XXIV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Оценка противогрибковой активности изолята бактерии, выделенной из мха (Sphágnum)

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Каут К.С. 1Власик А.А. 1Наумова Ю.Г. 1

---

1ГБУ ДО «Белгородский областной Центр детского (юношеского) технического творчества»

Давыдова Л.Е. 1

---

1ГБУ ДО «Белгородский областной Центр детского (юношеского) технического творчества»

Работа в формате PDF

625.7 KB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Плесневые грибы широко распространены в природе и играют в ней существенную роль. Они способны синтезировать широкий ассортимент ферментов, которые активно разлагают сложные молекулы. За счет этого, плесневые грибы являются активными деструкторами органического материала. Однако, синтезируя ряд ферментов и вторичных метаболитов, они могут представлять потенциальную опасность для людей, животных и растений. Плесени могут вызывать порчу качественных продуктов, включая хлеб, овощи, ягоды и фрукты. Плесневые грибы представляют собой широкую и очень разнообразную группу микроорганизмов, которые могут оказывать значительное влияние на сельское хозяйство, вызывая различные заболевания растений и ухудшая качество урожая. Основные виды плесневых грибов, такие как Alternaria, Aspergillus, Penicillium, Fusarium и Rhizopus, Mucor могут поражать как живые растения, так и хранить продукты, что приводит к экономическим потерям и снижению продовольственной безопасности [Phuong-Anh Nguyen, Caroline Strub, Angélique Fontana, Sabine Schorr-Galindo, Crop molds and mycotoxins: Alternative management using biocontrol, BiologicalControl,Volume 104,2017,Pages 10-27,https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2016.10.004]. Так, известно, что плесневые грибы рода Alternariaявляются распространенными в почве, или в растительных остатках. Некоторые виды альтернарий являются возбудителями заболеваний растений, которые наносят экономически существенный ущерб большому количеству важных сельскохозяйственных культур: зерновые, масличные, капуста, брокколи, морковь, картофель, яблоки, и другие [Thomma, B.P.H.J. (2003), Alternariaspp.: fromgeneralsaprophytetospecificparasite. MolecularPlantPathology, 4: 225-236. https://doi.org/10.1046/j.1364-3703.2003.00173.x].

Плесени рода Alternariaвызывают заболевания, преимущественно, поражая листья растения, снижая фотосинтетический потенциал. Инфекция приводит к образованию некротических очагов. Кроме того, некоторые виды Alternariasp. проникают в ткани и вызывают заболевания только при ухудшении внешних условий [Thomma, B.P.H.J. (2003), Alternariaspp.: fromgeneralsaprophytetospecificparasite. MolecularPlantPathology, 4: 225-236. https://doi.org/10.1046/j.1364-3703.2003.00173.x]. В том же источнике приведены сведения о том, что грибы Alternariasp. способны к биосинтезу таких ферментов, как кутиназы (способствуют разложению кутина – пролиэфира гидроксилжирных кислот - в кутикуле растения), липазы, галактозидазы, эндоглюканазы и других, которые способствуют развитию фитопатологий, или порче продуктов [Thomma, B.P.H.J. (2003), Alternariaspp.: fromgeneralsaprophytetospecificparasite. MolecularPlantPathology, 4: 225-236. https://doi.org/10.1046/j.1364-3703.2003.00173.x].

Плесневые грибы, кроме фитопатологий, могут вызывать заболевания человека и животных. В том числе, за счет способности к биосинтезу микотоксинов. Накапливаясь в таких сельскохозяйственных продуктах, как зерно, крупы, орехи, фрукты и т.п., при их хранении, токсины в разных дозах или в течение длительного времени могут вызывать острые заболевания в виде почечной или печеночной недостаточности и другие [Bhunia, A.K. (2018). Molds and Mycotoxins. In: Foodborne Microbial Pathogens. Food Science Text Series. Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7349-1_8]. В источнике приведены три основных механизма действия микотоксинов: мутагенный, тератогенный и канцерогенный [Bhunia, A.K. (2018). Molds and Mycotoxins. In: Foodborne Microbial Pathogens. Food Science Text Series. Springer, NewYork, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7349-1_8].

