные морфологические изменения возникающие в миокарде при гипотермии, не выявляя последовательность их появления и взаимосвязь.
Таким образом патоморфологическая картина сердечной мышцы при гипотермии описана, но диагностическое и дифференциально - диагностическое значение ее элементов, а также их связь с вариантами танатогенеза неясны.
Цель исследования: проанализировать динамику патоморфологических изменений периметра и площади, интегральной оптической плотности ядер кардиомиоцитов крыс породы Вистар на 7 день после воздействия однократной глубокой иммерсионной гипотермии.
Задачи исследования:
- изучить методику моделирования однократной иммерсионной глубокой гипотермии;
- изучить методику подготовки гистологических препаратов;
- изучить методику покраски гистологических препаратов гематоксилин – эозином;
- провести измерение периметра и площади площади ядер кардиомиоцитов крыс до и через 7 дней воздействия однократной глубокой иммерсионной гипотермии.
Основная часть
Объекты исследования
В качестве объекта исследования использовали 10 белых половозрелых крыс линии Wistar обоего пола. Линии животных были выведены и выращены в виварии НИИ Цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Животных, доставленных из центрального вивария, до начала экспериментов содержали на карантине в условиях кафедрального вивария в течение 1-2 недель. За этот срок ослабленных особей выбраковывали, а здоровые животные адаптировались к новым условиям вивария. Содержание животных отвечало международным рекомендациям проведения медико-биологических исследований с использованием животных по правилам GPL. Корм и воду подавали 1 раз в сутки между 10 и 11 часами. На протяжении всего периода эксперимента производилось взвешивание животных, осуществлялось измерение ректальной температуры.
Методика моделирования однократной иммерсионной глубокой гипотермии
Гипотермия моделировалась путем погружения животных, находящихся в клетках, в резервуары с водой на глубину 4,5 см при температуре воды +5 °С, воздуха +7 °С. До достижения ректальная температура у животных +20... +23 °С, в этом случае считали что достигнута гипотермия глубокой степени. Время экперимента в среднем составляло 40 ± 8 минут. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом через 7 дней после гипотермии. В качестве контрольных выступали 5 животных, помещаемых в индивидуальных клетках в воду температурой +30 °С на время, соответствовавшее времени нахождения опытной группы. При вскрытии животных органы выделяли единым комплексом.
Для гистологического исследования кусочки ткани сердца в течение 24–48 часов фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после чего обрабатывали в автомате с последующей заливкой в парафин в станции парафиновой заливки. Срезы толщиной 5–7 мкм изготавливали на роторном микротоме. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином. Микрофотографию проводили при помощи микроскопа Leica DM 750 E200 (Германия) с цифровой видеокамерой Leica EC3 (Германия) при увеличении х400. Морфометрию ядер кардиомиоцитов осуществляли в морфометрической программе «ВидеоТест-Морфология 5.2» (Рисунок 1, 2). Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета статистических программ и пакета статистического анализа программы MS Excel 2010.
Р
исунок 1. Подготовленный для морфометрии лист с выбранными ядрами кардиомиоцитов контрольной группы в программе «ВидеоТест-Морфология 5.2».
Рисунок 2. Подготовленный для морфометрии лист с выбранными ядрами кардиомиоцитов через 7 дней после гипотермии программе «ВидеоТест-Морфология 5.2».
Результаты исследований и обсуждение
Морфологический анализ структуры кардиомиоцитов крыс контрольной группы позволяет выявить следующие особенности: большинство кардиомиоцитов одноядерные, ядра небольших размеров, овоидной вытянутой формы (Рисунок 3). При морфометрическом исследовании периметр ядер кардиомиоцитов составил 31,5 ± 0,8 мкм, средняя площадь ядер кардиомиоцитов составила 51,2 ± 1,9 мкм2.
Р
исунок 3. Морфология ядер кардиомиоцитов: в контрольной группе. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400.
А
нализ структуры мышечной ткани через 7 дней полсе после воздействия однократной глубокой иммерсионной гипотермии позволяет сделать следующие выводы: мышечные волокна набухшие с явлениями миолиза, неравномерное просветление цитоплазмы, образование оптических пустот, утрата исчерченности. Ядра мышечных волокон набухшие, светлые, многие ядра деформированы. При морфометрическом исследовании периметр ядер кардиомиоцитов 36,8 ± 0,8 мкм, средняя площадь ядер кардиомиоцитов составила 69,6 ± 2,8 мкм2.
Рисунок 4. Морфология ядер кардиомиоцитов через 7 дней после глубокой гипотермии. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400.
Кариометрические измерения позволили сделать вывод, что средний периметр ядер кардиомиоцитов через 7 дней после однократной иммерсионной глубокой гипотермии увеличился на 16%, средняя площадь ядер кардиомиоцитов через 7 дней после однократной иммерсионной глубокой гипотермии увеличилась на 35 % (Рисунок 5, 6).
