XXI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И АКТИВНОСТИ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ ПРИ РАЗЛИЧНИХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Любченко А.И. 1Тюрина А.С. 1

---

1МБУДО "ЦДТ" Сорочинского городского округа Оренбургской области

Медуха О.А. 1

---

1МБУДО "ЦДТ" Сорочинского городского округа Оренбургской области

Работа в формате PDF

1.6 MB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Изучение распределения и активности азотфиксирующих бактерий в почвах при различных экологических условиях

Поскольку азотфиксация является одним из наиболее значимых микробиологических процессов, в результате которого происходит восстановление азота в доступную для организмов форму, то поиск штаммов азотфиксаторов является очень актуальным.

Среди свободноживущих азотфиксирующих бактерий, микроорганизмы, принадлежащие к роду Azotobacter, играют значительную роль в усвоение молекулярного азота наряду со связанными его формами, к тому же способны синтезировать широкий спектр биологически активных веществ (витамины группы В, фитогормоны) и фунгициды (Мишке И.В., 1988).

Вопросы изучения состава азотофиксирующих бактерий, их жизнедеятельности, ее активизации, получения препаратов на основе выделенных высокопродуктивных штаммов поднимались в работах микробиологов с момента открытия способности бактерий фиксировать молекулярный азот в 1893 году С. Виноградским. Одной из задач, стоящей перед современными исследователями является изучение максимально возможного количества штаммов бактерий, а для этого их необходимо выделить из различных почв. Наша работа является частью большого проекта в рамках исследовательской программы «Всероссийский атлас почвенных микроорганизмов, как основа для поиска новых противомикробных продуцентов и ферментов с уникальными

свойствами». С учетом широкого распространения азотфиксирующих микроорганизмов и их важной роли в поддержании и стимуляции роста растений особый интерес представляет возможность, в рамках проекта «Всероссийский атлас почвенных микроорганизмов», попробовать отыскать интересные с научной точки зрения виды азотфиксирующих бактерий и в нашей местности.

Собранные нами 30 образцов почвы зарегистрированы в электронной базе данных, отправлены для дальнейших исследований в Институт химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН).

Образцы выделенных нами микробиологических культур так же отправлены для дальнейших исследований в Институт химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН).

Работа изложена на 45 страницах компьютерного текста, она содержит 2 таблицы и 11 рисунков. Результаты этого исследования могут быть использованы для установления возможности практического использования изученных штаммов бактерий.

СОДЕРЖАНИЕ

ВСТУПЛЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

   1. Механический состав почв 7

   2. Общая характеристика азотфиксирующих бактерий 9

   3. Характеристика бактерий рода Azotobacter 10

   4. Практическое значение бактерий рода Azotobacter 11

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 12

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 13

ВЫВОД 24

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 25

ПРИЛОЖЕНИЯ 26

1. Исследования механического состава почвы 26

2. Определение наличия карбонатов в почве 27

3. Определение кислотности среды почвенной вытяжки 28

4. Изучение почвенного дыхания 28

5. Содержание органических веществ 32

6. Посев и наблюдение за ростом азотфиксирующих бактерий 33

7. Микроскопическое исследование образцов 35

8. Исследование бактерий к накоплению полимерных соединений 37

ВСТУПЛЕНИЕ

С конца ХIХ века и до сегодняшнего времени представители азотфиксирующих бактерий являются объектом научных исследований, так как вопросы изучения состава азотофиксирующих бактерий, их жизнедеятельности, ее активизации, получения препаратов на основе выделенных высокопродуктивных штаммов поднимались в работах микробиологов с момента открытия способности бактерий фиксировать молекулярный азот.

Бактрии рода Azotobacter способны к продукции широкого спектра биологически активных веществ: фитогормоны (ауксины, гиббереллины, цитокинины), витамины группы В, противогрибковые антибиотики. Данная сторона физиологической активности азотобактера является определяющей в формировании взаимоотношений с почвенными микроорганизмами и высшими растениями.

Бактрии рода Azotobacter с начала 20 века используются в качестве инокулянтов семенного материала, что эффективно влияет на физиологические и морфологические параметры выращиваемых растений (Ерофеева etal, 2019). В нашей стране и за рубежом бактериальные удобрения на основе этих бактерий активно используются в числе методов и технологий органического земледелия. (WaniS.A. etal, 2016; Romero-PerdomoF., 2017).

