XXIV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Приготовление фиксированных препаратов микроорганизмов

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Чадалина П.А. 1

---

1МБОУ "СОШ № 46" г. Калуга

Шелдагаев Ю.В. 1

---

1МБОУ "СОШ № 46" г. Калуга

Работа в формате PDF

817.5 KB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Микробиологические исследования - это процесс анализа биологических материалов с целью выявления микроорганизмов, которые могут вызвать заболевание. 

Микробиологические исследования проводятся по следующим причинам:

• Диагностика инфекционных заболеваний

• Профилактика заражений.

• Выбор терапевтических препаратов.

Актуальность

При изучении различных разделов биологии важной частью учебного процесса является ознакомление учащихся с микропрепаратами. Однако зачастую кабинеты недостаточно оснащены ими, или их качество не позволяет получить четкие представления об изучаемых объектах. Достаточно часто можно заметить, что со временем препараты обесцвечиваются, а их длительное и не всегда бережное использование приводит к появлению трещин и сколов. В то же время, обновление и пополнение имеющегося ассортимента микропрепаратов за счет препаратов промышленного производства не всегда является возможным ввиду их дороговизны, а также элементарного отсутствия необходимого материала на рынке. В связи с этим было принято решение изготовить фиксированные препараты патогенных микроорганизмов под контролем врача бактериолога в клинико-диагностической лаборатории Калужской областной клинической больницы,

Цель: познакомиться с работой клинико-диагностической лабораторией КОКБ, освоить методику приготовления фиксированных микропрепаратов.

Задачи:

• подобрать и изучить литературу по микробиологии;

• посетить клинико-диагностическую лабораторию КОКБ, познакомиться с оборудованием лаборатории, с методами клинических исследований;

• познакомиться с методиками основных этапов микробиологических исследованием: посевом биоматериала на питательную среду, выделением культуры микроорганизмов, определением штаммов патогенных микроорганизмов;

• освоить методику приготовления фиксированных микропрепаратов и приготовить микропрепараты болезнетворных бактерий и грибов.

Объект исследования: патогенные микроорганизмы.

Предмет исследования: определение видовой принадлежности штаммов патогенных микроорганизмов и приготовление их фиксированных микропрепаратов.

Гипотеза: правильно приготовленный, фиксированный и окрашенный препарат микроорганизмов поможет учащимся в изучении строения различных штаммов бактерий.

Продукт: фиксированные препараты микроорганизмов.

Методы и методики исследования

- обобщение справочной и научной литературы по проблеме исследования;

- экспериментальные – микроскопический метод, техника изготовления микропрепаратов;

- наблюдение, анализ, синтез;

- фотографирование.

Глава 1. Теоретическая часть. Обзор литературы

1.1.Понятие о бактериологической лаборатории

Бактериологическая лаборатория− научно-практическое учреждение, выполняющее бактериологические, иммунологические и другие микробиологические исследования. Различают медицинские, ветеринарные и промышленные бактериологические лаборатории. Медицинские бактериологические лаборатории организуются при больницах, санитарно-эпидемиологических станциях и т.п. для проведения исследований в целях уточнения диагнозов и санитарно-эпидемиологического контроля.

Для проведения посевов в асептических условиях бактериологические лаборатории оснащаются специальными застекленными боксами, оборудованными ультрафиолетовыми лампами.

Бактериологической лаборатории необходимы: холодильник для хранения бактериальных культур, сывороток и других биологических субстратов; микроскоп с осветителем; центрифуга; термостат или термостатная комната для выращивания бактерий; аппарат для встряхивания различных смесей; автоклав, суховоздушный стерилизатор (печь Пастера) для стерилизации питательных сред, посуды и электрические стерилизаторы[2].

1.2. Требования, применяемые к бактериологическим лабораториям

При работе в бактериологической лаборатории, особенно с патогенными микроорганизмами, необходимо соблюдение следующих правил:

1. Все лица, находящиеся в бактериологической лаборатории, должны быть в спецодежде.

2. В помещении запрещаются прием пищи и курение.

3. Каждый работник должен пользоваться только своим рабочим местом.

4. Каждое исследование подлежит маркировке и регистрации в специальном журнале.

5. Весь инвентарь, находившийся в контакте с заразным материалом, подлежит стерилизации или утилизации.

6. Все операции должны производиться с соблюдением правил стерильности: все посевы проводят вблизи пламени горелки, переливание зараженных жидкостей производят над лотком с дезинфицирующим раствором и т.п. [2].

