Введение
Первый куст картофеля, согласно преданию, появился не где-нибудь, а на могиле дочери царя Мамера, которая отличалась свободолюбивым нравом. За свои деяния она попала в ад, а тот, кто будет употреблять картофель, по легенде, повторит ее судьбу и окажется там же…
Но в наше время ученые выяснили: какого бы цвета не был картофель — белого, розового, желтого или фиолетового, он содержит фитонутриенты, такие как флавоноиды. Они воздействуют на организм как антиоксиданты. Картофель богат крахмалом, содержит в своем составе белок и является источником витамина С. Включая картофель в свой рацион, можно обогатить его калием, фосфором, магнием и железом. Кроме того, в картофеле имеются важные микроэлементы (железо, марганец, медь, цинк) и витамины.
Технологию микроклонального размножения, которую также называют in-vitro, используют европейские компании с начала 80-х годов прошлого века.
Технологию микроклонального размножения отличают:
Высокий коэффициент репродукции;
Воспроизводство трудно размножаемых традиционными способами растений;
Получение генетически однородного высококачественного посадочного материала;
Получение оздоровленного безвирусного материала;
Возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала.
Резюмируя, размножение растений в культуре in vitro – это технология в сельском хозяйстве, позволяющая получать за малый промежуток времени большое количество растений, идентичных исходному, то есть – клонов. В основе получения таких растений лежит способность соматических клеток растений полностью реализовать свой потенциал развития, т.е. свойство тотипотентности.
Цель:
Провести процесс микроклонального размножения картофеля, получить генетически одинаковые клубни.
Задачи:
Изучить теорию от микроклональном размножении картофеля.
Провести микроклональное размножене картофеля по стадиям.
Исследовать полученный результат.
Методика исследований
Этап 1. Выбор материнского растения: Выберите здоровое и свободное от болезней растение картофеля для использования в качестве исходного материала. Оно должно быть свободно от вирусов и других патогенов.
Этап 2. Стадия элонгации (доращивания). Разделить материнский организм, поместить во влажную среду. Поддерживать картофель водопроводной водой в течение 30-и дней. В процессе стадии элонгации количество микрорастений увеличивается в 1,6 раз.
Этап 3. Отделение экспланта. По прохождении 30-и дней простерилизуйте материнский организм, скальпель, резиновые перчатки и конические колбы в стерилизационном боксе. При помощи скальпеля отделите от родительского картофеля адвентивные побеги, микростволовки и микроклубни, отложите на стерильную поверхность.
Этап 4. Подготовка стерильной питательной среды. Подготовьте стерильную среду для культивации тканей. Это может быть раствор Геррики. На 1 литр раствора понадобятся следующие вещества:
Агар-агар – 20 г
Калийная селитра KNO3– 5,5 г
Кальциевая селитра Ca(NO3)2 – 1 г
Сульфат магния MgSo4 – 1,4 г
Сульфат железа двухвалентного FeSo4 – 0,2 г
Сульфат марганца MnSo4– 0,02 г
Сульфат цинка ZnSo4 – 0,01 г
Сульфат меди CuSo4– 0,01 г
Доведите 1 литр воды до кипения, добавьте сухие вещества, кипятите в течение 5-10 минут, постоянно помешивая. Разлейте раствор в термостойкие конические колбы объемом 50 мл до застывания раствора.
Этап 5. Акклиматизация в питательной среде. Подождите 1-2 минуты до застывания раствора, аккуратно поместите в колбы части экспланта. Закройте оголовки колб медицинской ватой, поставьте колбы в хорошо освещаемое помещение с температурой 20°- 25°C и относительной влажностью воздуха не более 50%. Длительность этапа 50 дней. Акклиматизация в микроклональном размножении картофеля – это процесс приспособления выращенных тканевых культур к условиям внешней среды,для последующего развития в почве. Длина стадии – 50 дней.
Первоначально, после окончания предыдущего этапа размножения, выращенные тканевые культуры переносят из контролируемой среды в условия, приближенные к естественным. Во время акклиматизации тканевые культуры проходят через несколько этапов приспособления. Сначала они могут испытывать стресс, связанный с изменением условий окружающей среды, таких как изменение температуры, влажности и освещения. В этот период растения могут замедлить свой рост или даже временно остановить его.