С учетом широкого распространения азотфиксирующих микроорганизмов и их важной роли в поддержании и стимуляции роста растений особый интерес представляет возможность, в рамках проекта «Всероссийский атлас почвенных микроорганизмов», попробовать отыскать интересные с научной точки зрения виды азотфиксирующих бактерий и в нашей местности.

Во время полевой практики по сбору образцов почв возникло предположение, что азотфиксирующие бактерии обязательно присутствуют в заболоченных почвах и они в этих условиях наиболее активны.

Гипотеза: штаммы, выделенные из различных почв, обладают разной микробиологической активностью, наиболее активны в заболоченных почвах.

Цель: выделить, описать и сравнить колонии азотфиксирующих бактерий из почв с различными экологическими условиями.

Задачи:

1) выбрать участки почв с различными экологическими условиями;

2) собрать образцы почв;

3) проанализировать механический состав почв;

4) определить наличие карбонатов в почвах и кислотность среды почвенной вытяжки;

5) выделить из почв культуры азотфиксирующих бактерий и описать их;

6) сравнить распределение и активность азотфиксирующих бактерий в почвах с различными экологическими условиями.

 Объект исследования - бактерии рода Azotobacter, выделенные из почв окрестностей города Сорочинска Оренбургской области.

Предмет исследования - распределение и активность азотфиксирующих бактерий в почвах при различных экологических условиях.

Методы исследования: исследование механического состава почвы и наличие карбонатов, определение кислотности среды почвенной вытяжки, изучение почвенного дыхания, определение количества органических веществ в почве, посев и контроль процесса роста колоний азотфиксирующих бактерий, микроскопическое исследование образцов, исследование способности бактерий к накоплению полимерных соединений.

Научная новизна полученных данных: впервые были получены и проанализированы бактерии рода Azotobacter, выделенных из различных проб почв окрестностей города Сорочинска Оренбургской области.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

   1. Механический состав почв.

Механический состав почвы определяется как процентное содержание в них механических элементов. Зависит он прежде всего от породы, из которой образована почва, а также от ряда процессов, повлиявших на ее формирование.

Для изучения фракций профессором Н. А. Качинским была разработана классификация, подразумевающая деление почвы на несколько видов. Они бывают:

• песчаные;

• супесчаные;

• суглинистые;

• глинистые.

Все они различаются между собой свойствами, а также разным восприятием к возможности что-либо вырастить на конкретном участке земляного покрова.

Рисунок 1. Механический состав почв.

Гранулометрический состав земли напрямую связан с ее свойствами, так как в значительной мере влияет на агрономические характеристики. Песчаные и супесчаные почвы самые легкие, не имеют большого количества влажности, а также имеют хорошую воздухопроницаемость, легко восприимчивы к нагреванию. Любые полезные, питательные вещества из такой почвы сразу же исчезают, а органические превращаются в минеральные частицы. Следовательно, благодаря гранулометрическому анализу известно, что для данного вида покрова необходимо использовать больше органических удобрений и намного меньше минеральных, чтобы не навредить ее структуре.

Глинистые и суглинистые почвы бывают тяжелыми и умеренно тяжелыми. Умеренно тяжелые почвы имеют главное отличие от тяжелых – обладают наиболее выгодными физическими свойствами: отличной воздухопроницаемостью, влагопроницаемостью, легко поддаются культивированию. Еще одной отличительной чертой является образование гумуса из переработанных органических остатков. В отличие от предшественников у тяжелых грунтов не такие хорошие физические свойства. К примеру, они способны связывать молекулы воды, но не имеют достаточной воздухопроницаемости. Влага в них удерживается, но зачастую не доходит до растений, которые в связи с этим практически не растут в такой почве. А также недостатком является образование трещин, появляющихся после испарения влаги и высыхания.

Следовательно, гранулометрический состав в большей степени описывает плодородие почвы. От него зависят все жизненно важные процессы, происходящие в земле.

Песчаные почвы считаются легкими по своему строению, физическим свойства. По внешнему виду и структуре они отличаются повышенной рыхлостью, сыпучестью, отличной влагопроницаемостью.

Плюсом использования такой почвы является способность к быстрому нагреву, аэрации. Тем не менее она очень быстро охлаждается, имеет риск быстрого пересыхания, практически не удерживает минеральных веществ. Любые полезные и питательные вещества смываются с поверхности, попадая в более глубокие грунтовые слои. Таким образом, без надлежащей микрофлоры растения в таких условиях попросту не приживаются.

