Использование методов генетической паспортизации на сортах вишни

XXV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке

Личный портфель

Использование методов генетической паспортизации на сортах вишни

Денисламова М.С. 1
1МАОУ Гимназия №9
Киселева О.А. 1
1УрФА НИЦ УрО РАН, фонд Золотое сечение
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Диплом школьникаСвидетельство руководителя
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Введение

Актуальность

Агрогенетика – очень популярная в данное время наука, из-за неисчерпаемой проблемы недостатка пищевых ресурсов. Для паспортизации сортов используются разные методы и в том числе – молекулярно-генетические.

Проблема

Существует недостаточно данных для паспортизации местных сортов с помощью молекулярно-генетических методов. Необходимо апробировать на гибридах вишни существующие методы паспортизации и получить точные молекулярные признаки отдельных сортов.

Объект исследования:

Генотип 8 сортов вишни

Предмет исследования

Генетическое разнообразие сортов вишни и его проявление при молекулярно-генетических исследованиях.

Цель

Проверить применимость метода анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей для генетической паспортизации на сортах вишни.

Задачи

  1. Изучить используемый метод генетической паспортизации

  2. Выделить ДНК из сухих листьев вишни

  3. ПровестиПЦРспраймерамиPaw S5, Paw S6, Paw S11, Paw S16

  4. Провести электрофорез, сравнить полученные результаты.

Гипотеза

С помощью метода анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей можно успешно проводить генетическую паспортизацию сортов вишни.

Методы

  1. Выделение ДНК на колонках с помощью коммерческого набора «Набор D-Plants для выделения ДНК из растений» (ООО Биолабмикс)

  2. Постановка ПЦР с помощью набора

  3. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле с этидиум бромидом.

  1. Основная часть

1.1. Теоретическая часть

      1. Генетическая паспортизация и зачем она нужна

На сегодняшний день технологии выявления молекулярных или ДНК-маркеров становятся важной частью селекции растений и получают все более широкое применение по всему миру. Их использование позволяет точно и быстро определять генетическое разнообразие популяций, подвидов, видов, и даже разделять более высокие таксономические ранги - рода и семейства, а также делает возможным использование генетического фингерпринтинга ("отпечатков пальцев") сортов, и эффективно, с точки зрения затрат, определять хозяйственно-ценные признаки еще на начальном этапе селекции на уровне ДНК. Эти же методы могут стать основой для генетической паспортизации сортов, линий и гибридов различных культурных растений.

Исследование и сохранение генетических ресурсов культурных растений – ключевой момент устойчивого развития сельского хозяйства любой страны. Потеря таких ресурсов, а как следствие, и генетического разнообразия, является непривлекательной перспективой современности [4]. Большинство экономически развитых стран выделяют огромное количество финансовых средств для сохранения генетических ресурсов как дикорастущих растений, так и культурной флоры.

В настоящее время важной составляющей при создании новых сортов культурных растений является их генетическая паспортизация, в основе которой лежит ДНК-фингерпринтирование (DNA fingerprinting) – совокупность методов создания генетических "отпечатков пальцев", основанных на анализе полиморфизма ДНК. В России, да и в мире, современные стандарты селекции и семеноводства также предполагают генетическую паспортизацию новых сортов культурных растений. Паспортизация сортов нужна, к примеру, при сертификации и коммерческом распространении семян. Однако методы, лежащие в основе генетической паспортизации, могут быть успешно применены селекционерами и при селекционной работе, например, для раннего выявления генетических маркеров ценных фенотипических признаков, а также для закрепления и сохранения селекционных достижений. Методы генетической паспортизации также применяются по всему миру в семеноводстве и при проверке закупаемых партий семян на соответствие заявленному сорту, так как случаи мошенничества в этой области встречаются нередко. В России, как и во всем мире, для паспортизации сортов культурных растений продолжают применять методы электрофоретического определения полиморфизма белков [2],[10]. Однако белковые маркеры на сегодняшний день считаются устаревшими из-за большого числа недостатков и их все реже используют при генетическом анализе культурных растений [12]. Более перспективными представляются методы генетической паспортизации сельскохозяйственных растений, основанные на ДНК маркерах. В течение последних нескольких лет в России также наблюдается переход паспортизации сортов от анализа белкового полиморфизма на систему выявления полиморфных локусов ДНК [1]. К сожалению, в России селекция культурных растений до сих пор чаще всего выполняется исключительно по фенотипическим признакам, из-за чего тратится огромное количество времени для создания новых сортов. Для повышения эффективности селекционной работы и уменьшения необходимого для создания сорта времени представляется актуальным использование современных методов генетического анализа. При умелом сочетании 70 ДНК-маркеры растений 71 фенотипических и генотипических методов время необходимое для получения новых сортов культурных растений может быть уменьшено в разы.