Этап 6. Акклиматизация в грунте. На 50-й день стадии акклиматизации необходимо пересадить эксплант в горшки с землей для приспособления к росту и развитию в условиях открытого грунта. Длина стадии – 30 дней. Постепенно тканевые культуры становятся все более устойчивыми к изменению условий окружающей среды и формируют полноценные растения. Когда растения достигают определенной величины и имеют достаточное количество корней и листьев, они готовы быть пересажены на открытый грунт. Важным аспектом акклиматизации является контроль за возможными заболеваниями и вредителями. Растения могут быть подвержены инфекциям или нападению вредных организмов, поэтому необходимо проводить регулярные осмотры и принимать меры по их предотвращению или лечению. В целом, акклиматизация в микроклональном размножении картофеля является важным этапом, который позволяет выращенным тканевым культурам адаптироваться к условиям внешней среды и стать полноценными растениями, готовыми для успешного выращивания на поле.
Этап 7. Рост и развитие в условиях открытого грунта. Выжившие растения необходимо пересадить в почву. Для этого выкопайте лунки глубиной 7-10 см и диаметром около 20 см. Аккуратно переместите растительные организмы в почку, осторожно присыпьте землей. Поливайте картофель водопроводной водой каждые 3-5 дней в жаркое время года, 6-8 дней в переходное время года. Длина стадии – 90 дней.
Этап 8. Сбор урожая. Выкопайте картофель, рассортируйте и пронумеруйте кусты.
Этап 9. Анализ и тестирование полученного урожая. Проведение анализа полученного урожая включает в себя проведение анализа химического состава и органолептических свойств картофеля, а именно:
Исследование на содержание магния.
При обеспечении растений достаточным количеством магния, помимо роста урожайности, отмечается повышение качественных показателей продукции – увеличивается содержание сахара, крахмала, белка, витамина С. Улучшается и качество семян: повышается их всхожесть, интенсивность прорастания.
Мелконарезанный картофель смешивают с дистиллированной водой, фильтруют для получения водной вытяжки с растворенным в ней магнием. В 10 мл фильтрата добавляют 2 мл раствора серной кислоты (H2So4), титруют. Затем, для создания раствора с известной концентрацией магния к 9 мл дистиллированной воды добавляют 1 мл сульфата магния (MgSo4), получая 10% раствор сульфата магния. Реагируя с магнием в составе водной вытяжки, серная кислота образует сульфат магния (Mg + H2So4→MgSo4 + H2). Затем, при помощи спектрофотометра с использованием длины волны 467 нм сравнивают показатели оптической плотности раствора водной вытяжки и раствора с известной концентрацией сульфата магния и вычисляют процентное содержание магния по формуле:
Исследование на содержание фосфора.
Фосфор способствует развитию корневой системы, образованию столонов и клубнеобразования в целом.
Мелконарезанный картофель смешивают с дистиллированной водой, фильтруют для получения водной вытяжки с растворенным в ней фосфором. В 10 мл фильтрата добавляют 2 мл раствора соляной кислоты (HCl), титруют. Затем, для создания раствора с известной концентрацией фосфора к 9 мл дистиллированной воды добавляют 1 мл фосфорнй кислоты (H3Po4), получая 10% раствор фосфорной кислоты. Реагируя с фосфором в составе водной вытяжки, соляная кислота образует фосфорную кислоту (P + HCl→ H3Po4 + H2). Затем, при помощи спектрофотометра с использованием длины волны 259 нм сравнивают показатели оптической плотности раствора водной вытяжки и раствора с известной концентрацией фосфорной кислоты и вычисляют процентное содержание фосфора по формуле:
Исследование на содержание железа.
Картофель содержит железо, которое прекрасно усваивается благодаря витамину С в составе овоща. Этот минерал участвует в доставке кислорода к органам и тканям, а также влияет на общее состояние организма.
Мелконарезанный картофель смешивают с дистиллированной водой, фильтруют для получения водной вытяжки с растворенным в ней железом. В 10 мл фильтрата добавляют 2 мл раствора соляной кислоты (HCl), титруют. Затем, для создания раствора с известной концентрацией железа к 9 мл дистиллированной воды добавляют 1 мл хлорид железа (FeCl3), получая 10% раствор хлорида железа. Реагируя с железом в составе водной вытяжки, соляная кислота образует хлорид железа (Fe + HCl→ FeCl3). Затем, при помощи спектрофотометра с использованием длины волны 234 нм сравнивают показатели оптической плотности раствора водной вытяжки и раствора с известной концентрацией хлорида железа и вычисляют процентное содержание железа по формуле:
Исследование на содержание калия.