Супесчаная почва является еще одним легким, согласно механическому составу, грунтом. По физическим свойствам она очень близка к песчаному грунту. Отличием является повышенное число примеси глиняных крупиц.

Достоинством такого грунта является хорошая способность к сдерживанию полезных микроэлементов, а также различных органических веществ. А также супесчаная почва легко прогревается, обладая способностью на протяжении долгого времени сохранять тепло. Влагу такая почва практически не пропускает, следовательно, медленнее поддается высыханию, имеет хорошую воздухопроницаемость.

Наиболее тяжелой по своим механическим свойствам считается глинистая почва. Как правило, она сложно поддается различным манипуляциям, практически не пропускает воздух. Такая почва, в отличие от многих других, характеризуется наиболее низкой температурой, в связи с чем выращивание растений становится особенно затруднительным.

Суглинистая почва считается наиболее выгодной для различных дачных культур. Она лучше всех поддается разным видам обработки, обладает наивысшим процентом питательных элементов, имеет хорошую влаго- и воздухопроницаемость. А также данный вид земляного покрова не просто способен сохранять нужное количество влаги, но и может равномерно распределять ее по всему периметру, сохраняя при этом грунтовое тепло.

1.2. Значение для растений

Почва влияет на ускоренный рост растений, так как поставляет им влагу, а также азот, прочие минеральные и органические компоненты. Поэтому считается, что абсолютно все, что, так или иначе, оказывает влияние на ее поступление, передвижение, усвоение, имеет прямое воздействие и на растения.

Земля, любые культуры, выращиваемые на ней, находятся в непрерывной взаимосвязи между собой. К примеру, наилучшим вариантом почвы для лесных зон считается подзолистая почва. Для роста и жизнедеятельности лесных деревьев, а также других лесных культур необходимо соблюдение следующих требований:

• наличие достаточного места среди грунтовых слоев;

• достаточное количество питательных веществ;

• поступление необходимого количества кислорода;

• достаточное поступление воды.

Большинство почв относятся к труднообрабатываемым для удобрений и прочих манипуляций, необходимых для плодородия, в связи с чем и растения на них растут либо очень медленно, либо вовсе не приживаются. К примеру, ель предпочитает, чтобы грунт обладал хорошей влагой и воздухопроницаемостью, имел должное количество питательных органических веществ, минеральных комплексов. А также почва должна обладать хорошим дренажем, чтобы избежать застоя талой или грунтовой жидкости.

Таким образом, правильное изучение разновидностей почвы, свойств каждой из них способны повлиять на выращивание различных культур, растений. Стоит учитывать особенности территориального климата, не забывать о возможностях или недостатках почвы.

1.3 Общая характеристика азотфиксирующих бактерий.

Азотфиксация — это процесс переведения молекулярного азота из атмосферы (N2) в восстановленную растворимую форму. Растворимые соединения азота доступны для усваивания растениями, а почва, насыщенная такими соединениями, считается более плодородной. Содержание и соотношение растворимых форм азота в почве постоянно изменяются в результате их усвоения растениями, сбором урожая, а также вследствие эрозии, вымывания и денитрификации. Описанные процессы относят соединения азота к одному из главных и дефицитных элементов питания естественных и сельскохозяйственных экосистем, а азотфиксаторы играют важную роль в круговороте азота в природе и биосфере в целом.

Рисунок 2. Круговорот азота в природе

Азотфиксацию способны осуществлять прокариоты, тогда как у эукариот отсутствуют гены, ответственные за данный процесс. Наиболее известные

азотфиксирующие симбиотические бактерии – Rhizobium sp. – используются в производстве биологических удобрений для бобовых растений. Между бобовыми культурами и азотфиксирующими бактериями возникает симбиоз, следствием которого является увеличение содержания на посевной площади

высококачественного легкоусвояемого белка.

Бактерии рода азотобактер являются свободноживущими азотофиксаторами

1.4 Характеристика бактерий рода Azotobacter.

