XXV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Trichoderma viride. Культивирование и исследование полезных свойств на практике

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Кинзибаева В.М. 1

---

1Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение средняя общеобразовательная школа № 1 г.Александровск-Сахалинский

Старостина О.О. 1

---

1Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение средняя общеобразовательная школа № 1 г.Александровск-Сахалинский

Работа в формате PDF

0.9 MB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

В современном мире вопросы устойчивого развития, экологической безопасности и повышения урожайности сельскохозяйственных культур становятся все более актуальными. Разработка эффективных средств защиты растений одно из составляющих сегодняшней агрокультуры. В настоящее время, большинство сельхозпроизводителей, используют химические препараты для защиты растений от болезней и вредителей. При использовании химикатов максимальный эффект достигается быстрее, что до сих пор является приоритетным в выборе средств защиты растений. Однако одной из основных проблем в растениеводстве является появление устойчивости таких микроорганизмов, как, например, плесневые грибы и бактерии, вызывающие заболевания растений, к химическим препаратам.

В этом контексте изучение микроорганизмов, способных улучшать почву, бороться с патогенами и стимулировать рост растений, приобретает особое значение. Одним из таких микроорганизмов является Trichoderma viride, гриб, обладающий уникальными полезными свойствами.

Актуальность работы: несмотря на потенциал Trichodermaviride, существует нехватка практических данных о его культивировании на сложных субстратах и полезных свойствах. Это ограничивает его широкое применение в сельском хозяйстве и биотехнологиях. Поэтому, изучение биологической активности гриба Trichodermaviride на различных субстратах и его влияние на рост и развитие растений, расширяет возможность его применения в сельском хозяйстве, в том числе и Сахалинской области.

Гипотеза: грибродаTrichoderma культивированный в условиях школьной лаборатории оказывает стимулирующее действие на рост и развитие растений, а также обладает другими полезными свойствами, возможными к применению в сельском хозяйстве.

Цель работы: подбор оптимальной питательной среды для самостоятельного культивирования и изучение некоторых полезных свойств гриба родаTrichoderma.

Задачи:

1. Изучить литературу по теме исследования.

2. Выбрать оптимальную для роста и развития гриба Trichodermaviride питательную среду для культивирования его в условиях школьной лаборатории.

3. Выделить чистую культуру и пересадить ее на перловую крупу с целью увеличения объема биопрепарата.

4. Определить влияние гриба на всхожесть, энергию прорастания и морфофизиологические параметры овса посевного (AvenaSativa).

5. Изучить способность гриба рода Trichoderma к разложению органических остатков и образованию компоста.

6. Зафиксировать результаты и сделать выводы по итогам исследования.

Объект исследования: микроскопический гриб Trichodermaviride.

Предмет исследования: биостимулирующие и деструктивные свойства гриба Trichodermaviride.

Методы исследования:

1. Поверхностное и глубинное культивирование микромицетов на различных питательных средах (ГОСТ 26670-91) [4].

2. Определение энергии прорастания, всхожести и ростовых параметров AvenaSativa согласно ГОСТ 12038-84 [3].

3. Компостирование растительных отходов с использованием Trichoderma (Алимова, 2006) [1].

Практическая значимость: Результаты исследования помогут в изучении свойств Trichodermaviride для их использования в сельском хозяйстве в качестве биофунгицида и деструктора органики для снижения химического загрязнения, что в свою очередь будет способствовать улучшению экологической обстановки.

1. Материалы и методы исследования

Объектом исследования послужили штаммы микромицетов полученные из биофунгицида на основе спорово-мицелиальной массы грибаTrichodermaveride штамм471,титрне менее1 млрд.спор/г.Изготовитель и регистрант препарата – российская производственная компания «Ваше хозяйство». (Приложение Рис.1)

Для культивирования гриба в условиях школьной лаборатории были выбраны 3 питательных среды: картофельно-глюкозная твердая среда (PDA), бобово-глюкозная твердая среда и картофельно-глюкозная жидкая среда [7].

Все среды были приготовлены в соответствии с рекомендациями АРНА (1995) и USP XXIII (1995).

Картофельно-глюкозная твердая среда.

Принцип действия: Углеводы и картофельный отвар (Beever и Bollard, 1970) ускоряют рост дрожжей и плесневых грибов, а низкий уровень значения рН частично подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры.

