XXI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Как выделить ДНК растительного организма в школьной лаборатории
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Актуальность. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – это молекула, присутствующая в каждом живом организме, которая хранит генетическую информацию и передаёт её по наследству. Дезоксирибонуклеиновая кислота, тщательно изученная молекула [1]. В настоящее время наука не стоит на месте, каждый год появляется всё больше различных научных центров, которые занимаются выделением ДНК и подробным изучением его строения, а также открывается множество клиник, помогающих людям узнать своих родственников, основываясь на сравнении строения ДНК. Изучая молекулу ДНК на уроках биологии и химии, мы представляем её как нечто абстрактное и недоступное взгляду. ДНК можно выделить из разных живых организмов, и она будет выглядеть идентично. Мы поставили себе цель убедиться в этом лично, выделив свою собственную ДНК и ДНК банана.
Цель работы: реализовать простой и доступный метод выделения ДНК из биологического материала в условиях школьной лаборатории.
Задачи работы:
-
Изучить литературу по теме исследования.
-
Изучить методы выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты.
-
Найти и опробовать простейшие методики выделения ДНК из биологических объектов.
-
Определить лучший детергент для выделения ДНК.
-
Показать, что выделение ДНК возможно в условиях школьной лаборатории без использования дорогостоящих реактивов и оборудования.
Гипотеза исследования: не имея дорогостоящего оборудования и реактивов, можно успешно выделить ДНК в пределах школьной лаборатории.
Объект исследования: эукариотические клетки.
Предмет исследования: молекулы ДНК.
Методы исследования: анализ, сравнение, обобщение, эксперимент.
1.Теоретическая часть.
1.1. История открытия ДНК.
Если говорить об открытии ДНК, то стоит начать с начала, а именно с Иоганна Фридриха Мишера, который еще в 1869 году работая врачом начал изучать химический состав живых клеток. В качестве материала выбрал лейкоциты и вот, испытывая разные способы отмывания лейкоцитов с марли бинтов, он начал замечать, что кроме белков в лейкоцитах присутствует ещё какое-то загадочное соединение, он до конца так и не понял, что это такое, а лишь смог определить, что вещество обладает кислотными свойствами. Мишер дал ему название нуклеиновая кислота. До 1930 годов считалось, что ДНК содержится лишь в живых клетках, а РНК в растительных. Однако в 1934–35 годах вышли научные статьи Советских биохимиков - Андрея Николаевича Белозерского и Александра Робертовича Кизеля, в которых доказывалось присутствие ДНК и в растительных клетках. В сороковых годах этими же учеными было доказано присутствие нуклеиновых кислот у различных бактерий.
Вплоть до 1950-х годов XX века строение ДНК и способ передачи её наследственной информации оставались неизвестным, хотя и были сведения, что ДНК состоит из нескольких цепочек, но никто точно не знал сколько этих цепочек и как они соединены. Но работы группы биохимика Эрвина Чаргаффа поменяли представления об этом. В 1949–1951 годах им удалось разделить нуклеотиды с помощью бумажной хроматографии и определить точные количественные соотношения нуклеотидов разных типов. Соотношения оказалось следующими: количество аденина равно количеству тимина, количество гуанина равно количеству цитозина ([A]+[Г]=[Т]+[Ц]=50%) это и сыграло главную роль в открытии строения ДНК. И вот на дворе 1953 год и мы наконец-то имеем дело с главными героями открытия структуры ДНК: Фрэнсисом Криком, Джеймсом Уотсоном, Морисом Уилкинсом и довольно грустной историей Розалинд Франклин. В то время Фрэнсис Крик работал в Кавендишской лаборатории в Кембридже куда на стажировку приехал молодой американский учёный Джеймс Уотсон, у них на двоих была идея того, что тайна гена может храниться именно в ДНК, поэтому они быстро начали свою работу. Однако у них не было возможности проводить какие-либо эксперименты так как эксперименты с ДНК проводились в другой лаборатории, в королевском колледже, где как раз работали специалисты по рентгеноструктурному анализу - Розалинд Франклин и Морис Уилкинс. Розалинд работала над структурой ДНК и путём долгих проб и ошибок, с помощью снимков рассеяния рентгеновских лучей ей удалось сделать знаменитый “снимок 51”. Однако она не особо-то и хотела делиться полученной информацией, у неё было желание определить структуру ДНК самой, но Фрэнсису Крику и Джеймсу Уотсону удалось заполучить эту рентгенограмму и на её фоне создали модель двойной спирали ДНК. За что в 1962 году удостоились Нобелевской премии по медицине и физиологии. А что касаемо Розалинд Франклин, она умерла за 4 года до вручения премии. Она внесла огромный вклад в историю открытия ДНК и в какой-то степени даже пожертвовала жизнью.