1.3. Бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование − исследование, предназначенное для выделения бактерий и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза.

Существуют следующие принципы бактериологического исследования.

1. Квалифицированный выбор материала, подлежащего исследованию.

2. Отбор проб материала для исследования в необходимом и достаточном объеме.

3. Выбор оптимального набора соответствующих питательных сред для первичного посева и накопления возбудителя с учетом характера материала, свойств искомого микроорганизма и посевных доз.

4. Соблюдение классических принципов тщательного изучения посевов.

5. Изучение фенотипических характеристик выделенных чистых культур, в первую очередь биохимических свойств с максимально возможной стандартизацией условий их определения.

6. Определение согласно классификационным таблицам таксономического положения выделенной культуры в соответствии с задачами исследования (родовой, видовой, внутривидовой принадлежности).

Глава 2. Практическая часть

2.1. Клинико-диагностическая лаборатория / Бактериологическая лаборатория

Работу над проектом начала со знакомства с клинико-диагностической лабораторией Калужской областной клинической больницы, в этой же лаборатории выполнялись все исследования.

В состав лабораторной службы входят 3 отделения:

• Отделение плановой лабораторной диагностики

• Отделение экстренной лабораторной диагностики

• Централизованная бактериологическая лаборатория

Бактериологическая централизованная лабораторияосуществляет лабораторную диагностику различных микроорганизмов, содержащихся в биологических пробах человека. Ведётся мониторинг чувствительности выделенных штаммов микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

Прошла инструктаж по техники безопасности при работе в микробиологической лаборатории,ознакомилась с оборудованием лаборатории.

В рач-бактериолог ознакомила с этапами бактериологического исследования:

- прием и регистрация биоматериала;

- посев на питательную среду;

- выделение культуры микроорганизмов;

- определение и дифференциация культур;

- анализ результата бактериологического исследования.

Рис.1. Биологический материал

Биологическим материалом для данного исследования может служить кровь, моча, слюна, мокрота и любое отделяемое из ран. Тип материала, который должен быть взят для исследования, определяется врачом с учетом предварительного диагноза пациента и вида протекающей инфекции (рис.1)

И сследуемый материал следует брать в асептических условиях в стерильную посуду и доставлять в лабораторию как можно скорее. В случае необходимости пробы следует хранить на холоде. Методика взятия проб зависит от объекта, характера заболевания и свойств микроорганизма.

Доставленный в бактериологическую лабораторию материал подлежит обязательной маркировке и регистрации (рис.2) [2].

Рис.2. Журнал регистрации

2.2. Посев биоматериала на питательную среду

К числу важнейших элементов бактериологического исследования относятся посевы и пересевы бактериальных культур, производимые бактериальной петлей или пастеровской пипеткой.

Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты − питательные среды (рис.3). На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т.д.), поэтому их еще называют «средами для культивирования» [1].

В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар.

Рис. 3. Приготовление питательных сред

Стерильные питательные среды разливают в чашки Петри и хранят в холодильнике. Перед посевом бактериологического материала чашки достают из холодильника и оставляют при комнатной температуре на 15 минут.

Посев зарегистрированного биологического материала производился в чашки Петри сразу на несколько питательных сред. На каждой чашке указывается номер биологического материала (рис.4,5).

Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции питательной среды и цели исследования.

Рис.4. 5 Посев биологического материала на различные питательные среды

З атем чашки инкубируют при температуре 37ºС в течение 18-24 часов, после чего происходит дальнейшая идентификация (Рис.6). Для роста микроорганизмов в анаэробных условиях чашки с посевами помещают в эксикатор (рис.7).

Рис.6.Термостатирование Рис.7. Эксикатор

2.3. Выделение культуры микроорганизмов

Бактериальная культура − искусственно выращиваемое на питательных

средах скопление бактерий одного вида, являющихся потомками одной бактериальной клетки.

Через сутки осмотрели все чашки Петри. На поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют или сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки.

Обращали внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. Характеристика колоний – важная составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии (приложение1, рис.1-5) [3,4,5.7,8].

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей

Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар для получения чистой культуры. Пробирки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24ºс.

2.4. Приготовление препаратов фиксированных клеток

Фиксированными считают клетки микроорганизмов, в которых прерваны жизненные процессы, но полностью сохранена тонкая структура.