Состав (г/л): Картофельный отвар 4,0 (отвар из 200 г картофеля); глюкоза 20,0; агар-агар 15,0.

Среда прозрачная, желтовато-коричневого цвета.

Проведение анализа: Инокулируют среду глубинным или поверхностным методом.

Фасолево-глюкозная твердая среда готовится в точном соответствии со средой PDA. Картофель заменяется на фасоль, с предварительным вымачиванием фасоли в течение 12 часов. Инокуляция проводится как глубинным, так и поверхностным методом.

Картофельно-глюкозная жидкая среда готовится в точном соответствии со средой PDA без добавления агара. Инокуляция проводится как глубинным, так и поверхностным методом. (Приложение Рис.2)

После приготовления 3-х типов сред была проведена инокуляция Trichodermaviride поверхностным методом (ГОСТ 26670-91, 1993) [4]. Каждый посев проводился в 4-х повторностях. (Приложение Рис.3)

На 10-е сутки инкубации, после начала обильного спороношения, были отобраны два штамма микромицета и пересажены на перловую крупу глубинным методом в 6 стерильных емкостей (по 3 повторности каждого штамма).

Крупа была подготовлена в соответствии с рекомендациями: промыта, замочена на 12 часов в воде, высушена и в течение 10 минут простерилизована в микроволновке для уничтожения возможных дрожжевых спор.

Чистая культура Trichodermaviride с помощью стерильной петли была посажена методом нескольких уколов в емкость с перловойкрупой. (Приложение Рис.4)

На 10-е сутки, после обильного разрастания Trichoderma на перловке, был начат опыт по выращиванию овса посевного (AvenaSativa).

Для определения влияния Trichoderma viride на энергию прорастания и всхожесть семян использовались чашки Петри с ватными дисками. Всхожесть и энергию прорастания определяли на 4 и 7 сутки согласно ГОСТ 12038-84 (ГОСТ 12038-84, 2011). У овса к числу нормально проросших относят семена, имеющие не менее двух нормально развитых корешков размером более длины семени и росток размером не менее половины его длины с просматривающимися первичными листочками, занимающими не менее половины длины колеоптиля. Длину ростка учитывают по той его части, которая вышла за пределы цветковых чешуй [3].

На 15 день после закладки семян с помощью линейки была определена длина растений и с помощью аналитических весов их сырая биомасса.

Было сделано 4 экспериментальных закладки в 3-х повторностях по 20 семян каждая, плюс 2 контрольных образца по 20 семян каждый, для полива водой. (Приложение Рис.5)

Каждая экспериментальная закладка поливалась разведенной в воде Trichodermaviride (5 г зерновой триходермы на 100 мл воды) различной концентрации из расчета: 1 закладка – 30 мл раствора микромицета на 100 мл воды, 2 закладка – 20 мл на 100 мл воды, 3 закладка – 10 мл на 100 мл воды, 4 закладка – 5 мл на 100 мл воды. (Приложение Рис.6)

Для определения влияния Trichodermaviride на ростовые показатели AvenaSativa был начат эксперимент с высадкой растений в подготовленный грунт с поливом растений и обработкой их по листу раствором гриба, выращенным самостоятельно. Для этого было сделано 4 экспериментальных посева по 25 семян в 3-х повторностях каждый, плюс 2 контрольных посева для полива водой. Каждая экспериментальная закладка поливалась разведенной в воде Trichodermaviride в соотношениях, используемых для эксперимента по определению энергии прорастания и всхожести.

В качестве питательного грунта использовали грунт с приусадебного участка (рН 5,6). Растения выращивали в лаборатории, при естественном освещении, относительная влажность воздуха 75±3%, температура воздуха 25±2^оС. Полив осуществляли с учетом поддержания влажности почвы на уровне 60%. (Приложение Рис.7)

Ростовые параметры определяли на 21 и 28 сутки развития растения ГОСТ 12038-84 (ГОСТ 12038-84, 2011). Длину надземной и корневой систем определяли с помощью линейки. Сырую биомассу растений находили взвешиванием на аналитических весах. (Приложение Рис.8)

Для проверки компостирующих свойств Trichodermaviride (Алимова, 2006) заложили 3 повторности, где в качестве инокулята были взяты очистки картофеля и банановая кожура. В качестве контроля взяли просто увлажненные очистки. (Приложение Рис.9)

Эксперимент проводился в лабораторных условиях при естественном освещении, постоянной температуре и влажности воздуха. Для активизации микромицета субстрат поддерживался во влажном состоянии.