На сегодняшний день насчитывается несколько десятков типов молекулярных маркеров. Наиболее широко используемые ДНК-маркеры для изучения генома растений:

  1. RFLP – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

  2. SSR – простые повторяющиеся последовательности (микросателлиты)

  3. STS – нуклеотидные последовательности, характеризующие локус

  4. SCAR – нуклеотидная последовательность, характеризующая амплифицированную область

  5. SSCP – конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК

  6. CAPS – расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности

  7. RAPD – случайно амплифицированная полиморфная ДНК

  8. ISSR – межмикросателлитный полиморфизм

  9. IRAP – полиморфизм амплифицированных последовательностей между ретротранспозонами

  10. AFLP – полиморфизм длины амплифицированных фрагментов

  11. SSAP – полиморфизм специфично амплифицированных последовательностей

  12. SNP – однонуклеотидный полиморфизм

  13. DarT – ДНК-чиповая технология для изучения генетического разнообразия

В своем исследовании я использовала метод с использованием RAPD-маркеров (англ. Random Amplified Polymorphic DNA) - случайно амплифицированная полиморфная ДНК, ввиду умеренной простоты и стоимости использования этого метода.

Основными инструментами для выявления ДНК-полиморфизма на уровне нуклеотидных последовательностей можно считать три базовых метода: рестрикционный анализ (с 1974 г.), полимеразная цепная реакция (ПЦР) (с 1988 г.) и секвенирование (с 1977 г.) [3]. Если в 90-е годы прошлого века и в начале XXI века в основном использовались методы, основанные на ПЦР, то на сегодняшний день наблюдается рост популярности методов изучения SNP (ДНК-чипы), а также применяют методы прямого секвенирования отдельных участков ДНК. Можно предполагать, что при существенном полногеномного снижении секвенирования, стоимости именно эта методика может стать основой генетического анализа и паспортизации в обозримом будущем. Однако на сегодняшний день до сих пор более частое применение находят методы, основанные на ПЦР, ввиду их дешевизны и простоты.

В своём исследовании я тоже использовала метод, основанный на ПЦР.

      1. Разнообразие изученных сортов

  1. Задумка

Происхождение: Родничок × Тамбовчанка.

Сорт зимостойкий, засухоустойчивый, плодоношение ежегодное, 8-10 кг/дерева (110 ц/га) [7].

  1. Вита

Происхождение: Родничок × (Эффектная + Сюрприз + Россошанская черная + Крупноплодная).

Сорт зимостойкий, плодоношение ежегодное 8-12 кг/дерева, (134 ц/га), устойчив к коккомикозу [7].

  1. Максимовская

Происхождение: отбор сеянцев вишни степной

Сорт самобесплодный зимостойкий, универсального назначения, с высоким урожаем [6].

  1. Лотос

Происхождение: неизвестно

Сорт технический, зимостойкий, урожайность средняя, но регулярная, устойчив к плодовым гнилям [8].

  1. Нимфа

Происхождение: неизвестно

Сорт среднеранний, зимостойкий [8].

  1. Мечта Зауралья

Происхождение: Любская × вишня степная.

Сорт зимостойкий, засухоустойчивый, плодоношение ежегодное 10-15 кг/дерева (150 ц/га) [7].

  1. Черешневка

Происхождение: Магалебская

Сорт быстрорастущий, очень раннего срока созревания, устойчив к монилиозу [5].

  1. ТС-3

Происхождение: Жуковская

Сорт зимостойкий (до -40 градусов), устойчив к коккомикозу, монилиозу [8].