Таким образом, плесневые грибы, включая Alternariasp., являясь распространенными в природе, способны вызывать заболевания растений, человека и животных за счет способности к биосинтезу ферментов и микотоксинов. В совокупности с другими факторами, плесневые грибы являются угрозой продовольственной безопасности. В сельском хозяйстве существует ряд методов борьбы с плесенью, среди которых – фунгициды биологического происхождения, которые основаны на микроорганизмах и их метаболитах. Биологические средства защиты растений (БСЗР) противопоставляются чрезмерному использованию средств химического происхождения, так как, несмотря на то, что они снижают потери урожая, их применение приводит к появлению устойчивости патогенов и ущербу биоразнообразию почвы [Fenta, Lamenew, Mekonnen, Habtamu, Microbial Biofungicides as a Substitute for Chemical Fungicides in the Control of Phytopathogens: Current Perspectives and Research Directions, Scientifica, 2024, 5322696, 12 pages, 2024. https://doi.org/10.1155/2024/5322696].

Материалы и методы

Для выделения цикла биологического азота производили сбор материала в стерильные контейнеры, которые герметично закрывались и не вскрывались до посева на питательные среды. При выявлении микроорганизмов, были использованы классические методы выделения и культивирования.

Для выделения чистых культур использовали основной порядок выделения микроорганизмов: подготовили питательные среды, посуду и вспомогательный инвертарь; для этого стерилизовали среды автоклавированием при 115°С в течение 30 мин; подготовили посевной материал; пробу в сыпучей форме, массой 0,1 г, суспендировали в стерильном 0,9% растворе (NaCl), перемешали и отобрали 500 мкл, внесли в жидкие питательные среды, посевы инкубировали при 25°С с перемешиванием, в течение 7 суток, для получения накопительной культуры. Для получения чистой культуры использовали метод Коха. Выделения цикла биологического азота использовали питательные среды: для азотфиксирующих бактерий эшби без микроэлементов состав (г/л): глюкоза - 20,0; K₂HPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; K₂SO₄ - 0,2; СаСО₃ - 5,0; агар микробиологический - 20,0; для нитрифицирующих микроорганизмов первой фазы использовали питательную среду Виноградского: (NH₄)₂SO₄ - 2,0; К₂НРО₄ - 1,0; MgSO₄ - 0,5; NaCl - 0,4; FeSO₄7Н₂О - 0,4; MgCO₃ или СаСО₃ - 5,0; агар микробиологический - 20,0; для представителей нитрифицирующих бактерий второй фазы: NaNO2 - 1,0; Na₂CO₃(безводный) - 1,0; NaCI - 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄7H₂O - 0,5; FeSO₄7H₂O - 0,4; агар микробиологический - 20,0); группу денитрифицирующих бактерий выделяли с использованием среды Березовой состав (г/л): цитрат K или Na (трехзамещенный)-5,0; KNO₃ - 2,0; аспарагин-1,0; KH₂PO₂ - 2,0; MgSO₄7H₂O - 2,0; CaCO₂6H₂O - 0,2; FeCl3H₂O – следы; агар микробиологический - 20,0 (Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М. А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.).

Окраска по Грамму, на споры и подвижность проводили стандартными методами (Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М. А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.)

Для определение оптимальной температуры была взята накопительная культура микроорганизмов, штамм вносился в 100 мл ранее подготовленной питательной среды (состав г/л: пептон - 10,0; дистиллированная вода – 1000 мл). Далее колбы с засеянной культурой инкубировались при разных температурах в течении 24 часов (4℃ ;20℃ ;25℃ ;30℃ ;35℃; 40℃). Оценку оптимальной температуры производили с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность, на последний день инкубации (Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М. А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.).