Цель фиксации:

• умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными (что особенно важно при работе с патогенными микроорганизмами);

• зафиксировать (закрепить) мазок на стекле (чтобы они не смывались при окрашивании);

• улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки лучше адсорбируют на своей поверхности различные красители [6].

Из выросших подозрительных колоний мне необходимо приготовить мазки для окраски и зафиксировать их.

Для получения фиксированных препаратов важно правильно подготовить предметные стекла. Они должны быть чистыми и тщательно обезжиренными. Для проверки чистоты стекла на его поверхность наносят каплю воды. При достаточном обезжиривании капля растекается равномерно и не собирается в выпуклые, медленно высыхающие пузырьки. Берут стекла пинцетом или аккуратно за грани, так как пальцы оставляют на поверхности жирные пятна.

Приготовление фиксированных препаратов ведут в следующей последовательности.

Прокалённой и остывшей бактериальной петлёй наношу на предметные стёкла небольшую каплю дистиллированной воды. После каждой манипуляции бактериальная петля прокаливается (рис.8,9).

Рис.8. Хранение предметных стекол Рис.9. Прокаливание предметного стекла

Беру другую бактериальную петлю, прокаливаю её в пламени горелки, несколько секунд остужаю её на воздухе. Забираю небольшое количество материала с чашки Петри и растираю его на стекле в капле воды тонким слоем (рис.10,11).

Приготовленные мазки остаются на воздухе до полного высыхания. Затем осуществляю фиксацию мазков. При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Используемый метод фиксации называется физическим.

Рис.10. Забор биологического материала Рис.11. Перенос материала на стекло

Стекло с высохшим препаратом беру пинцетом и провожу три раза в верхней части пламени спиртовки, задерживая в пламени не более двух секунд (рис.12).

Остывшие и зафиксированные мазки далее подлежат окрашиванию.

Д ля выполнения окраски по Грамму я организовала своё рабочее место. Для данной методики мне необходимы следующие материалы и оборудование: пипетки, пинцет, вода дистиллированная, ёмкость для окрашивания мазков, спирт этиловый, часы песочные, фильтровальная бумага, пропитанная раствором генцианвиолета, раствор Люголя, раствор сафранина, масло иммерсионное, микроскоп

Рис. 12. Фиксация мазков

Последовательность выполнения работы по окраске микропрепаратов показана на фотографиях.

Первый этап. На зафиксированные мазки поместила фильтровальную бумагу, окрашенную генцианвиолетовым. Затем на каждую полоску нанесла по две капли дистиллированной воды на одну минуту.(рис.13,14).

Рис.13. Рис.14

В торой этап. Через одну минуту пинцетом сняла с мазков бумагу. С помощью пипетки нанесла на препараты раствор Люголя с экспозицией в одну минуту (рис.15,16)

Т ретий этап. Сливаю раствор Люголя с микропрепаратов и на мазок несколько раз наношу этиловый спирт. Происходит процесс обесцвечивания(рис.17,18).

Рис.17 Рис.18

Ч етвёртый этап. После этой процедуры препараты промыла дистиллированной водой и с помощью пипетки на несколько минут нанесла на микропрепараты раствор сафранина(рис.19.)

Рис.19

Пятый этап. Удалила остатки сафранина, промыла препараты дистиллированной водой и оставила на воздухе до полного высыхания мазков.

Н а готовые высохшие препараты по каплям добавляю иммерсионного масла, рассматриваю микропрепараты под микроскопом (увеличение7 x 90) (рис.20,21).

Рис.20. Рис.21

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

Используя методы окрашивания колоний по Граму и микроскопию, определили семейства исследуемых микроорганизмов. Обнаружены: грам + микроорганизмы - Candida, Staphylococcaceae, Streptococcaceae играм- микроорганизмы – Klebsiella, Escherichia coli. [3,4,5.7,8].

2.5. Определение и дифференциация микроорганизмов по биохимическим признакам

Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические, тинкториальные, химические, культуральные, ферментативные чтобы установить их вид.

Изучение биохимических признаков. Они определяются набором ферментов, присущих определённому роду, виду, варианту. Синтез ферментов микроорганизмов детерминируются на генном уровне. С целью идентификации б актерий с помощью питательных сред определяют: сахаролитические, протеолитические и другие ферменты, а также способность продуцировать индол, образовывать сероводород, выделять аммиак (рис.22) [3,4,5.7,8].

