ВЛИЯНИЕ АЗОТА КАК ОДНОГО ИЗ ОСНОВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ ПРИ РАЗМНОЖЕНИИ ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO

XXIV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке

Личный портфель

ВЛИЯНИЕ АЗОТА КАК ОДНОГО ИЗ ОСНОВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ ПРИ РАЗМНОЖЕНИИ ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO

Невзорова Э.О. 1
1ТОГАОУ "Мичуринский лицей"
Янковская М.Б. 1
1ТОГАОУ "Мичуринский лицей"
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Диплом школьникаСвидетельство руководителя
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

ВВЕДЕНИЕ

Для нормальной жизнедеятельности растению необходимы минеральные вещества, которые выполняют в клетке целый ряд структурных и регуляторных функций. Минеральным питанием растений называется процесс усвоения минеральных элементов из субстрата, на котором они произрастают.

Любой организм нормально развивается только в том случае, если ему доступны вещества и энергия, необходимые для осуществления всех процессов жизнедеятельности.

Минеральное питание – один из важнейших приемов регулирования роста и плодоношения плодовых растений, повышения урожайности и качества плодов. Современные знания теории минерального питания растений являютсяосновой рационального применения удобрений, ставящих задачу получениявысоких урожаев сельскохозяйственных культур хорошего качества, целенаправленного регулирования плодородия почвы [1-3].

При разработке питательных сред в культуре in vitro рассчитывают определенные концентрации необходимых макро- и микро- элементов. При модификации, то есть изменении, минерального состава для определенных видов растений, можно несколько изменять пропорции и соотношение элементов питания. Таким образом, изолированная культура может служить хорошей моделью при изучении роли отдельных химических соединений для процессов роста и развития растений.

Исследователи, работающие с культурой тканей, указывают на значительные видовые и сортовые различия растений по потребностям к минеральному и гормональному составу среды и другим факторам культивирования. Это требует постоянного решения задачи оптимизации состава питательных сред и совершенствования методов размножения и адаптации применительно к каждой новой форме, вводимой в условия in vitro[4-8].

Таким образом, понимание специфики ответа биотехнологически размножаемых растений на модификацию питательных сред приводит к получению новых знаний о механизмах и условиях их культивирования invitro, что определяет актуальность темы проекта.

Объектом нашего исследования были растения ежевики сорта Тайберри и рябины черноплодной, размножаемые способом клонального микроразмножения на базе лаборатории биотехнологии «Агрокуб», а его предметом – влияние недостатка и избытка азота на эффективность размноженияэксплантов и их развитие.

Цель работы: изучить особенности процесса развитияэксплантовежевики сорта Тайберри и рябины черноплодной в зависимости от содержания азота в питательной среде, выявить оптимальные условия микроразмножения.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

  1. Ознакомиться с литературой по минеральному питанию при выращивании растений.

  2. Освоить методику работы с культурой изолированных органов и тканей растений

  3. Изучить влияние содержания азотав питательной среде на размножение и рост побегов в условиях изолированной культуры

  4. Провести анализ полученных результатов

Материалы и оборудование: стерильные микропобеги ежевики сорта Тайберри и рябины черноплодной, стерильный пинцет и скальпель, чашки Петри, спиртовка, спирт, пищевая пленка, стерильная питательная среда для укоренения.

Методы исследования: лабораторный, эксперимент, наблюдение, фотографирование, измерение, анализ

Место проведения эксперимента: ТОГАОУ «Мичуринский лицей», научно-учебная лаборатория биотехнологии сети «Агрокуб»

Теоретическая часть: МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ КАК СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД БИОТЕХНОЛОГИИ И МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Новые возможности для решения проблемы получения экологически чистой сельскохозяйственной продукции открывают современные методы биотехнологии растений. Биотехнология понимается как вид технологии, связанный с использованием биологических систем, живых организмов или их производных для изготовления продуктов или изменения технологических процессов и их практического использования. Микроклональное размножение в культуре изолированных тканей является хорошо разработанным и широко применяемым как в нашей стране, так и за рубежом методом прикладной биотехнологии [5, 7-9].

Микроклональное размножение как способ массового размножения растений в условиях in vitro(в пробирке), позволяет получить растения, генетически идентичные исходному экземпляру, благодарявысокому коэффициенту размножения. При этом воспроизведение такого материала может идти круглый год и не зависит от погодных условий[4-9].