2. Теоретические основы исследования

Trichoderma viride, штамм 471 – одинизштаммовгриба Trichoderma viride. Род Trichoderma – анаморфа рода Hypocrea [1].

Обладает ярко выраженным фунгицидным и бактерицидным действием по отношению к фитопатогенным микроорганизмам. Обладает росторегулирующей активностью по отношению к растениям. Присутствие гриба в ризосфере растений способствует интенсификации поглощения растениями микро- и макроэлементов, стимулированию развитию на корнях азотофиксирующих бактерий [6]. Среди веществ, выделяемых Trichoderma, можно выделить глиотоксин, виридин, триходермин и другие антибиотики, которые способствуют снижению заболеваемости растений [7].

Trichoderma играет важную роль в увеличении плодородия почвы. Она питается мертвой органикой, в частности, целлюлозой, которая перерабатывается бактериями очень медленно и способствует быстрому разложению сухой органики, такой как опилки, солома, сухая ботва, листовой опад, а также трухлявой древесины, картона и пр. [11].

Исследования подтверждают перспективы использования грибов рода Trichoderma, в сельском хозяйстве. Метаболиты Trichoderma проявляют способность подавлять различные патогены, что открывает новые возможности для их использования не только в борьбе с болезнями растений, но и в других отраслях, включая производство целлюлозы и пищевую промышленность. Также отмечается использование Trichoderma в преобразовании отходов, содержащих целлюлозу, в ценные продукты, такие как глюкоза, что демонстрирует широкий спектр потенциальных применений этих грибов в сельском хозяйстве [5].

3. Результаты исследования и их обсуждение.

1. 1. Подбор питательной среды для культивирования Trichodermaviride

Для проведения эксперимента по подбору оптимальной питательной среды для самостоятельного культивирования Trichodermaviride были подготовлены 3 питательные среды в соответствии с протоколом: картофельно-глюкозная твердая среда (PDA), бобово-глюкозная твердая среда и картофельно-глюкозная жидкая среда.

Кристаллическую массу из готового биофунгицида со спорами гриба, растворили в воде и нанесли методом поверхностного культивирования. Каждая среда была взята в 4-х повторностях. Ежедневно фиксировались результаты: начало роста мицелия, начало спороношения, разрастание грибницы и изменение ее цвета.

Исходя из наблюдений мы сделали следующие выводы:

1. 1. 1. 1. Успешный рост мицелия и обильное спороношение наблюдались как на среде PDA, так и на твердой бобово-глюкозной среде.

         2. На картофельно-глюкозной жидкой среде разрастание мицелия было незначительным во всех образцах, поэтому использовать ее для разведения Trichoderma методом поверхностного культивирования в условиях школьной лаборатории неэффективно.

         3. Наибольший рост мицелия и более обильное спороношение во всех образцах Trichoderma показала на бобово-глюкозной среде, что по-нашему предположению связано с большим числом питательных веществ в ее составе.

         4. В качестве питательных сред для разведения Trichodermaviride в условиях школьной лаборатории и для домашнего разведения можно рекомендовать среду PDA и твердую бобово-глюкозную среду.

1. 2. Выделение чистой культуры Trichodermavirideи пересадка ее на перловую крупу для увеличения объема биопрепарата

Подготовленную крупу поместили в шесть стерильных емкостей. Для пересадки на перловку взяли два, отличающихся друг от друга по цвету, штамма микромицета (каждый в 3-х повторностях).

Рост мицелия можно было наблюдать уже на 2-е сутки во всех закладках. К концу 5-х суток вся поверхность крупы, во всех емкостях, была покрыта разросшимся грибом, началось активное спороношение. На 10-е сутки культивирования гриба на перловой крупе, мы стали использовать его в эксперименте по проращиванию овса посевного.

Вывод: Эксперимент показал, что перловая крупа является хорошей средой для получения большого объема биопрепарата, что в свою очередь способствует экономии денежных средств на покупку биофунгицида и дает гарантию использования живого микромицета в сельскохозяйственной деятельности.

1. 3. Определение влияния Trichodermaviride на энергию прорастания, всхожесть и морфофизиологические параметры овса посевного (AvenaSativa)

Для проведения эксперимента по изучению влияния микромицета на энергию прорастания и всхожесть, семена заложили в чашки Петри на ватные диски (по 20 семян в закладке), обработав водой (контроль) и раствором Trichoderma различной концентрации.