    1. Практическая часть

      1. Выделение ДНК

Образцы сортов пронумеровали:

  1. Задумка

  2. Вита

  3. Максимовская

  4. Лотос

  5. Нимфа

  6. Мечта Зауралья

  7. Черешневка

  8. ТС-3

Процесс выделения ДНК производился в агролаборатории им. С.С.Шварца Фонда поддержки талантливых детей и молодежи «Золотое сечение». Для исследования использовался коммерческий набор «Набор D-Plants для выделения ДНК из растений» (ООО Биолабмикс), предназначенный для выделения и очистки ДНК листьев, хвои, корней, стеблей, плодов, ягод, семян и т.д.

В состав набора входят:

  1. Буфер для лизиса LB

  2. Буфер для нанесения на колонку ВВ

  3. Буфер для промывки WB

  4. Буфер для элюции ЕВ

  5. РНКаза А (раствор (10 мг/мл))

  6. Пробирки для сбора фильтрата и колонки для сорбции образца

Кроме того, было использовано оборудование, не входящее в состав набора:

  1. Термостат Dry Block BioSan TDB-100

  2. Центрифугадлямикропробирок Eppendorf Centrifuge 5425 R

  3. Центрифуга-вортекс BioSan FVL-2400N Combi-Spin (2800 об/мин)

  4. Одноканальные дозаторы Ленпипет ЛАЙТ переменного объема (1-10 мкл, 10-100 мкл, 100-1000 мкл) и одноразовые наконечники для них

  5. Микропробирки эппендорф 1.5 мл

  6. Штативы для микропробирок и наконечников

  7. Перчатки резиновые и халат

  8. Ламинарный бокс

  9. Фарфоровые чашки

  10. Фарфоровые пестики

Процесс выделения ДНК проводился в несколько этапов:

  1. Гомогенизация.

Образцы необходимо гомогенизировать для дальнейшей работы с ними. Навески образцов листьев поместили в ступки и засыпали кварцевым песком. Образцы сухих листьев гомогенизировали с помощью ступки и пестика до образования однородной зеленой массы, поместили образцы в пробирки эппендорф.

  1. Лизис гомогената.

В каждую пробирку добавили по 750 мкл буфера для лизиса LB (8 пробирок с гомогенатом образцов листьев и 4 пробирки с гомогенатом плодов), затем пробирки инкубировали в термостате в течение 10 минут при температуре 65°С, чтобы произошел лизис - разрушение клеток под действием буфера, после чего лизат центрифугировали в течение 5 минут, 12000 rcf для осаждения белков и других крупный частей клеток, оставшихся после лизиса. Полученный супернатант отобрали дозатором и поместили в чистые пробирки.

  1. Очистка ДНК (отмывка и элюция).

В каждую пробирку добавили по 5 мкл фермента РНКазы (фермент разрезает молекулы РНК, очищая полученный супернатант от РНК) и инкубировали 10 минут при 37°С (данная температура необходима для работы фермента). Добавили в пробирки равный объём буфера для нанесения на колонку ВВ, перемешали в вортексе, инкубировали 1 минуту при комнатной температуре.

Отмывка. На колонки поместили по 800 мкл раствора и центрифугировали в течение 30 с, 12000 rcf, после чего удалили фильтрат и повторили действие. Для промывки колонок на них нанесли по 500 мкл буфера для промывки WB, центрифугировали 30 с, 12000 rcf и удалить фильтрат, повторили действие промывки еще раз. После колонки центрифугировали 3 мин, 12000 rcf для окончательного удаления буфера WB.

Элюция. Для элюции ДНК (извлечение ДНК в раствор путем вымывания подходящим растворителем) колонки перенесли в новые микропробирки на 1.5 мл и плотно прижали колонки к пробиркам. На центр фильтра колонок нанесли по 200 мкл буфера для элюции ЕВ (0.01 М Tris•HCl (рн 8.0)), инкубировали 3 мин при комнатной температуре и центрифугировали 1 мин, 10000 rcf. Полученный элюат – раствор, содержащий ДНК хранили в холодильнике при -20°С.