Калий играет роль в функционировании нервной системы, сокращении мышц, поддержании водного баланса организма, поддержании нормального кровяного давления и сахара в крови, во многих биохимических реакциях, обеспечивающих жизнедеятельность человека.
Мелконарезанный картофель смешивают с 10 мл дистиллированной водой, фильтруют для получения водной вытяжки с растворенным в ней калием. Затем, для создания раствора с известной концентрацией калия к 9 мл дистиллированной воды добавляют 1 мл гидроксида калия (KOH), получая 10% раствор гидроксида калия. Реагируя с калием в составе водной вытяжки, вода образует ионы калия. Затем, при помощи спектрофотометра с использованием длины волны 766 нм сравнивают показатели оптической плотности раствора водной вытяжки и раствора с известной концентрацией гидроксида калия и вычисляют процентное содержание калия по формуле:
Измерение массы картофеля. Поместите опытный образец на весы, измерьте массу.
Вычисление плотности картофеля. Плотность картофеля находят по формуле:
ρ= , где
ρ – плотность картофеля ( ,)
m – масса картофеля (г),
V – объем картофеля (мл).
Массу картофеля можно определить при помощи весов. Для определения объема в мерный стакан налейте 100 мл воды, аккуратно опустите картофель. Объем воды, который станет после погружения картофеля, является объем картофеля + 100 мл воды. Чтобы вычислить объем картофеля (мл), нужно:
Объем картофеля = Полученный объем – 100 мл
Определение содержания крахмала в картофеле. Определение содержания крахмала в картофеле можно провести с помощью химического анализа.
Подготовьте образец картофеля, сняв кожуру и нарезав его на мелкие кусочки. Положите образец в ступку или блендер и измельчите его до получения однородной массы. Перенесите полученную массу в пробирку и добавьте небольшое количество дистиллированной воды для образования пастообразной смеси. Добавьте 1 мл йода в пробирку и тщательно перемешайте содержимое. Йод будет реагировать с крахмалом, образуя синий или фиолетовый цвет. Чем больше крахмала в образце, тем интенсивнее будет окраска. Добавьте в раствор некоторое количество тиосульфата натрия, титруйте до обесцвечивания. Запишите количество тиосульфата натрия, необходимого для обесцвечивания йода.
Приготовьте эталонный раствор: известное количество крахмала растворите в 10 мл воды, добавьте 1 мл йода, проведите титрование тиосульфатом натрия до обесцвечивания. Запишите необходимое количество тиосульфата натрия.
Вычислите процентное содержание крахмала в картофеле по формуле:
Важно отметить, что этот метод является приближенным и может давать некоторую погрешность.
Органолептические свойства: вкус.
Вкус подразделяется на разные категории:
Характер вкуса |
Описание |
|
Это признак свежего и нежного картофеля, содержащего сахара. |
|
Некоторые сорта картофеля могут иметь легкую горчинку во вкусе, которая может быть вызвана наличием натуральных токсинов в картофеле. |
|
Это может быть признак того, что картофель был обработан солью или выращен на почве с высоким содержанием соли. |
|
Это может быть признак того, что картофель начал гнить или подвергся брожению, что приводит к образованию кислотных соединений. |
|
Это означает, что картофель не имеет ярко выраженного вкуса и не обладает ни сладостью, ни горечью, ни кислотностью. |
Результаты.
За месяц до начала самого процесса микроклонального размножения мы запустили стадию элонгации. Разрезали опытный образец картофеля сорта Гранд на две части, каждую половину положили в пластиковый контейнер, накрытый льняным ковриком. На протяжении 30 дней раз в двое суток поддерживали материнский организм водопроводной водой. Влажность в помещении – 56%, температура – 220C. В процессе стадии элонгации количество микрорастений увеличилось в 1,6 раз. Длина стадии 30 дней. За время стадии доращивания на родительском корнеклубне появились вегетативные органы, подходящие для микроклонального размножения, а конкретно (Приложение 2):
2 микроклубня
5 адвентивных побегов
На 1-ом этапе, выбирали питательную среду, остановили свой выбор на среде Геррики. На электронных весах мы взвешивали определенное количество вещества, затем добавляли в тару с 1 л дистиллированной воды. Кипятили в течение пяти минут, постоянно помешивая. Профильтровали раствор через марлю. (Приложение 2).