Azotobacter - род грамотрицательных бактерий, обитающих преимущественно в слабокислых, нейтральных и слабощелочных почвах (рост и азотфиксация возможны в диапазоне pH от 4,8 до 8,5, оптимально – 7,0 – 7,5). Бактерии рода азотобактер являются свободноживущими азотофиксаторами, однако они способны жить в ассоциации с некоторыми растениями. Первым описанным видом этого рода является Azotobacter chroococcum, был открыт в 1901 году Мартином Бейеринком. Всего в этом роде содержатся 6 видов, наиболее распространены Azotobacter chroococcum (типовой вид), образующий колонии бурого, почти черного цвета, Azotobacter agilis, для которого характерны бесцветные колонии, и Azotobacter vinelandii, чьи колонии флуоресцирующей желтовато-зеленой окраски. Клетки относительно крупные (1-2 мкм в диаметре), как правило имеют овальную форму, но возможен широкий полиморфизм от палочковидной до сферической формы. Клетки могут располагаться одиночно, парами, неправильными скоплениями, цепочками.

Рисунок 3.

Внешний вид колоний на 7-8 день после посева

1.5 Практическое значение бактерий рода Azotobacter.

Бактрии рода Azotobacter способны к продукции широкого спектра биологически активных веществ: фитогормоны (ауксины, гиббереллины, цитокинины), витамины группы В, противогрибковые антибиотики. Данная сторона физиологической активности азотобактера является определяющей в формировании взаимоотношений с почвенными микроорганизмами и высшими растениями.

Бактрии рода Azotobacter с начала 20 века используются в качестве инокулянтов семенного материала, что эффективно влияет на физиологические и морфологические параметры выращиваемых растений (Ерофеева etal, 2019). В нашей стране и за рубежом бактериальные удобрения на основе этих бактерий активно используются в числе методов и технологий органического земледелия. (WaniS.A. etal, 2016; Romero-PerdomoF., 2017).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование механического состава почвы и наличие карбонатов, определение кислотности среды почвенной вытяжки, изучение почвенного дыхания, определение количества органических веществ в почве, посев и контроль процесса роста колоний азотфиксирующих бактерий, микроскопическое исследование образцов, исследование способности бактерий к накоплению полимерных соединений, подготовка образцов к дальнейшим исследованием. (Методы описаны в приложениях 1-7)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования проводились в апреле – мае 2023 года. Сбор образцов почв проводился в окрестностях города в местах с разными экологическими условиями, а именно на открытой местности возле старого русла реки, в заболоченной местности, возле родника, над родником и на возвышенной открытой местности.

Старое русло реки Родник

Заболоченная местность

Холм

Было взято 10 проб почв в трех повторностях. Первичные исследования приведены в таблице №2:

Таблица №2

Особенности колоний Azotobacter

Количество колоний, выросших на чашках Петри различное.

Нет обрастаний на среде Эшби возле комочков почвы, взятых с возвышенной открытой местности (холме) на глубине 40 см. Это может быть связано с низкой увлажненностью почвы и выпасом скота на этой территории.

Почва, взятая с глубины 20 см этой же местности, дала на 13 день дала всего 6,7% обрастания, колонии бесцветные. Для Azotobacter agilis характерны бесцветные колонии. Это тоже может быть связано с низкой увлажненностью почвы и выпасом скота на этой территории.

Наибольшее количество обрастаний – 95% в 5 метрах от болота глубина 20 см и 91,5% над родником глубина 40 см, колонии бесцветные (Azotobacter agilis).

Много колоний образовалось возле комочков почвы, взятой вдоль болота (88,7%, колонии бесцветные и темные), и возле родника 88,9%(колонии бесцветные и темные).

То есть, в почве, где много влаги встречается Azotobacter agilis, Azotobacter vinelandii и Azotobacter chroococcum, и они наиболее активны. Хотя последний, как правило, в кислых почвах не обитает.

Желтые колонии Azotobacter vinelandii мы наблюдали на почве, взятой возле старого русла реки на глубине 20 см и в 5-и метрах от болота на глубине 20 см и 40 см.

Возвышенная открытая местность (холм), глубина 40 см:

нет обрастаний

Возвышенная открытая местность (холм), глубина 20 см: 6,7% обрастания, колонии бесцветные (Azotobacter agilis).

Это может быть связано с низкой увлажненностью почвы и выпасом скота на этой территории.