Условия изолированной культуры являются также хорошей моделью для изучения действия различных компонентов химических или физических на состояние, размножение и развитие эксплантов изучаемых культур.

В основе питательных сред для микроклонального размножения лежит сбалансированный наборнеобходимых дляжизнедеятельности растения питательных веществ. В их состав входят макроэлементы, микроэлементы, источники железа и кальция, углеводы и витамины.

Элементы питания необходимы в разных количествах. Они разделяются на макро- и микроэлементы, в зависимости от потребляемой концетрации. К макроэлементам относятся азот, фосфор, калий, магний, железо, кальций.

Азот - один из основных необходимых элементов питания растений.

Элемент считается необходимым, если:

– он входит в состав молекул какого-либо необходимого компонента

растений, непосредственно участвует в процессах обмена веществ и энергии, ипри его отсутствии совершение нормального жизненного цикла становитсяневозможным;

– недостаток элемента вызывает нарушение жизнедеятельности растений, которое можно устранить внесением этого элемента в питательную среду.

В почве азот находится в минеральной иорганической форме. Среди всех этих соединений, лучшими источниками азота являютсяаммонийные соли и соли азотной кислоты.

Так как азот входит в состав очень многих соединений, то при егонедостатке у растений происходят многочисленные нарушения в обменевеществ, приводящие к ухудшению роста, развития и формирования урожая.

Характерным признаком недостатка этого элемента у большинства культурявляется хлороз листьев. Он выражается в том, что нижние листьясначала становятся бледно-зелеными, потом желтыми и затем засыхают. Этовызвано нарушением синтеза хлорофилла, в состав которого входит азот.

При недостатке азота накапливаются углеводы, так как они не используются для синтеза аминокислот и других азотистых соединений. В этом случае сахара часто расходуются на синтез антоцианов, которые вызывают появление красной окраски листьев.

На растения отрицательно влияет как недостаток, так и избыток азота.

Высокие дозы азота могут вызывать ухудшение качества урожая за счетнакопления минеральных форм азота, прежде всего нитратов, уменьшениясодержания углеводов, витаминов, незаменимых аминокислот в белке, чтоснижает его биологическую ценность. Кроме того, в этих условиях возрастаетопасность полегания растений, поражения их болезнями и вредителями, снижения урожайности. Избыток азота особенно опасен при недостатке калия ифосфора [1-3, 10].

Практическая часть: МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕЭКСПЛАНТОВ ЕЖЕВИКИ И РЯБИНЫ ЧЕРНОПЛОДНОЙ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ АЗОТА В ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

2.1. Материалы и методы

Исследование проводилось на базе лаборатории биотехнологии «Агрокуб» ТОГАОУ «Мичуринский лицей».

Для приготовления маточных растворов макро- и микроэлементов в качестве необходимых составляющих питательных сред, приготовления готовых питательных сред и их стерилизации требуются соответствующим образом оборудованные помещения:

- моечная, оборудованная дистиллятором и сушильным шкафом;

- комната для приготовления питательных сред, маточных растворов;

- автоклавная.

Остальные операции и, собственно, проведение работ с растительными объектами проводят в условиях операционной комнаты, оборудованной ламинар-боксами разного типа.

После проведения операций непосредственно в ламинар-боксе сосуды с микрорастениями переносят в культуральную комнату, оборудованную кондиционером и 2-, 3-ярусными стеллажами с лампами дневного света. Люминостат подключают к реле времени, что позволяет устанавливать требуемыйфотопериод. Желательно, чтобы в культуральной комнате находился термостат с регулируемым температурным режимом.

Для размножения микрочеренковиспользовали питательную среду по прописиКворина-Лепуавра (QL)(Quoirin, Lepoivre, 1977, модифицированнаяЯкобини-СтандардиJacobini, Standardi, 1982).

В наших исследованиях мы уменьшили и увеличили дозы аммонийной и нитратной формы азота относительно базовой прописи питательной среды Кворина-Лепуавра (QL).