Было отмечено, что в контрольных образцах и в образцах с Trichoderma меньшей концентрации и энергия прорастания, и всхожесть семян были выше, чем в образцах с большей концентрацией. Прорастание семян в образцах с наименьшей концентрацией было более ранним, по сравнению с контрольным образом. Так же визуально видно, что в образцах с меньшей концентрацией более развита корневая система растений. Там, где концентрация гриба была самая большая произошло подавление развития проростков.

На 15 день после начала эксперимента измерили длину проростков и их общую биомассу для каждой повторности. Наиболее благоприятным для развития проростков оказался раствор микромицета с наименьшей концентрацией (5/100). (Приложение Табл.1)

Для изучения влияния гриба на морфофизиологические параметры высадили семена в заранее подготовленную почву (по 25 семян в закладке) и поливали их водой и раствором Trichoderma viride согласно методике проведения эксперимента.

На 4-й день эксперимента наблюдалось появление всходов в емкости, обрабатываемой раствором Trichoderma с концентрацией 5/100. На 5-й день в емкостях, обрабатываемых раствором с концентрацией 10/100, 20/100 и в контрольном образце. На 6-й день в образце с концентрацией 30/100.

Ростовые показатели растений измеряли на 21 и 28 сутки развития растения. Общую биомассу каждой закладки измеряли на аналитических весах. (Приложение Табл.2)

По итогам эксперимента можно сделать следующие выводы:

1. Раствор Trichodermaviride оказывает неоднозначное влияние на ростовые процессы AvenaSativa, его действие зависит от концентрации микромицета.

2. Наибольшую эффективность показал раствор Trichoderma с наименьшей концентрацией (5/100): самые высокие показатели энергии прорастания и всхожести семян, более раннее прорастание проростков при высадке в почву, стимулирующее влияние на развитие корневой системы и накопление сырой биомассы растений.

3. Раствор Trichoderma с концентрацией 10/100 оказал стимулирующее действие на ростовые показатели AvenaSativa, по сравнению с контрольным образцом, по ряду показателей: всхожести, длине растений и корней, величине биомассы. Однако эти показатели ниже, чем при использовании раствора с концентрацией 5/100.

4. Растворы Trichoderma с концентрациями 20/100 и 30/100 оказали подавляющее действие на ростовые показатели AvenaSativa, по сравнению с контрольным образцом.

5. Наиболее угнетающее действие на рост и развитие AvenaSativa оказал раствор микромицета с концентрацией 30/100.

1. 4. Компостирование растительных отходов с использованием Trichodermaviride

Компостирование отходов заключается в том, что в органической массе повышается содержание доступных растениям элементов питания (азота, фосфора, калия и других), обезвреживаются патогенная микрофлора и яйца гельминтов, уменьшается количество целлюлозы, гемицеллюлозы и пектиновых веществ [8].

В качестве субстратов для биокомпоста с использованием Trichodermaviride были взяты отходы картофеля и банановая кожура. Их поместили в промытые, сухие емкости и на поверхность пересадили чистую культуру микромицета. Контрольный образец из тех же отходов просто смачивали водой.

Уже на 2-е сутки после посадки Trichoderma был заметен рост культуры в экспериментальных образцах. На 6-е сутки содержимое всех контейнеров перемешали. На 9-е сутки наблюдался значительный процесс разложения органических остатков во всех трех образцах, по сравнению с контрольным.

Через 2 недели во всех опытных образцах отходы превратились в слизкую, практически разложившуюся массу. В контрольном образце отходы подверглись первичному процессу гниения.

Вывод: Гриб Trichodermaviride ускорил процесс биоразложения органики. Однако, изучение его свойств для использования в качестве стимулятора биокомпостирования надо продолжить т.к. эксперимент проводился в относительно стерильных условиях.

4. Заключение

Trichodermaviride – микромицет, который имеет значительный потенциал для применения в сельском хозяйстве.

В ходе исследования нами были изучены биостимулирующие и деструктивные свойства гриба Trichodermaviride, подобрана среда и твердый субстрат для культивирования гриба в условиях школьной лаборатории и домашних условиях.

Мы выяснили, что наиболее благоприятными для разведения Trichoderma являются бобово-глюкозная твердая среда и среда PDA. Дальнейшее культивирование целесообразно проводить на перловой крупе, что дает большой выход живого биопрепарата.