В ламинарном боксе при помощи ультрафиолетового излучения простерилизовали экспланты, 7 конических колб, медицинскую вату, пинцет. Раствор Герикки равномерно распределили в 7 конических колб объемом 25 мл. После застывания раствора в конические колбы поместили части экспланта, пронумеровали колбы, закрыли медицинской ватой и поставили на солнечный свет.
Второй этап – акклиматизация. Длина стадии – 50 дней.
На 8-й день эксперимента у микроклубня №4 появился свой адвентивный побег. До 27-ого дня все образцы, кроме №4, приостановили свой рост. Образцы №3, №6 и №7 не смогли приспособиться к условиям окружающей среды вне материнского организма, вследствие чего их части поочередно гнили и отмирали. Отмирающие части экспланта осторожно убирали пинцетом.
На 16-ый день стадии акклиматизации на верхней части питательной среды образовался слой нитчатых водорослей, которых удалось классифицировать как род Спирогира. Это произошло из-за повышенной влажности в помещении, где проходил эксперимент. Все водоросли убрали при помощи пинцета.
По мере приспособления к новым условиям, в промежутке между 27-м и 31-м днем рост корней и листьев образцов №1, №2 и №5 возобновился. К тому времени, длина стебля микроклубня №4 достигла 14 см. Образцы №3, №6 и №7 окончательно отмерли, не образовав отростков или корней.
На 36-й день заметили, что образец №2 сильно пожелтел, предположительно заболел.
К 48-му дню наиболее пригодными для пересадки оставались микроклубни №1 и №4, адвентивные побеги №2 и №5. У микроклубней №1 и №4 длина стеблей собственных побегов составила 3,5 см и 20,1 см соответственно (Приложение 3). На 50-й день стадии акклиматизации приняли решение о пересадке растений в грунт.
Перед пересадкой простерилизовали грунт в ламинарном боксе во избежания заражения картофеля. Для более рационального использования полученных акклиматизировавшихся эксплантов было принято решение отделить микроклубни №1 и №4 от их побегов и посадить в грунт по отдельности. Все образцы были пересажены в грунт, политы водопроводной водой. Таким образом, в грунте оказались образцы:
№1микроклубень
№1побег
№4микроклубень
№4побег
№5
№2
Третий этап – развитие в грунте (Приложение 4). Длина стадии – 30 дней. Раз в три дня фиксировали длину побегов каждого образца и записывали происходящие изменения. Были составлены графики роста каждого образца.
Итак, по истечении 30 дней длина побега №1микроклубень составила 20,4 см. Данный образец оказался здоровым и использовался нами для пересадки в открытый грунт.
График роста образца №1микроклубень :
График роста образца №1побег:
Образец №1побег не смог приспособиться к условиям роста в грунте и погиб на 8-ой день стадии развития в грунте.
График роста образца №4микроклубень:
Итак, по истечении 30 дней длина побега №4микроклубень составила 16,9 см. Данный образец оказался здоровым и использовался нами для пересадки в открытый грунт.
График роста образца №4побег:
На протяжении 30-и дней длина побега №4 побег практически не изменилась и, в итоге, составила 20,5 см. Данный образец оказался здоровым и использовался нами для пересадки в открытый грунт.
График роста образца №2:
На 3-й день стадии развития в грунте образец №2 погиб, предположительно, из-за затяжной болезни.
График роста образца №5:
Образец №5 развивался достаточно равномерно, на 30-й день длина его побега составила 17,4 см. Данный образец оказался здоровым и использовался нами для пересадки в открытый грунт.
Задачей четвертого этапа являлось получение корнеклубней картофеля в процессе его выращивания в открытом грунте. Для этого подобрали опытный участок. Наиболее подходящими для пересадки оказались образцы №4микроклубень, №4побег, №5 и №1микроклубень. Выкопали четыре лунки глубиной 10 см и диаметром 19 см, поместили образцы, присыпали землей и пролили водопроводной водой. Длина стадии – 90 дней. На протяжении первых 60-ти дней визуальных изменений с образцами не происходило, затем они стали засыхать. На 90-й день все кусты были выкопаны, образец №4побег не оставил корнеклубней.