Оценку противогрибковой активности выделенных культур производили диско диффузным методом (ДДМ) (Приложение 1). Оценивали при совместном культивировании на агаризованной питательной среде по степени подавления роста плесневого гриба Alternaria brassicicola BKM F-1864. Для этого, бактерии пассировали на агаризованную среду – 1 % пептон - «газоном». Затем использовали стерильное пробочное сверло для вырезания дисков агара с выросшей культурой и помещали их в стерильные чашки Петри, содержащие среду Сабуро (состав: пептон – 10,0 г/л, сахароза – 20,0 г/л, агар микробиологический – 20,0 г/л). В центре чашки размещали диск фильтровальной бумаги, пропитанный суспензией спор плесневого гриба в стерильном 0,9 % растворе NаCl (Alternaria brassicicola BKM F-1864). Посевы инкубировали при 25ºC, после инкубирования 120 часов измеряли диаметр в двух перпендикулярных направлениях. (Снегин Э.А. Практикум по биометрии: учебное пособие / Э.А. Снегин. – Белгород: ИД «Белгород» НИУ «БелГУ», 2016 – 56 с.).

Доверительные интервалы (∆) рассчитывали по формуле [Снегин Э.А. Практикум по биометрии: учебное пособие / Э.А. Снегин. – Белгород: ИД «Белгород» НИУ «БелГУ», 2016 – 56 с]:

∆ = t_st · m, (2)

где t_st – стандартное значение критерия достоверности Стьюдента, m – ошибка репрезентативности среднего арифметического значения, которая вычисляется по формуле [Снегин Э.А. Практикум по биометрии: учебное пособие / Э.А. Снегин. – Белгород: ИД «Белгород» НИУ «БелГУ», 2016 – 56 с]:

, (3)

где σ – среднее квадратическое отклонение и рассчитывается как [Снегин Э.А. Практикум по биометрии: учебное пособие / Э.А. Снегин. – Белгород: ИД «Белгород» НИУ «БелГУ», 2016 – 56 с]:

, (4)

где V – дата, М – среднее арифметическое значение lg(КОЕ/г), n – объем выборки.

Относительную погрешность измерения рассчитывали с использованием формулы [Снегин Э.А. Практикум по биометрии: учебное пособие / Э.А. Снегин. – Белгород: ИД «Белгород» НИУ «БелГУ», 2016 – 56 с]:

, (5)

где М – среднее арифметическое значение, а m ошибка репрезентативности среднего арифметического значения.

Погрешность считали несущественной если она была меньше 3%. Выше, но ниже 5% - удовлетворительной, а выше 5% - высокой.

Результаты и их обсуждение

Цикл биологического азота был выделен из мха (Sphágnum), взятый на территории Белгородской области, расположенной на стыке двух климатических зон: лесостепной и степной. Рельеф местности – долинно-балочный; климат –умеренно-континентальный.Координаты места сбора: 50.592166 с.ш., 36.583486 в.д. С помощью специализированных питательных сред мы выявили ряд культур микроорганизмов (Таблица 1)

Таблица 1

Выденые изоляты и их морфология

3.3. Оценка ростовых свойств изолята при различных значениях температуры

Одной из основных целей исследования было выявление оптимальной температуры роста бактерий через вычисление оптической плотности.

Микроорганизмы, взятые с питательной среды Эшби, были засеяны на богатые питательные среды и помещены в термостат при определенных температурах на сутки (24 часа). Для исследования нами были выбраны температуры 4, 25,30,35 и 40 °С (Таблица 2).

Таблица 2

Минимум, максимум и оптимум температуры для роста изолята

По результатам исследования выявили, что оптимальной температурой роста микроорганизмов является 35°С, следовательно, их можно отнести к группе мезофилов.

3.4. Оценка противогрибковой активности изолята в отношении плесневого гриба AlternariabrasiciccolaBKMF-1864

Средний диаметр плесневых колоний рода Alternariaв контроле (рис.1) составлял 4,53±0,55 см (Приложение 2).