Над родником: колонии бесцветные

Azotobacteragilis

Вдоль болота: колонии бесцветные и темные

Azotobacteragilisи Azotobacterchroococcum

В 5-и метрах от болота: колонии бесцветные и желтые

Azotobacteragilis, Azotobactervinelandii

Возле родника: колонии бесцветные и темные

Azotobacteragilis и Azotobacterchroococcum

То есть, в почве, где много влаги встречается Azotobacter agilis, Azotobacter vinelandii и Azotobacter chroococcum , и они наиболее активны. Хотя последний, как правило, в кислых почвах не обитает.

Желтые колонии Azotobacter vinelandii мы наблюдали:

Возле старого русла реки на глубине 20 см

В 5-и метрах от болота на глубине 20 см и 40 см

Не способными к накоплению полимерных соединений оказались колонии пробы почвы, взятой из открытой местности старого русла реки на глубине 40 см.

При микроскопическом исследовании образцов после окрашивания фуксином Циля и тушью, клетки

Azotobacter розового цвета, чаще сферической формы, расположены одиночно, парами и неправильными скоплениями. Встречаются покоящиеся формы – цисты.

То есть, наша гипотеза, что штаммы, выделенные из различных почв, обладают разной микробиологической активностью, наиболее активны в заболоченных почвах, подтвердилась. Азотобактер является организмом, предъявляющим высокие требования к влажности почвы. Большая влаголюбивость азотобактера отмечается во многих исследованиях (Мишустин Е.Н., Шильникова В.К., 1968; Мишустин Е.Н., 1975). Это делает понятным зависимость во многих случаях динамики численности азотобактера в почве от ее влажности. Глубина проникновения азотобактера в почву также определяется в значительной степени обеспеченностью почвы влагой (Мишустин Е.Н., Шильникова В.К., 1968; Колешко О.И., 1981)

В исследуемых нами 29 образцах почвы присутствует Azotobacter, который может иметь биотехнологический потенциал и найти практическое применение после проведения дополнительных исследований.

Собранные нами 30 образцов почвы зарегистрированы в электронной базе данных, отправлены для дальнейших исследований в Институт химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН).

Образцы выделенных нами микробиологических культур так же отправлены для дальнейших исследований в Институт химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН).

ВЫВОД

1. Собраны образцы почв с 10 участков в трех повторностях с различными экологическими условиями;

2. механический состав почв: легкосуглинистые, среднесуглинистые, тяжелосуглинистые и супесчаные;

3. карбонаты в почвах отсутствуют, кислотность среды почвенной вытяжки 3-4 рН;

4. количество колоний, выросших на чашках Петри различное;

5. нет обрастаний на среде Эшби возле комочков почвы, взятых с возвышенной открытой местности (холме) на глубине 40 см. Это может быть связано с низкой увлажненностью почвы и выпасом скота на этой территории;

6. в исследуемых нами 29 образцах почвы присутствует Azotobacter;

7. колонии в основном бесцветные, но имеются желтые и темные;

8. наибольшее количество обрастаний в почве, где много влаги: вблизи родника и болота;

9. клетки Azotobacter розового цвета, чаще сферической формы, расположены одиночно, парами и неправильными скоплениями. Встречаются покоящиеся формы – цисты;

10. распределение и активность азотфиксирующих бактерий в почвах зависит от экологических условий. Azotobacterнаиболее активен во влажной почве.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Определитель бактерий Берджи, 1997

2. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. «Биологическая фиксация атмосферного азота», 1968;

3. Мишустин Е.Н. «Ассоциации почвенных микроорганизмов», 1975;

4. Колешко О. И. «Экология микроорганизмов почвы : лаб. Практикум», 

1981;

5. Дарзниек Ю.О.«Условия жизнедеятельности азотобактера в почвах Мургабского оазиса под хлопчатником», 1982

6. Качинский Н.А. «Структура почвы» Москва: МГУ, 1963. — 101 с.

7. WaniS.A. etal, 2016; Romero-PerdomoF., 2017.

Приложения

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Приложение 1

Исследования механического состава почвы.

Для определения механического состава высушенной почвы насыпали 1 столовую ложку в ладонь. С помощью пипетки Пастера к почве приливали воду и тщательно перемешивать воду с почвой до получения как можно более вязкого «теста». Из полученного «теста» скатывали шарик диаметром 2-3 см и попробовали растянуть его в жгут. Результаты соотносили с данными таблицы 1 и делали вывод о механическом составе исследуемой почвы.

Таблица 1. Механический состав почвы

Приложение 2

Определение наличия карбонатов в почве.