      1. Постановка ПЦР

Состав смеси для амплификации:

  1. Праймеры: для анализа последовательностей полиморфизма использовали умеренно повторяющихся праймеры к концевым повторам ретротранспозонов семейства R 173:

Paw S5 (AACGAGGGGTTCGAGGCC),

Paw S6 (GAGTGTCAAACCCAACGA),

Paw S11 (GAATTCTTGGAAAATGTA),

Paw S16 (ACCTCTGCGCTTGGAGGC). [9]

По 0.25 мкл каждого из используемых видов

  1. Мастермикс Биомастер HS-Taq ПЦР-color (ДНК-полимераза, dNTP, MgCl2, DMSO, BSO) – 5 мкл

  2. ДНК-матрица – 1 мкл

  3. Вода – оставшийся обьем

  4. Общий обьем смеси – 10 мкл на каждый эппендорф

Режимы амплификации [9]

  1. Режим амплификации №1

Праймеры S5+S6+S11+S16

  1. 94,0 ℃ - 4 мин – 1 цикл

  2. 94,0 ℃ - 45 с – 20 циклов

56,0 ℃ - 45 с

72,0 ℃ - 180 с

  1. 94,0 ℃ - 45 с – 15 циклов

45,0 ℃ - 45 с

72,0 ℃ - 180 с -

  1. 72,0 ℃ - 4 мин – 1 цикл

  2. 72,0 ℃ - Хранение

  1. Режим амплификации №2

Праймеры S6, S11+S16

  1. 95,0 ℃ - 5 мин – 1 цикл

  2. 95,0 ℃ - 45 с – 30 циклов

48,0 ℃ - 45 с

72,0 ℃ - 180 с

  1. 4,0 ℃ - Хранение

  1. Режим амплификации №3

Праймер S6 (1)

    1. 95,0 °C - 5 мин – 1 цикл

    2. 95,0 °C - 45 с – 30 циклов

56,0 °C - 45 с

72,0 °C - 180 с

    1. 10,0 °C – Хранение

  1. Режим амплификации №4

Праймер S6 (2)

    1. 95,0 °C - 5 мин – 1 цикл

    2. 95,0 °C - 45 с – 40 циклов

49,0 °C - 45 с

72,0 °C - 180 с

4,0 °C – Хранение

Техника безопасности

Следует использовать только одноразовые наконечники и пробирки.Не допускается использование одних и тех же наконечников при обработке различных образцов биологического материала.

Запрещается перемещение лабораторного оборудования, в том числе дозаторов, штативов, лабораторной посуды, халатов, головных уборов и пр., а также растворов реагентов из одного помещения в другое. Дозаторы, используемые при работе с набором реагентов, должны быть соответствующим образом поверены (в аккредитованных лабораториях) и промаркированы. Поверхности рабочих столов, а также помещения, в которых проводится выделение ДНК и постановка ПЦР, следует обязательно, до и после проведения работ, облучать с помощью бактерицидных установок в течение 30 минут. Использованные одноразовые принадлежности (пробирки, наконечники и др.) должны сбрасываться в контейнер для медицинских отходов, содержащий дезинфицирующий раствор. Все поверхности в лаборатории (рабочие столы, штативы, оборудование и др.) ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих/моющих средств, регламентированных санитарными правилами и нормами СанПиН 3.3686-21.

При работе с набором реагентов использовать средства индивидуальной защиты для предотвращения контакта с организмом человека. После окончания работы тщательно вымыть руки. Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками. При использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности, контакт с организмом человека исключён.

      1. Постановка электрофореза

Методика: Постановка электрофореза нуклеиновых кислот в 3% агарозном геле.

  1. Приготовление агарозного геля

Состав: 100 мл TAE буфера, 3г агарозы, 25мкл этидиум бромида. К нужному объему разведенного TAE добавляем навеску агарозы, перемешиваем, нагреваем до кипения, после остывания до 65℃ - внесение этидиум бромида.

Для заливки использовался заливочный столик с гребенками.

Этапы: Заливка формы, остывание при комнатной температуре до полного затвердевания, удаление гребенок.

  1. Электрофорез

Гель поместили в ванну для электрофореза. В полученные лунки добавили маркер длин ДНК (DNA Ladder 50+ bp) и далее по одному образцу продукта ПЦР на лунку – по 4мкл.

Включили источник тока, электрофорез проводился при 120 Вольт 45 мин

Результат наблюдался с помощью гель-дока и трансиллюминатора.

Техника безопасности

При проведении электрофореза используется опасное ядовитое вещество и концероген этидиум бромид – катергория 3 по токсичности и категория 2 по мутагенности.

Условия хранения: хранить плотно закрытым, в хoрoшo прoветриваемoм месте, в помещении под замком или в месте, доступ к которому предоставляется только для квалифицированных или уполномоченных лиц. Рекомендуемая температура хранения, указывается на этикетках.