Интегральная оптическая плотность ядер кардиомиоцитов составляла в среднем 588 тысяч Белл. Через 7 дней после глубокой гипотермии интегральная оптическая плотность ядер кардиомиоцитов повысилась до 721 тысячи Белл.
Рисунок 5. Изменение среднего пероиметра ядер кардиомиоцитов крыс через 7 дней после глубокой гипотермии.
Рисунок 6. Изменение средней площади ядер кардиомиоцитов крыс через 7 дней после глубокой гипотермии.
Заключение
На современном этапе развития медицинских знаний в области термических поражений большое значение уделяется изучению морфологических изменений происходящих ядерном аппарате клеток. Однако на данный момент описанные морфологические изменения возникающие в ядрах кардиомиоцитов при гипотермии достаточно скудны.
Результаты проведенного исследования во многом совпадают с результатами исследований проведенных Асмоловой Н.Д., Ривенсоном М.С. и подтверждают факт тотального повреждения ядерного аппарата сердечной мышцы. Кариометрические измерения позволили сделать вывод, что средний периметр ядер кардиомиоцитов через 7 дней после однократной иммерсионной глубокой гипотермии увеличился на 16%, средняя площадь ядер кардиомиоцитов через 7 дней после однократной иммерсионной глубокой гипотермии увеличилась на 35 %.
Данные исследования подтверждают важность и практикоориентированность дальнейшего изучения морфологических изменений происходящих в ядрах кардиомиоцитов.
Необходимо отметить, что на данный момент патоморфологическая картина сердечной мышцы при гипотермии описана, но диагностическое и дифференциально - диагностическое значение ее элементов, а также их связь с вариантами танатогенеза неясны. Накопленные знания позволяют сделать вывод о том, что специфических признаков встречающихся во всех 100% случаев смерти от гипотермии не существует. Любой признак, характерный для гипотермии, хотя бы в единичных случаях встречается и при других причинах смерти.
Таким образом, необходимо систематическое исследование патоморфологических проявлений смертельной холодовой травмы в миокарде. Для этого следует использовать точные, стандартизированные, четко определенные описания каждого вида повреждений, полуколичественные и количественные характеристики выраженности патоморфологических признаков при различных причинах смерти, сравнительный анализ выявленных патологических изменений, и максимально формализовать полученные результаты, приведя их в соответствие с законами логики. На этой основе будет возможно получение четкого пошагового алгоритма диагностики, удобного для практики и пригодного для разработки компьютерных программ, автоматизирующих диагностику.
Список использованной литературы
-
Алябьев Ф.В. Закономерности морфологических изменений надпочечников при острой алкогольной интоксикации и общем переохлаждении организма: автореферат дис. ... доктора медицинских наук: 03.00.25, 14.00.24 / Алябьев Федор Валерьевич. –Новосибирск, 2008. – 41 с.
-
Асмолова Н.Д. Микроскопические изменения миокарда при смерти от действия низкой температуры / Н.Д. Асмолова, М.С. Ривенсон // Судебно-медицинская экспертиза. – 1982. –№ 4. – С. 28.
-
Витер В.И. Общее переохлаждение организма. Посмертное промерзание трупа: практическое пособие / В.И. Витер, В.В. Пудовкин, В.В. Юрасов [и др.]. –М., 2013. – 96 с.
-
Витер В.И. Смерть от действия низкой температуры / В.И. Витер, А.А. Халиков // Судебная медицина в лекциях. –Уфа, 2003. –Стр. 159-163.
-
Власенко А.В. Переохлаждение –клиническая проблема / А.В. Власенко, Д.А. Шестаков, М.М. Воднева, Е.С. Воеводина // Клиническая анестезиология и реаниматология. – 2006. –Т. 3, № 3. – С. 2-12.
-
Коротун В.Н. Холодовая травма и алкогольное опьянение / В.Н. Коротун // Проблемы экспертизы в медицине. – 2007. –№ 28-4. – С. 31-33.
-
Плющева Т.В. К патогенезу пятен Вишневского при смерти от переохлаждения / Т.В. Плющева, В.И. Алисиевич // Судебно-медицинская
-
Danzl, D.F. Accidental hypothermia / D.F. Danzl, R.S. Pozos // N. Engl. J. Med. – 1994. – Vol. 331. – P. 1756-60.
-
Tveita T. Experimental hypothermia: effects of core cooling and rewarming on hemodynamics, coronary blood flow, and myocardial metabolism in dogs / T. Tveita, E. Mortensen, O. Hevrøy, H. Refsum, K. Ytrehus // AnesthAnalg. - 1994. – Vol. 79. – №2. – P. 212-218.