1.2. Строение молекулы ДНК.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) – это биологические линейные полимеры, мономерами которых являются нуклеотиды. Последовательность нуклеотидов в ДНК и РНК – это первичная структура этих нуклеиновых кислот. Длина молекулы ДНК может достигать нескольких сотен миллионов нуклеотидов. Молекула ДНК состоит из двух полимерных цепей, соединенных водородными связями между азотистыми основаниями и закрученных в спираль. Азотистые основание Дезоксирибонуклеиновой кислоты: Аденин (А), Гуанин (Г), Цитозин (Ц), Тимин (Т). При образовании спирали азотистые основания соединяются в особом порядке-по принципу комплементарности. Аденин соединяется с Тимином, образуя двойные водородные связи, а Гуанин с Цитозином образуя тройные водородные связи. Азотистые основания занимают центральные положения в спирали ДНК, уложены стопками и обладают гидрофобными свойствами, что не позволяет молекулам воды проникнуть внутрь и повышает устойчивость строения ДНК. На поверхности молекулы находится моносахарид дезоксирибоза и фосфатные группы-остатки фосфорной кислоты. В цепи нуклеотиды связаны между собой фосфодиестерными связями, которые образуются при соединении фосфатной группы и дезоксирибозы и путем реакции с группой гидроксида (-OH), что сопутствует удалению молекул воды [2].
Молекула ДНК содержит гены и межгенные области. Ген – вся ДНК, кодирующая первичную последовательность конечного продукта гена, который может быть полипептидом или РНК. Структура всех видов РНК (иРНК, тРНК, рРНК) закодирована в ДНК, но в разных генах, это значит, что один ген кодирует один белок. ДНК является носителем генетической информации и основой для формирования хромосомы. Хромосома – это спирализованная ДНК, комплекс ДНК с белками в ядре клетки.
Дезоксирибонуклеиновая кислота обладает свойством самоудвоения – репликацией. Перед началом фермент расплетает цепи спирали ДНК и разрывает водородные связи между азотистыми основаниями. Затем на обеих цепях происходит синтез новых цепей, соединение нуклеотидов строящейся цепи с цепью старой осуществляется по принципу комплементарности азотистых оснований. После завершения синтеза каждая новая молекула ДНК состоит из одной старой, родительской цепи и одной новой.
Также ДНК участвует в биосинтезе. Последовательность аминокислот в каждом белке определяется именно последовательностью нуклеотидов в участке ДНК, кодирующем данный белок. От ДНК напрямую зависит первый этап биосинтеза. Транскрипция (переписывание) происходит в ядре клетки с участием различных ферментов и в этом процессе матрицей является как раз молекула ДНК [5].
1.3. Способы выделения ДНК.
ДНК — это молекула с отрицательным зарядом: она кодирует инструкцию по сборке отдельных белков, клеток, тканей и целых организмов. ДНК содержится во всех клетках за редкими исключениями. Поэтому выделить ДНК можно из любой ткани живого или мертвого организма. Выделение ДНК — это первый этап молекулярно-биологического исследования. При наличии выделенной ДНК далее становятся возможными определение её последовательности, клонирование, гибридизация и многое другое. Генетический материал хранится в ядрах клеток, которые нужно разрушить, иначе ДНК не выйдет в раствор и не будет доступна для экспериментов. Из клеток животных часть ДНК можно высвободить простым нагреванием, а с растениями так не получится из-за того, что они защищены прочной клеточной стенкой из целлюлозы. В случае эукариот нужно отделить ДНК от белков, входящих в состав нуклеопротеидных комплексов хроматина. При этом важно защитить ДНК от действия нуклеаз и максимально сохранить её целостность, поскольку длинные линейные молекулы ДНК при их изоляции из клетки неизбежно фрагментируются [3]. Однако любой метод получения ДНК состоит из трех основных этапов:
-
Разрушение клеток объекта.
-
Разделение НК и белков.
-
Осаждение НК и очистка от солей.
Разрушение клеток объекта: необходимо подобрать подходящий метод разрушения клеточных стенок и внутренних мембран клеток, источников НК. Действия на этом этапе определяются особенностями строения клеток. Чаще используют механические способы, чем ферменты. Бактериальные клетки чаще всего разрушают с помощью ультразвука, клетки растений и грибов – механическими способами. Клетки животных и человека разрушают механически в суспензии (клетки в буфере) или с помощью гомогенизатора с последующим добавлением буфера (обязательно для поддержания нейтрального или слабощелочного pH). Гомогенизаторами пользуются при необходимости разрушения образцов более прочных тканей. Цель этих методов – получение НК в неповрежденном, исходном состоянии.
Разделение НК и белков: довольно часто используют фенол-хлороформный метод, так как он прост и дешев. Фенол и хлороформ разделяют НК и белки по фракциям. Фенол денатурирует белки, а затем при центрифугировании способствует разделению гомогената на водную и органическую фазы. В водной фазе растворены НК, в органической фазе – фенол, а на их границе находятся денатурированные белки. При добавлении хлороформа улучшается деление гомогената на три фазы, так как за счет него уменьшается количество белково-нуклеиновых комплексов. При таком методе большое значение имеет pH фенола.