Работать в вытяжном шкафу. Не вдыхать вещество/смесь. Избегать образования паров/аэрозолей. Работать в защитной форма, перчатках и очках.

Сменить загрязненную одежду. Рекомендуется использовать защитный крем для кожи. Вымыть руки после работы с веществом

1.3. Собственные результаты

Результаты амплификаций №1-3 оказались неудовлетворительными, ПЦР продукт получить не удалось (приложение 6). Ниже в Таблице 1 представлены результаты амплификации №4, которые позволили составить индивидуальный профиль 8 изученных сортов.

Таблица 1 Результаты электрофореза на 8 образцах с праймером RawS6

Номер образца

1

2

3

4

5

6

7

8

Количество пар оснований

 

 

 

 

 

 

 

 

800

 

 

 

 

 

 

 

 

750

 

 

 

 

 

 

 

 

700

 

 

 

 

 

 

 

 

650

  

 

 

 

 

 

 

 

600

 

 

 

 

 

 

 

 

550

 

 

 

 

 

 

 

 

500

  

 

 

 

 

 

 

 

450

 

 

 

 

 

 

 

 

400

 

 

 

 

 

 

 

 

350

 

 

 

 

 

 

 

 

300

 

 

 

 

 

 

 

 

Продуктом данного проекта является индивидуальная картина генетической изменчивости для каждого из 8 изученных сортов, а именно, индивидуальный профиль распределения ПЦР продуктов после реакции амплификации с праймером PAW S6 (табл. 1). Для получения генетического паспорта сорта этого недостаточно, поскольку на каждую группу сцепления (хромосому) необходимо несколько подобных профилей. Тем не менее, на данном этапе успешное картирование с использованием праймера PAW S6 уже достаточно для идентификации небольшой выборки, так как у каждого из 8 сортов получился индивидуальный профиль.

В дальнейшем планируется попробовать провести ПЦР с другими комбинациями данных праймеров (PAW S5, S6, S11, S16). Также можно подобрать другие праймеры для анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей. Кроме того, логично в дополнение использовать и другие методы генетической паспортизации (кроме метода RAPD-праймеров), например ISSR, SSR и прочие. После подбора системы праймеров можно исследовать большее количество сортов, гибридов, в т.ч. межвидовых, валидировать методику так, чтобы можно было определять сорт, используя генетический материал из других частей растения (например, плодов). Разработка универсальной системы паспортизации сортов гибридных вишен– глобальная задача.

Заключение

  1. Я научилась выделять ДНК, ставить ПЦР и проводить электрофорез нуклеиновых кислот. Всего я 2 раза выделяла ДНК (каждый раз из 8 образцов), 4 раза ставила ПЦР-реакцию, 2 раза проводила электрофорез.

  2. В результате проделанной работы были уточнены молекулярно-генетические признаки 8 сортов с использованием метода анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей. Данный метод остается актуальным для изучаемых сортов.

  3. Гипотеза подтвердилась. С помощью метода анализа полиморфизма умеренно повторяющихся последовательностей действительно можно успешно проводить генетическую паспортизацию сортов вишни.

  4. Продуктом данного проекта является индивидуальная картина генетической изменчивости для каждого из 8 изученных сортов, а именно, индивидуальный профиль распределения ПЦР продуктов после реакции амплификации с праймером PAW S6.

  5. В перспективе при увеличении выборки сортов и количества используемых праймеров и их комбинаций можно разработать генетические паспорта на сорта уральской селекции.

Литература

  1. Азарин К.В. Маркин Н.В., Лотник B.C., Усатов А.В. ДНК маркеры в селекции растений: учеб. пособие. Ростов-на-Дону: Издательство Южного федерального университета. 2012. С. 16.

  2. Давидчук Н.Д., Корабельская Е.М., Еремеева Н.В., Кобыльский Г.И. Полиморфизм запасных белков и использование его в семеноводстве пшеницы и ячменя // Вестник Тамбовского Государственного Университета. 2009. Т. 14. С. 116–121.

  3. Калько Г. В. ДНК-маркеры для оценки генетических ресурсов ели и сосны // Труды Санкт Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства. 2015. №4. С. 19-34.