Рисунок 1. Средний диаметр плесневых колоний рода Alternariaв контроле

Средний диаметр плесневых колоний рода Alternariaв опыте (рис.2) составлял 2,65±0,18 см (Приложение 3-4).

Рисунок 2. Средний диаметр плесневых колоний рода Alternariaв опыте.

Таким образом, мы видим, что даже с учетом доверительных интервалов, наблюдается значительное подавление роста плесневых колоний рода Alternariaпод действием метаболитов выделенного изолята по сравнению с контролем. Метаболиты бактериальных колоний уменьшили диаметр плесневых колоний рода Alternariaна 52,37% по сравнению с контролем.

Заключение

Таким образом мы выделили культуру микроорганизмов, способную выделять метаболиты, подавляющие рост плесени. В нашей (Белгородской) области - это важно для защиты крестоцветных растений, в частности таких культур, как капуста (Brassica), горчица (Sinapis), рапс (Brassica napus) и т.д.

Список используемых источников

1. Авраменко, П. М. Природные ресурсы и окружающая среда Белгородской области : учеб. пособие / П. М. Авраменко, П. Г. Акулов, Ю. Г. Атанов, В. Н. Шевченко и др., под ред. С. В. Лукина. – Белгород: Белгор. гос ун-т, 2007. – 556 с.

2. Бактериальный виолацеин: свойства, биосинтез и перспективы применения, Н.С. Ляховченко, В.М. Травкин и др. / ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2022, том 58, № 6, с. 568–577.

3. Нетрусов, А.И. Микробиология: теория и практика : учебник для вузов / А. И. Нетрусов, И. Б. Котова. – Москва : Издательство Юрайт, 2025. – 676 с.

4. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др. Экология микроорганизмов: учеб. для студ. вузов / Под ред. Нетрусова А.И. – М. : Издательский центр «Академия», 2004. – 272 с.

5. Основы научных исследований в агрономии / В.Ф. Моисейченко, М.Ф. Трифонова, А.X. Заверюха, В.Е. Ещенко. — M.: Колос, 1996. –336 с.

6. Снегин Э.А. Практикум по биометрии: учебное пособие / Э.А. Снегин. – Белгород: ИД «Белгород» НИУ «БелГУ», 2016 – 56 с.

7. A Blue-Purple Pigment-Producing Bacterium Isolated from the Vezelka River in the City of Belgorod / Nikita S. Lyakhovchenko, Tatiana N. Abashina, Valentina N. Polivtseva, Vladislav Yu. Senchenkov, Daniil A. Pribylov, Anna A. Chepurina, Ilja A. Nikishin, Alina A. Avakova, Michael A. Goyanov, Elizaveta D. Gubina, Daria A. Churikova, Alexander A. Sirotin, Nataliya E. Suzina and Inna P. Solyanikova, Microorganisms 2021, 9, 102, 1-19.

8. Bacteriostatic Activity of Janthinobacterium lividum and Purified Violacein Fraction against Clavibacter michiganensis / Nikita S. Lyakhovchenko, Viktoria A. Efimova, Evgeniy S. Seliverstov, Alexander A. Anis’kov and Inna P. Solyanikova, Processes 2024, 12, 1116. 1-23.

9. Dobrzy´nski, J.; Jakubowska, Z.; Kulkova, I.; Kowalczyk, P.; Kramkowski, K. Biocontrol of fungal phytopathogens by Bacillus pumilus. Front. Microbiol. 2023, 14, 1194606.

10. Hoshino T. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 91. № 6. P. 1463–1475.

11. Martyanov S.V., Letarov A.V., Ivanov P.A., Plakunov V.K. // Microbiology. 2018. V. 87. № 3. P. 437–440.

Приложения

Приложение 1

Приложение 2

Приложение 3

Приложение 4