Получение биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae как альтернативного источника кормового белка

XXI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке

Личный портфель

Получение биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae как альтернативного источника кормового белка

Мелконян С.Г. 1
1ГБУ ДО "Белгородский областной Центр детского (юношеского) технического творчества"
Давыдова Л.Е. 1
1ГБУ ДО "Белгородский областной Центр детского (юношеского) технического творчества"
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Диплом школьникаСвидетельство руководителя
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Обоснование потребности и актуальность. Во всем мире существует глобальная проблема дефицита кормового белка. Основной источник кормовых белков – это бобовые культуры (главным образом, соя). Мировое производство сои в сезоне 2017/2018 составило около 350 млн т. Более 80 % мирового объема производства этой культуры приходится всего на три страны: США (35 %), Бразилию (33 %) и Аргентину (14 %). В России же, по данным Росстата, посевные площади сои в 2018 году составили около 2,9 млн га, а средняя урожайность – всего 1,4 т/га. Это, безусловно, недостаточный для нашей страны показатель. На данный момент в России производится около 3,5-4 млн т сои, а потребляется – около 6-6,5 млн т. Соответственно, импорт составляет около 45 % от общего объема потребления.

Рост поголовья в животноводстве и птицеводстве на российских сельхозпредприятиях стимулирует увеличение производства кормов и добавок. По информации Союза свиноводов России, в 2016 году прирост отрасли, ставшей драйвером всего животноводческого комплекса, составил 9,4%, или 4,3 млн.т. мяса. Рост продолжился и в этом году: в январе производство продукции свиноводства увеличилось на 12,6% по сравнению с январем 2016 года и достигло 273,9 тысячи тонн. В 2016 г. на 2,1% прибавило и птицеводство, увеличив объем готовой продукции до 6,1 млн.т. Общая же цифра производства скота и птицы на убой выросла за год на 3,4%, до 13,9 млн.т.

Безусловно, закономерно вслед за увеличением поголовья, растет и доля производства кормов для них, но, все же темпы эти значительно отстают от темпов роста поголовья. В России производство кормов для птицы увеличилось на 1,2 процента, до 14,2 млн.т., для свиней - на 9,1%, до 9,4 млн.т., для КРС – на 1%, до 2 млн.т.

Сельскохозяйственные поля на территории нашей страны уже достаточно истощены и нуждаются в значительных материальных и трудозатратах для восстановления и повышения уровня плодородия. Именно поэтому производители сельскохозяйственной мясной продукции так остро нуждаются в альтернативных источниках кормового белка для своего поголовья. Это существенно сократит энергию и финансовые ресурсы для выращивания животных. В роли такой альтернативы эффективно можно использовать водоросли, грибы, насекомых, бактерии. Совсем скоро альтернативные источники белка, к которым относятся водоросли, насекомые, и продукты микробиологического синтеза, будут играть ключевую роль в питании людей и животных. В частности, они эффективно смогут заменить сою и рыбную муку в составе животных кормов.

В составе грибных клеток много хитина, в отличие от растительных и бактериальных. Хитин можно использовать как пищевую добавку для укрепления здоровья скота и гидробионтов, так как он обладает выраженным терапевтическим эффектом в процессе использования антибиотиков.

Еще одним преимуществом использования дрожжей Saccharomyces cervisiae является способность ферментировать сахар с образованием этанола и двуокиси углерода в качестве продуктов реакций. На выходе мы можем получать высокий процент общего белка, причем его качество может изменяться в присутствии небелкового азота из нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты могут обеспечивать 10-20% содержания белка.

Материалы и методы. Для получения биомассы (рис.1) Saccharomyces cerevisiae чистую культуру, находящуюся в логарифмической фазе роста, пассировали в 100 мл стерильной питательной среды (состав: сахароза 2%, NH4NO3 0,5%, вода водопроводная), инкубировали при 30°С в течение 36 часов. Инокулят вносили в биореактор (Biocanvas LFDV1,5L, Centrion, Корея) с 900 мл среды и культивировали при той же температуре, поддерживая рН около 7, перемешивая (300 об/мин) и аэрируя (рис.2).

Рисунок 1. Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием биореактора Biocanvas LFDV1,5L, Centrion, Корея

Каждые 6 часов отбирали пробу для измерения оптической плотности (ОП) при длине волны λ = 600 нм с использованием спектрофотометра UV-1900i, Shimadzu, Japan. Диапазон времени инкубации подобран экспериментально для культуры.

Данные оптической плотности использовали для расчета некоторых кинетических параметров культивирования культуры в данных условиях.

Рисунок 2. Общая архитектура процесса получения биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием лабораторного биореактора

Удельный прирост рассчитывали по формуле [Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др. Экология микроорганизмов: учеб. для студ. вузов / Под ред. Нетрусова А.И. – М. : Издательский центр «Академия», 2004. – 272 с.]:

, (1)

где, x0и x1 – значения исходной ОП суспензии клеток и на момент окончания культивирования, соответственно.

Константу скорости роста рассчитывали по формуле [Нетрусов А.И., Котова И.Б. Общая микробиология: учебник для студ. высш. учеб. Заведений – М. : Издательский центр «Академия», 2007. – 288 с.]:

, (2)

где, x0и x1 – значения ОП суспензии клеток, соответствующие времени культивирования t0и t1.