  4. Кармен де Висенте М., Фултон Т. Использование технологии молекулярных маркеров в изучении генетического разнообразия растений: учебный модуль / Международный институт генетических ресурсов растений (IPGRI) и Институт разнообразия геномов (IGD) Корнельского Университета. 2003 372

  5. Каталог продукции. На сайте: Русские семена. URL: https://www.ruscemena.ru/product/3858/#:~:text=%D0%92%D0%B8%D1%88%D0%BD%D1%8F%20%D0%A7%D0%B5%D1%80%D0%B5%D1%88%D0%BD%D0%B5%D0%B2%D0%B0%D1%8F%20(%D0%BF%D0%BE%D0%B4%D0%B2%D0%BE%D0%B9%20%D0%92%D0%B8%D1%88%D0%BD%D1%8F%20%D0%9C%D0%B0%D0%B3%D0%B0%D0%BB%D0%B5%D0%B1%D1%81%D0%BA%D0%B0%D1%8F,4%20%D0%B3%D1%80%D0%B0%D0%BC%D0%BC%2C%20%D1%82%D0%B5%D0%BC%D0%BD%D0%BE%2D%D0%BA%D1%80%D0%B0%D1%81%D0%BD%D1%8B%D0%B5

  6. Каталог продукции. На сайте: Сады России. URL: https://sad-i-ogorod.ru/catalog/osen/plodovye/vishnya/vishnya-kustarnikovaya-maksimovskaya#tab-1

  7. Каталог продукции. На сайте: Свердловская селекционная станция садоводства - структурное подразделение ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН. URL: https://sados.ru/%D0%B2%D0%B8%D1%88%D0%BD%D1%8F-%D1%81%D0%BE%D1%80%D1%82%D0%B0-%D0%BF%D0%BE-%D1%81%D1%80%D0%BE%D0%BA%D0%B0%D0%BC-%D1%81%D0%BE%D0%B7%D1%80%D0%B5%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%8F/

  8. Помология Урала: сорта плодовых, ягодных культур и винограда / ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН; под общей ред. С.А. Макаренко. М: Наука. 2022. 506 с.

  9. Романова, О.В. Применение ДНК - маркеров для идентификации косточковых культур / О.В. Романова // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: мат. 7-ой молодеж. науч. конф., посвящ. памяти акад. РАСХН Г.С. Муромцева (Мссква, 4 апреля 2007 г.) / ВНИИСБ. 2007. - С.35-37.

  10. Смирнова Е.В. Белковые маркеры сортов и гибридов огурца и перспективы их использования в селекции и семеноводстве: дис. канд. с.-х. наук: 06.01.05. Санкт-Петербург, 2000. 84 с.

  11. Сухарева А.С., Кулуев Б.Р. ДНК-маркеры для генетического анализа сортов культурных растений // Биомика. 2018. Т.10 (1). С. 69-84. https://doi. org/10.31301/2221-6197.bmcs.2018-15

  12. Хлесткина Е.К. Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и в селекции // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17. №4/2. С. 1044–1054.

Приложения

Приложение 1

Рисунок 1

Образцы вишни

Рисунок 1 : 1 - Задумка, 2 - Вита, 3 - Максимовская, 4 - Лотос, 5 - Нимфа, 6 - Мечта Зауралья, 7 - Черешневка, 8 - ТС-3

Приложение 2

Рисунок 2

Выделение ДНК. Гомогенизация

Приложение 3

Рисунок 3

Выделение ДНК. Лизис гомогената

Приложение 4

Рисунок 4

Выделение ДНК. Очистка

Приложение 4

Рисунок 4

Эппендорфы с выделенной ДНК

Приложение 5

Рисунок 5

Проведение ПЦР

Приложение 6

Рисунок 6

Первые результаты электрофореза продуктов амплификации №2,3

Рисунок 6 : 0 - маркер длин ДНК 50+ bp, 1 - Задумка, 2 - Вита, 3 - Максимовская, 4 - Лотос, 5 - Нимфа, 6 - Мечта Зауралья, 7 - Черешневка, 8 - ТС-3

Приложение 7

Рисунок 7

Вторые результаты электрофореза продуктов амплификации №4

Рисунок 7 : 0 - маркер длин ДНК 50+ bp, 1 - Задумка, 2 - Вита, 3 - Максимовская, 4 - Лотос, 5 - Нимфа, 6 - Мечта Зауралья, 7 - Черешневка, 8 - ТС-3

48

Просмотров работы: 6