1. В плоскую стеклянную емкость положили небольшое количество почвенного образца.

2. Набрали из флакона с 10 % HCl кислоту в пипетку Пастера;

3. С помощью пипетки нанесли несколько капель кислоты на почву

Е сли в почве находится значительное количество карбонатов, то на поверхности образца будет наблюдаться «вскипание» (похоже на вспенивание: выделение пузырьков на поверхности почвы). Карбонаты способны реагировать с соляной кислотой по следующей реакции: CO3^2-+ 2H+ = H2O + CO2

В результате реакции выделяется углекислый газ, который и обуславливает «вскипание».

Приложение 3

Определение кислотности среды почвенной вытяжки.

1. Заполнили треть объема пробирки типа «эппендорф» исследуемым образцом почвы;

2. Оставшийся свободный объем пробирки заполнили водой;

3. Пробирку плотно закрыли крышкой;

4. Перемешали содержимое пробирки, интенсивно встряхивая пробирку в течение 1 минуты;

5. Дождались полного осаждения взвеси почвы на дно пробирки;

6. Опустили индикаторную бумагу в почвенную вытяжку;

7. Сравнили окрашивание индикаторной бумаги со шкалой, приведенной на Рисунке 5 и зафиксировали приблизительное значение pH для исследуемой вытяжки в лабораторном журнале (сразу после обмакивания, не дожидаясь высыхания).

Рисунок 5.

Окрашивание индикаторной бумаги при различных значениях pH раствора

Приложение 4

Изучение почвенного дыхания.

«Дыхание почвы» - процесс образования СО2 в результате разложения и

окисления органического вещества почвенными микроорганизмами и корнями растений. Использовали Абсорбционный метод по Шаркову 1984г.

1) Подготовили 3 одинаковые емкости объемом 0,5 или 1 л с герметично

закрывающейся крышкой;

2) Промаркировали емкости номерами 1, 2 и 3 с помощью перманентного

маркера;

3) Взвесили емкости и зафиксировали их массу в лабораторном журнале;

4) На весах подготовили две одинаковые навески почвы: для

влажной почвы масса навески должна составить 150 г, для сухой –

100 г;

5) Перенесли навески почвы в емкости №2 и №3;

6) Распределили почву ровным слоем по дну емкостей;

7) Подготовили и пронумеровали с помощью перманентного маркера 3 емкости для титрования;

8) С помощью пипетки Пастера на 5 мл перенесли в каждую емкость для

титрования по 10 мл раствора NaOH 0,1 М;

9) Поставили открытые емкости для титрования №2 и №3 с раствором NaOH на поверхность почвы в соответствующих емкостях на 0,5-1 л №2 и №3

(Рисунок 6);

Рисунок 6. Исследование почвенного дыхания

10) Открытую емкость для титрования №1 с раствором NaOH поместили на дно пустой емкости на 0,5-1 л (емкость №1, контрольный эксперимент);

11) Закрыли емкости крышкой и оставили на сутки при комнатной температуре.

Титрование:

12) Извлекли вторую пипетку Пастера на 5 мл из упаковки и подписали на её верхней части «HCl»;

13) Открыли капельницу, извлекли носик-дозатор и перенесли в неё с

помощью пипетки Пастера 15 мл раствора соляной кислоты 0,1 M;

14) Вставили носик-дозатор в капельницу;

15) Извлекли из емкости №1 емкость с раствором NaOH 0,1 М;

16) Добавили в раствор 1 каплю раствора фенолфталеина;

Раствор NaOH приобрел малиновую окраску.

17) Разместили емкость для титрования на белой бумаге и, считая количество

капель и перемешивая содержимое емкости вращательными движениями,

добавляли в емкость для титрования соляную кислоту из капельницы до

полного обесцвечивания раствора;

18) Зафиксировали количество капель соляной кислоты, которое потребовалось для полного обесцвечивания раствора (Рисунок 7);

Рисунок 7.

Окрашивание раствора до титрования (справа) и в момент завершения титрования.

19) Рассчитали объем соляной кислоты, который потребовался для

нейтрализации щелочи по формуле:

VHCl = Nкапель*Vкапли, где Nкапель – число капель, которое потребовалось для титрования, Vкапли – объем одной капли в мл; Vкапли = 0,04 мл.