Варианты опыта:

1. Норма (по прописи процентное соотношение аммонийной и нитратных форм азота следующее):

NH4NO3 400 мг/л35%,

KNO3 1800 мг/л14%

Ca(NO3)21200 мг/л17, 07%

  1. Недостаток азота (уменьшение по весу на 1 литр раствора питательной среды)

NH4NO3 114, 3мг/л10%,

KNO3900мг/л7%

Ca(NO3)2 801, 4мг/л11, 4%

  1. Избыток азота (увеличение массы азотных соединений в 2 раза при расчете на 1 литр раствора питательной среды)

NH4NO3 800 мг/л70%,

KNO33600мг/л28%

Ca(NO3)22400мг/л34, 2%

При приготовлении питательной среды для микроклонированияв небольшом количестве воды растворяли необходимое количество углевода, добавляли макроэлементы – 100 мл/л, микроэлементы – 1 мл/л, полученный объем доводили до 1 литра дистиллированной водой. Кислотность среды доводили до уровня pH 5, 6-5, 8, используя однонормальный раствор щелочи (NaOH), который добавляли по каплям, сверяясь с показаниями рН-метра. Затем в плоскодонные колбы (0, 5 л. ) насыпали по 4 г агара и разливали в них приготовленную питательную среду. Каждую колбу закрывали фольгой и пергаментной бумагой и автоклавировали готовые среды в течение 30 минут при давлении в 1 атм.

На следующем этапе в расплавленный питательный раствор добавляли витамины и регуляторы роста и готовую среду разливали по стерильным культуральным сосудам (примерно 70 мл среды на колбу объемом 250 мл). Затем в условиях ламинар-бокса хирургическим скальпелем вычленяли верхушечные части побега с 2-3 узлами и при помощи пинцета высаживали по 6-8 эксплантов в колбы с разлитой средой. Колбы закрывали алюминиевой фольгой и заматывали пищевой пленкой.

Культивирование проводили при световом режиме 16/8, температуре 21-22 ºC и освещенности 2000-2500 люкс.

Зависимыми переменными в опыте являлись длина побегов и количествопобегов на один эксплант(коэффициент размножения).

Эксперимент проводился в трехкратной повторности, учет показателей роста и размножения вели еженедельно. Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли методами описательной статистики в программной среде MicrosoftExcel.

2. 2. Результаты опыта и их обсуждение

Культивирование эксплантов ежевики и черноплодной рябины на среде с недостатком и избытком азота показало видовую специфичность изучаемых культур. Первые учеты, как числа новообразованных побегов, так и их длины не показали четкую закономерность. Анализ результатов можно было сделать только после месяца культивирования. Коэффициент размножения у эксплантов ежевики заметно отличался во всех вариантах опыта и ожидаемо был выше на среде с содержанием азота по прописи и составил 2, 6 побега на эксплант. Самый низкий показатель размножения отмечен при уменьшении содержания азота вдвое - 1, 25 побега на эксплант. А при повышенном содержании азота, коэффициент размножения составил в среднем 2 побега на эксплант (Рисунок 1).

Рисунок 1. Влияние содержания форм азота на размножение эксплантов

ежевики сорта Тайберри

Хотя у эксплантов черноплодной рябины в контрольном варианте также был наибольший показатель, однако, между вариантами с недостатком и избытком азота разница небольшая и статистически недостоверная, учитывая стандартное отклонение. В численном значении по вариантам показатель составил соответственно: 7, 9; 7 и 2, 1 побега на эксплант (Рисунок 2).

Рисунок 2. Влияние содержания форм азота на размножениеэксплантов

черноплодной рябины

Анализ подсчета средней длины побега выявил, в общем, похожую тенденцию. Однако здесь у изучаемых культур различия в контрольном варианте и варианте с избыточным содержанием азота минимальны. У побегов ежевики наблюдается резкое уменьшение длины побегов при недостатке азота и составляет 2, 1 мм против 7-8 мм в других вариантах (Рисунок 3).

Снижение показателя роста побегов у эксплантов черноплодной рябины не столь критично и составляет 16 мм против 25-27 мм в варианте с избытком азота и в контроле (Рисунок 4).