Пятый этап – проведение химического анализа и анализа органолептических свойств картофеля. Анализы были выполнены в строгом соответствии с методикой поведения химического и анализа органолептических свойств картофеля. Данные занесены в таблицы (Приложение 5). Анализ вкуса и запаха:
Запах крахмалистый, более выраженный, чем у картофеля, выращенного традиционным способом. Текстура зернистая, рассыпчатая, мягкая. На вкус с легкой горчинкой, в послевкусии присутствует сладость. В целом картофель сочный.
Резюмируя, полученный нами картофель полностью соответствует нормам СанПин как по химическому анализу, так и по вкусовым качествам.
Выводы.
В результате микроклонального размножения получили картофель сорта Гранд, соответствующий всем требованиям СанПин. В ходе проведения анализов было получено, что в нашем картофеле много железа, которое улучшает общее состояние человека, помогает работе нервной системы. Исходя из этого, наш картофель идеально подойдет для людей с железодефицитной анемией как дополнение к растворам глюконата железа. Повышенное содержание магния влияет на количество белка, крахмала и витамина С в картофеле. Фосфор необходим для работы мышечной системы, поддерживает кислотно-щёлочный баланс в организме, положительно влияет на процесс регенерации. Калий играет роль в функционировании нервной системы, сокращении мышц, поддержании водного баланса организма, поддержании нормального кровяного давления и сахара в крови, во многих биохимических реакциях, обеспечивающих жизнедеятельность человека. Рассыпчатая структура говорит о высоком содержании крахмала в картофеле. Горчинка во вкусе говорит о присутствии в картофеле незначительного количества натуральных токсинов. Сладость в послевкусии - признак свежего и нежного картофеля, содержащего сахара.
Список литературы.
Микроклональное размножение растений/ В. Деминчик, М. Черныш, 2019
Технология производства исходного семенного материала картофеля / А. И. Адамова, С. А. Банадысев, Г. И. Коновалова, З. А. Семенова // Картофелеводство. 2002
Безвирусное семеноводство картофеля: рекомендации / Л. Н. Трофимец, В. В. Бойко, Б. В. Анисимов и др. М.: Агропромиздат, 2000
СанПин № 2.3.2.1324-03 «Качество безопасности пищевых продуктов»
Приложение 1.
Фото. Проведение анализа картофеля в лаборатории, Окунева Д., 2023
Приложение 2.
Фото. Половина материнского организма с частями экспланта, Окунева Д., 2023
Фото. Стерилизация необходимого оборудования в ламинарном боксе, Окунева Д., 2023
Фото. Приготовление питательной среды (раствор Геррики), Окунева Д., 2023
Фото. Отделение экспланта и посадка на питательную среду, Окунева Д., 2023
Приложение 3.
Фото. Контроль роста и развития микрорастений 22.02.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития микрорастений 28.02.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития микрорастений 01.03.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития микрорастений 09.03.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития микрорастений 17.03.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития микрорастений 20.03.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития микрорастений 24.03.2023, Окунева Д., 2023
Приложение 4.
Фото. Контроль роста и развития организмов в грунте 04.04.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития организмов в грунте 05.04.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития организмов в грунте 07.04.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития организмов в грунте 10.05.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития организмов в грунте 12.05.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития организмов в грунте 16.05.2023, Окунева Д., 2023
Фото. Контроль роста и развития организмов в грунте 18.05.2023, Окунева Д., 2023
Приложение 5.
Таблица №1. Процентное содержание металлов (магний, фосфор, калий) в водной вытяжке картофеля.
Исследование |
Магний |
Железо |
Калий |
Реактив |
H2So4 |
HCl |
H2O |
Формула |
|||
Процентное содержание |
0,00025% |
0,0000078% |
0,0042% |
Таблица №2. Процентное содержание фосфора в водной вытяжке картофеля.
Реактив |
HCl |
Формула |
|
Процентное содержание |
0,00057% |
Таблица №3. Процентное содержание крахмала в картофеле.
Реактив |
I2 |
Реактив для обесцвечивания |
Na₂S₂O₃ |
Формула |
|
Процентное содержание |
16% |
Таблица №4. Масса картофеля разных образцов.
№ образца |
№1микроклубень |
№4микроклубень |
№5 |
Масса, г |
49,47 |
31,71 |
15,16 |
Количество клубней, шт. |
5 |
4 |
3 |
Таблица №5. Вычисление плотности картофеля.
Формула |
=ρ |
M, г |
15,407 |
V, см3 |
12 |
Результат, |
1283,9 |