20) Вычислили количество моль щелочи, содержащееся в емкости для

титрования по формуле:

n(NaOH) = CHCl*VHCl = 0,1*VHCl, где VHCl – объем соляной кислоты в

миллилитрах, потраченный на титрование (рассчитан в п. 19);

21) Аналогично провели титрование растворов NaOH 0,1 из емкостей №2 и

№3 и рассчитали количество моль щелочи, содержащееся в них;

22) Рассчитали среднее количество моль щелочи в емкостях №2 и №3 по

формуле: n(NaOH)ср = (n(NaOH)2 + n(NaOH)3)/2

23) Сравнили количество моль щелочи в емкости №1 со средним количеством моль щелочи в емкостях №2 и №3;

Количество моль щелочи в емкостях №2 и №3 должно быть меньше, чем в

емкости №1, поскольку часть щелочи прореагировала с CO2 по реакции:

2NaOH + CO2= Na2CO3 + H2O

24) Вычислили массу CO2, выделившегося в результате дыхания почвы по

формуле: m(CO2) = (n(NaOH)1 – n(NaOH)ср)*M(CO2) где n(NaOH)1 –

количество NaOH, содержащееся в контрольной емкости №1, n(NaOH)ср –

усредненное количество щелочи, содержащееся в емкостях №2 и 3,

M(CO2) = 44 г/моль – молярная масса CO2.

25) Данные привести к мг СО2 на 100 гр влажной почвы. Когда мы получили по формуле объём СО2 в мг из навески почвы, которую брали для

инкубирования, далее пересчитали пропорцией, например из 150 гр

почвы выделилось 5 мг СО2.

Составляем пропорцию:

150 гр - 5 мг

100 гр - х

х=3,33

В базу данных вписываем значение: 3,33 мг/100 гр почвы.

Приложение 5

Содержание органических веществ.

Накопление органических веществ один из важнейших процессов при

почвообразовании. Содержание органических веществ одна из важнейших

характеристик плодородия почв.

Приготовление растворов соды:

1) Для приготовления 2% раствора соды взвесили 2 г соды,

пересыпали навеску в емкость и залили 100 мл воды, перемешали.

2) Для приготовления 5% раствора соды взвесили 5 г соды,

пересыпали навеску в емкость из и залили 100 мл воды, перемешали.

3) Нагрели полученные растворы до 50 градусов (нагревать можно на водяной бане или вскипятить чайник, налить воду в емкость, подождать пока вода остынет до 90 градусов и поместить емкости с растворами в эту воду до нагревания).

Определение содержания органических веществ в почве:

1) В стеклянные флаконы с белыми крышками взвесили 1 г сухой почвы;

2) Навеску почвы залили 10 мл раствора горячей соды, закрыли крышку,

взболтали;

3) Оставили флаконы с почвой и раствором соды на 24 часа при комнатной

температуре: в первые 12 часов флаконы перемешивали 3 раза;

4) Через 24 часа перелили небольшую часть полученного раствора из флакона в крышку от этого флакона;

5) Сравнили растворы в крышечках флаконов со шкалой (Рисунок 8).

Рисунок 8

Шкала для оценки содержания углерода в почве, единицы

измерения- количество мг углерода на кг почвы (мгС/кг почвы)*

Приложение 6

Посев и наблюдение за ростом азотфиксирующих бактерий.

Вспомогательный раствор солей готовили один раз и использовали для создания сред в течение всего исследования.

1) В мерную колбу объемом 1 литр налели 300-400 мл воды;

2) Высыпали в колбу с водой всё содержимое флаконов с NaCl, K2SO4,

MgSO4*7H2O и К2HPO4 и перемешали смесь;

3) Довели объем раствора до отметки 1 литр и проконтролировали, что все

соли полностью растворились (об этом свидетельствует отсутствие

осадка на дне колбы);

Для исследования роста колоний на одном образце почвы следует поставить

параллельных эксперимента в 3-х чашках Петри. На каждую чашку Петри

потребуется 20 мл среды Эшби.

Приготовление среды Эшби (200 мл):

1) На весах подготовили навески:

1а) 1 г CaCO3;

1б) 3 г Агара;

1в) 4 г глюкозы;

2) В химический стакан налили 200 мл вспомогательного раствора;

3) В стакан с раствором перенесли навески CaCO3, агара и глюкозы;

4) Смесь в стакане перемешали до состояния однородной взвеси;

5) Смесь вскипятили на в микроволновой печи до максимального

растворения компонентов;

6) Смесь охладили до 50-60С и заполнили ей чашки Петри;

Подготовка почвы для анализа:

1) Образцы почвы высушили, убрали крупные остатки растительности,

камни, мусор;

2) Перенесли 3 грамма почвы в пустую чашку Петри;

3) К почве с помощью пипетки Пастера по каплям добавили

дистиллированную воду до получения пастообразной массы.