Рисунок 3. Влияние содержания форм азота на рост новообразованных

побегов ежевики сорта Тайберри

Рисунок 4. Влияние содержания форм азота на рост новообразованных

побегов черноплодной рябины

Обращают на себя внимание различия в общем состоянии микропобегов ежевики и черноплодной рябины. Наблюдается пожелтение нижних листьев и слабый рост у ежевики в варианте с недостатком азота и некоторая деформация листьев при его избытке по сравнению с контрольным вариантом. У эксплантов черноплодной рябины отличия несущественны, имеется небольшое пожелтение нижних листьев при недостатке азота. Однако общее состояние намного улучшилось после 2х месяцев культивирования (Приложение1).

ВЫВОДЫ

Выявлена зависимость основных показателей роста и развития микропобегов различных культур в условиях in vitro. Недостаток азота снизил коэффициент размножения изучаемых культур в 2 раза. Влияние недостатка и избытка азота в минеральном составе питательной среды подтверждается литературными данными о нарушениях азотного питания в открытом грунте.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный нами опыт наглядно продемонстрировал зависимость роста и размножения эксплантов в условиях изолированной культуры от концентрации одного из основных элементов питания в базовой среде культивирования. Конечно, не нужно забывать о том, что уменьшая или увеличивая содержание азота разных его форм, мы уменьшали содержание калия и кальция. Но основное действие на размножение и рост побегов оказал все- таки азот.

Хорошо проявилась видоспецифичность изучаемых культур. Наибольшее влияние дисбаланс в содержании азота оказал на микрочеренки ежевики. Зависимость от данного элемента у черноплодной рябины гораздо менее выражена.

Проведенный опыт продемонстрировал необходимость полноценного сбалансированного состава питательной среды при микроклональном размножении. Однако, для каждой культуры все-таки возможна некоторая модификация, то есть изменения минерального состава среды для достижения наилучшего эффекта. Подтверждается возможность использования изолированной культуры для отработки баланса минерального питания растений.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Михайлова Л. А. , Субботина М. Т. , Алешин М. А. // Удобрение и диагностика минерального питания плодово-ягодных культур: учебное пособие, Пермь, 2019. С. »

  2. Самсонова Н. Е. //Основы минерального питания растений и технологий применения удобрений: учебное пособие, Смоленск, 2021.

  3. Кондаков А. К. , Трунов Ю. В. , Грезнев О. А. , Сироткина О. А. , Трунов А. А. // Современная система минерального питания и удобрения плодовых и ягодных растений; Земледелие и растениеводство, НТП, Достижения науки и техники АПК, № 2, 2009.

  4. Высоцкий В. А. Некоторые итоги и перспективы использования методов культуры изолированных тканей и органов в садоводстве // История, современность и перспективы развития садоводства России: Матер. междунар. конф. , Москва, 15-17 ноября 2000 г. – М. , 2000. – С. 163-191.

  5. Тимофеева О. А. , Невмержицкая Ю. Ю. Клональноемикроразмножение растений: Учеб. методич. пособие. – Казань, 2012. – 56 с.

  6. Упадышев М. Т. , Высоцкий В. А. Размножение ежевики и малины черной методом культуры тканей//Садоводство и виноградарство. - 1991. - №6. – С. 24-27.

  7. Катаева Н. В. , Бутенко Р. Г. Клональноемикроразмножение растений. -М. : Наука, 1983. -96 с.

  8. Высоцкий В. А. Клональноемикроразмножение растений// Культура клеток растений и биотехнология. - М. : Наука, 1986. -С. 91-102.

  9. Муратова С. А. , Шорников Д. Г. , Янковская М. Б. Размножение садовых культур invitro: методические рекомендации. – РАСХН, ВНИИГиСПР им. И. В. Мичурина. Мичуринск-наукоград РФ, 2008. – 68 с.

  10. Сабинин Д. А. //Избранные труды по минеральному питанию растений; Москва, 1971. Стр 214-230

Приложение № 1.

     

Пересадка эксплантов на селектируемые среды. Работа в условиях ламинар-бокса.

   

1 2

Состояние эксплантов на среде с повышенным содержанием азота

  1. Деформация (витрификация) листьев ежевики

  2. Изменение окраски листа и дальнейший некроз листьев черноплодной рябины.

   

1 2

Состояние эксплантов на среде с уменьшенным содержанием азота через 2 месяца культивирования.

  1. Некроз листьев ежевики

  2. Небольшой хлороз нижних листьев у черноплодной рябины

Просмотров работы: 5