Рис. 22. «Пёстрый ряд»

2.6.Анализ результата бактериологического исследования

Для подбора правильного лечения рекомендуется определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным химиотерапевтическим препаратам. Важность этого анализа заключается в подборе адекватного лечения, которое вызовет качественный эффект, но не приведет к побочным реакциям.

В ыявления степени чувствительности бактерий к антибиотикам проводится несколькими методами. Один из них, метод дисков. При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности. Специальные диски фильтровальной бумаги, которые пропитанные различными растворами антибиотиков, помещаются поверх колоний микроорганизмов на питательной среде.Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков (рис.23).

Рис.23. Метод дисков

В результате, после термостатирования (нахождении питательной среды с колониями микроорганизмов при температуре 36-37 С), через определенный промежуток времени (чаще через 12-24 часа) оцениваются результаты. Проводится измерение зоны отсутствия роста бактерий вокруг дисков или наличия роста вокруг диска (рис.23).

После оценки результатов можно выделить три группы бактерий по отношению к конкретному антибиотику:

• Чувствительный микроорганизм (отсутствие роста вокруг диска). Данный антибиотик может быть успешно применен для терапии заболевания вызванных этим возбудителем.

• С относительной резистентностью (зона роста небольшая). Терапия таким лекарственным средством будет успешна только при определенных условиях.

• Резистентный (нет зоны подавления роста микроорганизмов). Применение антибиотика против данного возбудителя не дает угнетения его роста, а значит и эффективного лечения заболевания.

Врач выписывает бланк результатов анализа, в котором указывается систематическое положение выявленных микроорганизмов, предоставляет список антибиотиков и указывает чувствительность или резистентность к ним. Результат анализа поступает к лечащему врачу.

Выводы

В ходе выполнения работы все поставленные задачи были решены.

• Изучила литературу по микробиологии;

• посетила клинико-диагностическую лабораторию КОКБ, познакомилась с оборудованием лаборатории, с методами бактериологических исследований;

• познакомилась с методиками основных этапов микробиологических исследований: посевом биоматериала на питательную среду, выделением культуры микроорганизмов, определением штаммов патогенных микроорганизмов;

• освоила методику приготовления фиксированных микропрепаратов,

приготовила микропрепараты болезнетворных бактерий и грибов: Staphylococcaceae, Streptococcaceae,Klebsiella, Escherichia col, Candida(приложение 2, рис.5-9).

Микробиология - это захватывающая область науки, позволяющая нам раскрывать тайны невидимого мира микроорганизмов и их воздействие на жизнь на Земле. Её исследования способствуют медицинским открытиям и созданию инновационных технологий, улучшающих наше качество жизни. Важно помнить, что даже микроскопические микроорганизмы играют огромную роль в природе и нашем здоровье.

Используемые источники

1. Шепелин А.П., Дятлов И.А.Питательные среды для энтеробактерий.М.:Издательство «Династия», 2017.-232с.:ил.

2. Шепелин А.П.Проблемы бактериологических исследований в клиникдиагностических лабораториях/Шепелин А.П.//Справочник заведующегоКДЛ. -2013№7.-С.22-28

3. К каким бактериям относится кишечная палочка [электронный ресурс ]
https://apollonclinica.com/blog/k-kakim-bakteriyam-otnositsya-kishechnaya-palochka

4. Кандида (гриб) [электронный ресурс ]
ru.wikipedia.org›wiki/Кандида_(гриб)

5.Клебсиеллы [электронный ресурс] moodle.kstu.ru›pluginfile.php/407672/mod_resource…

6. Приготовление препаратов фиксированных клеток [ электронный ресурс ]

studfile.net›preview/2300029/page:3/

7. Стафилококки [ электронный ресурс ] ru.wikipedia.org

8. Стрептококки [ электронный ресурс ] ru.wikipedia.org›

Приложение1

Колонии бактерий на различных питательны х средах

Рис.1. Стрептококк на кровяном агаре Рис.2. Стафилококк на желточно-солевом агаре

Рис.3. Грибы на хромогенном агаре Рис.4. Кишечная палочка на кровяном агаре

Рис.5. Клебсиелла на кровяном агаре

Приложение 2

Штаммы выявленных микроорганизмов

Р ис.5. Стафилококк -Staphylococcaceae Рис.6. Кишечная палочка-Escherichia col

Р ис.7. Стрептококк - Streptococcaceae Рис.8. Клебсиелла – Klebsiella

Рис.9. Грибы Кандида- Candida