Наша гипотеза о ростостимулирующих свойствах микромицета частично подтвердилась. Было выяснено, что Trichodermaviride положительно влияет на энергию прорастания и всхожесть семян, а также стимулирует рост надземной части растений и корневой системы при использовании раствора с концентрацией культуры 5/100 и 10/100. Более высокая концентрация вызывает угнетение развития растений.

Так же мы опытным путем определили, что возможно использоватьTrichodermavirideдля ускорения компостирования органических остатков.

Таким образом, результаты исследований показывают, что этот гриб может быть эффективно использован для повышения урожайности и создания ценных продуктов из отходов. Это, в свою очередь, открывает дальнейшие перспективы для его исследования: по улучшению качества почвы, борьбе с патогенами растений и развитию новых методов биологического контроля за вредителями.

Интеграция Trichodermaviride в сельское хозяйство позволит уменьшить химическое воздействие на окружающую среду, что будет способствовать улучшению экологической обстановки.

5. Список литературы

1. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma/Ф.К.Алимова – Казань: Изд-во КГУ им.В.И.Ульянова-Ленина, 2006. – 209 с. - ISBN 5-98180-300-2

2. Бондарь П.Н. Штаммы грибов рода Trichoderma (Pers.: Fr.) как основа для создания биопрепаратов защиты растений и получения кормовых добавок. – М., ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет», 2011 – 22 с.

3. ГОСТ 12038-84 Семена сельскохозяйственных культур. Межгосударственный стандарт: утвержден и введен в действие Постановлением Гос.комитета СССР по стандартам от 19.12.1984 № 4710: дата введения 1986-07-01 – URL: https://docs.cntd.ru/document/1200023365 (дата обращения)

4. ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов. Межгосударственный стандарт: утвержден и введен в действие Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 25.12.1991 № 2117: дата введения 1993-01-01 – URL: https://docs.cntd.ru/document/1200021109 (дата обращения)

5. Грибы рода триходерма и перспектива их использования в сельском хозяйстве [Электронный ресурс]: Башинком: статьи и публикации – URL: https://www.bashinkom.ru/library/articles/griby-roda-trikhoderma-i-perspektivy-ikh-ispolzovaniya-v-selskom-khozyaystve/ (дата обращения)

6. Зиганшин Д.Д., Сироткин А.С. Особенности глубинного и поверхностного культивирования грибов Trichoderma для получения биопрепаратов на основе клеток гриба. Вестник технологического университета. 2017. Т.20, №10 с 155 – 158

7. Исследование взаимодействия Trichodermaviride и Fusariumoxysporum на ранних этапах прорастания спор[Электронный ресурс]: cyberleninka.ru– URL:https://cyberleninka.ru/article/n/issledovanie-vzaimodeystviya-trichoderma-viride-i-fusarium-oxysporum-na-rannih-etapah-prorostaniya-spor(дата обращения)

8. Компост: превращение отходов в доходы [Электронный ресурс]: Агрокультура: сайт – URL: https://agracultura.org/news/kompost-prevrashhenie-otxodov-v-doxody/ (дата обращения)

9. Микробиология. Питательные среды [Электронный ресурс]: Микробио+ – URL: https://mibio.ru/contents.php?id=1733(дата обращения)

10. Наумов Н.А. Методы микологических и фитопатологических исследований. – Л.: Сельхоз издат, 1937. – 272 с.

11. Подарок самой природы: великая польза триходермы для сада и огорода [Электронный ресурс]: Дачные истории: интернет-портал – URL: https://dzen.ru/a/Yhso_Q9ZhCW0RrXm (дата обращения)

12. Рудаков О.Л. Микофильные грибы, их биология и практическое значение. – М.: Наука, 1981. – 160 с.

Приложения

Рис.1 Рис.2

Рис.3

Рис.4

Рис.5

Рис.6

Рис.7

Рис.8 Рис.9

Таблица 1. Энергия прорастания, всхожесть семян и ростовые показатели овса посевного (AvenaSativa) при обработке раствором Trichodermaviride различной концентрации в условиях стационарного культивирования в чашках Петри.

Таблица 2 Ростовые показатели овса посевного (AvenaSativa) при обработке раствором Trichodermaviride различной концентрации в условиях стационарного культивирования при выращивании в почве.