Константа скорости деления рассчитывали по формуле [Нетрусов А.И., Котова И.Б. Общая микробиология: учебник для студ. высш. учеб. Заведений – М. : Издательский центр «Академия», 2007. – 288 с.]:

, (3)

где, х0и х1 – значения ОП суспензии, содержащей клетки, соответствующие времени инкубации t0и t1.

Время удвоения биомассы, или время генерации рассчитывали по формуле [Нетрусов А.И., Практикум по микробиологии [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов М. А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; – Москва: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.]:

, (4)

где, g – время генерации, ν- константа скорости деления.

Длительность лаг-фазы рассчитывали по формуле [Ананьева Н.Д. Микробиологические аспекты самоочищения и устойчивости почв / Отв. ред. Д.Г. Звягинцев. – М. : Наука, 2003. – 223 с.]

, (5)

где

, (6)

Для расчёта достоверности различия использовали разностный метод статистического анализа [Основы научных исследований в агрономии /В.Ф. Моисейченко, М.Ф. Трифонова, А.X. Заверюха, В.Е. Ещенко. — M.: Колос, 1996. — 336 с: ил. — (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений)].

Содержание общего белка оценивали методом Брэдфорда, который основан на способности красителя кумасси (Coomassie Brilliant Blue G-250) реагировать с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Метод позволяет получить хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения абсорбции от концентрации) [Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical biochemistry. – 1976. – V. 72. – №. 1-2. – P. 248-254.]. Для этого из фильтрата готовили гидролизат: нагревали суспензию осадка дрожжей в 2н HCl при 90°С в течение 10 минут. Образовавшийся осадок центрифугировали в течение 30 мин со скоростью 13 500 об/мин для осаждения бактериальных клеток c использованием центрифуги (Neofuge 1600R, Heal Force, Китай). Содержание белка оценивали и в надосадочной жидкости, и в суспендированном осадке.

Содержание подвижного фосфата в гидролизате оценивали модифицированным методом определения подвижных фосфатов по Кирсанову (ГОСТ Р 54650-2011). Для этого 6 г молибденовокислого аммония растворяли в 200 мл дистиллированной воды с нагреванием. После того, как раствор остыл, вносили 1 г аскорбиновой кислоты. Полученный раствор в объеме 2 мл приливали к такому же количеству исследуемого образца, содержащего фосфат. При взаимодействии молибденовокислого аммония с фосфатами в присутствии аскорбиновой кислоты, образуются комплексные соединения, окрашивающие раствор в синий цвет. Растворы оставляли настаиваться в течение 10 мин для стабилизации цвета. После чего, измеряли оптическую плотность при длине волны λ = 710 нм.

Результаты и обсуждение. В ходе культивирования Saccharomyces cerevisiae на основании изменения ОП (рис.3) получены значения удельного прироста (R) относительно исходной концентрации.

Рисунок 3. Кривая изменения оптической плотности культуральной жидкости содержащей клетки Saccharomyces cerevisiae как показатель роста популяции

Так, выявлено, что наибольший прирост популяции около 24 часа инкубации, так как он значимо превышает предыдущее значение на 57% и незначительно ниже, чем параметр для 30 часа культивирования - 12% (рис.4). Таким образом, логарифмическая фаза роста находится в диапазоне до 24 часа. Дальнейшее культивирование штамма характеризуется замедлением роста и переходом в стационарную фазу.

Рисунок 4. Удельный прирост оптической плотности Saccharomyces cerevisiae как показатель логарифмической фазы роста популяции

Константа скорости роста логарифмической фазы (μ) составила 0,43, тогда как константа скорости деления (ν) – 0,6. Время удвоения биомассы (g) составило 1,6 ч-1, а длительность логарифмической фазы роста (L) 5 ч.

Содержание подвижного фосфата в гидролизате составило 1,6 ОП, а белка – около 8 мг/мл.

Таким образом, полученные кинетические параметры на минимальной питательной среде могут быть использованы при моделировании биотехнологического процесса (в том числе и непрерывного) и при подборе рентабельного ростового субстрата для Saccharomyces cerevisiae.

Список использованных источников

  1. Почвы. Определение подвижных соединений фосфора и калия по методу Кирсанова в модификации ЦИНАО [Электронный ресурс] : ГОСТ Р 54650-2011 от 13.12.2011 г. – Режим доступа : https://docs.cntd.ru/document/1200094361

  2. Альтернативные источники белка в Скандинавских странах / Р. О. Бутовский [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://fsdejournal.ru/pdf-files/2017/Butovsky-06-2017.pdf

  3. Ананьева Н.Д. Микробиологические аспекты самоочищения и устойчивости почв / Отв. ред. Д.Г. Звягинцев. – М. : Наука, 2003. – 223 с.

  4. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др. Экология микроорганизмов: учеб. для студ. вузов / Под ред. Нетрусова А.И. – М. : Издательский центр «Академия», 2004. – 272 с.

  5. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Общая микробиология: учебник для студ. высш. учеб. Заведений – М. : Издательский центр «Академия», 2007. – 288 с.

  6. Нетрусов А.И., Практикум по микробиологии [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов М. А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; – Москва: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.

  7. Основы научных исследований в агрономии /В.Ф. Моисейченко, М.Ф. Трифонова, А.X. Заверюха, В.Е. Ещенко. — M.: Колос, 1996. –336 с.

  8. Производство кормовых добавок для животноводства в РФ растет [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://milknews.ru/index/novosti-moloko_10105.html

  9. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical biochemistry. – 1976. – V. 72. – №. 1-2. – P. 248-254.

Просмотров работы: 54