Посев:

1) Из увлажненной почвы отделили 40-50 комочком диаметром 3-4 мм;

2) Чашку Петри, заполненную застывшей средой, разместить на трафарете,

совместив края чашки с контуром трафарета;

3) В чашке Петри в узлах трафарета разместили подготовленные комочки

земли так, как показано на Рисунке 9

Рисунок 9.

Схема расположения комочков земли в чашке Петри

4) Чашки Петри накрыли крышками и оставили на 3-4 дня при комнатной

температуре.

Приложение 7

Микроскопическое исследование образцов.

1) В чашках Петри, засеянных 6-7 дней назад, выбрали несколько колоний

(«обрастаний») с разной окраской;

2) В лабораторном журнале схематично отобразили чашку Петри с

трафаретом внутри;

3) Небольшое количество биомассы перенесли на предметное стекло;

4) Краем чистого предметного стекла размазали биомассу. Посушили препарат пару минут на воздухе (или можно зафиксировать препарат проведя 2-3 раза над огнем спиртовки);

5) На схеме в лабораторном журнале отобразили место, в котором вы взяли исследуемый образец. Образцу присвоили номер и зафиксировали цвет колонии;

6) С помощью пипетки Пастера на предметное стекло в центр площади,

покрытой образцом, нанесли каплю фуксина Циля, оставили

окрашиваться на 1 минуту;

7) На край стекла, с помощью пипетки Пастера, нанесли каплю туши;

8) Зубочисткой провели тонкую дорожку из капли с тушью до фуксина

Циля, таким образом добавляя второй краситель. Перемешали

красители и биомассу, находящиеся на стекле, до равномерного тонкого

слоя грязно-розового цвета;

9) Получившийся препарат высушили на воздухе;

Процесс сушки может занимать от 10 до 30 минут.

10) На препарат нанесли каплю воды (такая подготовка препарата

называется водной иммерсией) и изучили полученный препарат с

помощью светового микроскопа при увеличении х100 (объектив 40,

окуляр 10).

Рисунок 10.

Пример снимков препарата

при х400 (слева) и х1000 (справа)

Приложение 8

Исследование бактерий к накоплению полимерных соединений.

1) На предметном стекле перманентным маркером нарисовали несколько

кругов (количество кругов должно быть равно количеству колоний,

которые собрались исследовать), круги пронумеровали.

2) Перевернули стекло и дальнейшую работу проводили на обратной

стороне стекла (сторона, на которой нарисованы круги оказалась

внешней);

3) C помощью пипетки Пастера на 1 мл поместили каплю воды (20-30 мкл)

в центр каждого круга;

4) Чистой зубочисткой коснулись культуры азотобактера, чтобы зацепить

небольшое количество биомассы;

5) Разболтали колонию в воде, стараясь при этом, чтобы разные капли

воды не перемешивались между собой;

Каждую колонию переносили в отдельную каплю, используя при

этом чистую зубочистку.

6) Капли подсушили на воздухе до полного исчезновения влаги;

7) Зафиксировали препарат с помощью пламени.

8) Дождались, пока стекло остынет и на каждую высохший образец

бактерий (пятно) нанесли каплю красителя – судана черного;

Пятно должно быть полностью покрыто красителем.

9) Оставили стекло на 15 минут при комнатной температуре;

Краситель может растекаться в процессе окрашивания (Рисунок 11).

Рисунок 11. Процесс окрашивания препарата

10) Промыли пятна изопропанолом, направляя струю из капельницы на

пятна;

11) Проанализировали интенсивность окраски пятен. Если после промывки

стекла бактерии окрасились в голубой цвет (как образцы бактерий №2 и

3 на Рисунке 12), значит они способны активно накапливать полимеров в

своих клетках.

Рисунок 12. Результат окрашивания

12) Высушили стекло и рассмотрели бактерии через объектив микроскопа

при максимальном увеличении.

Рисунок 13.

Бактерии, способные накапливать полимеры при увеличении.