Осаждение и чистка НК: водную фазу переносят в новую пробирку и осаждают НК спиртом. Используют изопропанол или этанол. Благодаря этой процедуре получают концентрированные препарат НК, очищенный от примесей солей, которые были в буферном растворе. Механизм действия спиртов заключается в следующем. В водном растворе свободные от белков НК разворачиваются, так как остатки фосфорной кислоты НК в водном растворе заряжены отрицательно и вокруг ДНК образуется «гидратная шуба». Из-за ее образования молекулы НК отталкиваются друг от друга, а при добавлении спирта в водный раствор происходит разрушение гидратной шубы НК. К отрицательно заряженным остаткам фосфорной кислоты притягиваются катионы натрия (соли натрия чаще всего входят в состав буферных растворов), молекулы НК сближаются и выпадают в осадок. При повторном добавлении порции спирта происходит переход ионов солей в раствор, а НК остаются осажденными. На заключительной стадии осадок ДНК растворяют в деионизованной воде.
2. Практическая часть.
В практикуме мы использовали упрощённый метод получения образца геномной ДНК ввиду повышенной опасности фенола и хлороформа, которые невозможно использовать в школьной лаборатории. Мы выделяли ДНК из клеток банана.
Оборудование: весы, фарфоровая ступка и пестик, фильтровальная бумага, химическая воронка, мерный цилиндр (100 мл), мерные стаканы (500, 250 и 100 мл), мерная колба (100 мл), стеклянная палочка.
Реактивы и материалы: буферный раствор охлаждённый при -20оC, 96% этиловый спирт (C2H5OH), банан, дистиллированная вода, лёд (для охлаждения), моющее средство (AOS), пищеварительный фермент, хлорид натрия, сода (NaHCO3) (Приложение 1, фото 1). В качестве детергента (вещества, разрушающего липидные мембраны клеток и липидную мембрану клеточного ядра) использовалось жидкое моющее средство «АОS».
2.1. Выделение ДНК из банана.
1. Приготовление буфера. Эля эксперимента необходимо приготовить 100 мл буфера. Необходимо смешать в стеклянной колбе 5 граммов соды, 1.5 грамма хлорида натрия и залить это 100 мл дистиллированной воды и поместить в лёд для охлаждения (Приложение1, фото2).
2. Отдельно разрезать банан ножом и в фарфоровой ступке пестиком размять его 1/3 до получения однородной кашицы, после чего дать ему настояться 8–10 минут и после влить 250 мл моющего средства (AOS) и охлаждённый, приготовленный ранее буфер. Всё аккуратно перемешать не вспенивая. Дать смеси (гомогенату) настояться 10 минут (Приложение1, фото 3–4).
3. По прохождении времени смесь нужно процедить через четыре слоя марли или фильтровальную бумагу в стакан (пена должна остаться на марле) и тоже оставить охлаждаться (Приложение1, фото 5).
4. Для осаждения ДНК необходимо отмерить 80 мл спирта в охлаждённом мерном цилиндре на 100 мл. После чего уже к охлаждённому гомогенату медленно прилить спирт по краю стакана, при этом наблюдается разделение на фракции и выпадение белого волокнистого осадка ДНК (Приложение1, фото 6–7). Дезоксирибонуклеиновая кислота выделена.
Заключение
Наша гипотеза подтвердилась: выделение ДНК эукариотических клеток возможно в условиях школьной лаборатории без использования дорогостоящих реактивов и оборудования. Метод выделения ДНК может быть относительно простым, хорошо воспроизводимым и при этом давать возможность быстрого получения достаточного количества удовлетворительно очищенных препаратов ДНК.
В результате нашей работы мы успешно выделили ДНК из клеток банана, Лучшим детергентом для получения ДНК из растительных клеток является моющее средство «АОS».
До некоторого времени выделение ДНК было лишь мечтой любого биолога, но это стало возможным уже в наше время даже в обычной школьной лаборатории.
Список литературы.
1. Биологическая химия: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. Под редакцией Н. И. Ковалевской. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Издательский центр «Академия», 2008. – 256 с.
2. Альбертс Б.И. Молекулярная биология клетки. – Т.2. – М.: Мир, 1994
3. Великов В. А. Молекулярная биология. Практическое руководство. –Саратов: Издательство «Саратовский источник», 2013. –84 с.2.
4. Лаборатория на кухне (выделение в домашних условиях ДНК) [Электронный ресурс]. –Examen.ru–портал для абитуриентов и их родителей. –Режим доступа: http://www.examen.ru/add/manual/school-subjects/natural-sciences/genetics/stati-2201/laboratoriya-na-kuxne-vyidelenie-v-domashnix-usloviyax-dnk/
5. Строение ДНК и положение организмов в системе / Под ред. А. Н. Белозерского. – М., 2002.
6.Филиппович Ю. Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей биохимии. – М., 1982. – 318 с.