XXVI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Производные триазолоазина как потенциальные противоопухолевые препараты

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Лазарева С.В. 1

---

1СПб ГБОУ «Лицей № 280 им. М.Ю. Лермонтова»

Самбук Е.В. 1Лазарев В.Ф. 2

---

1СПб ГБОУ «Лицея №280 им. М.Ю. Лермонтова»

2ИНЦ РАН

Работа в формате PDF

404.4 KB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителяСвидетельство руководителя

Введение

Несмотря на усилия учёных и врачей во всём мире, онкологические заболевания остаются одной из самых распространённых причин смерти. Особую опасность для пациентов представляет возобновление опухолевого роста после терапии – рецидив, в том числе формирование вторичных очагов роста опухоли – метастазов [Mitra, Mishra, Li, 2015]. Рецидив онкологических заболеваний и метастазирование опухолей определяют неблагоприятный прогноз развития патологических процессов у пациентов. Разработка таргетных противоопухолевых препаратов, направленных на подавление киназ, играющих ключевую роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза, остается актуальной задачей современной онкологии [Braga, 2016]. Поэтому крайне важным направлением исследований является поиск соединений, способных блокировать процессы метастазирования.

Ранее учёными ИНЦ РАН совместно с коллегами из Уральского федерального университета были обнаружены соединения из класса триазолоазинов, способные вызывать гибель опухолевых клеток in vitro [Serebrennikova и др., 2023]. Низкомолекулярные соединения класса триазолоазинов известны широким спектром биологической активности, включая антиоксидантное [Ivanova и др., 2020], противовирусное [Deev и др., 2010] и противоопухолевое [Serebrennikova и др., 2023]действие. Однако, потенциал триазолоазинов в контексте предотвращения рецидива и метастазирования опухолей до сих пор не изучен.

Цель данной работы —предположить механизм противоопухолевого действия разработанных ранее производных триазолоазина (ТАА) и апробировать их терапевтическое действие в сочетании с оксалиплатином. В задачи исследования входило:

1. С помощью нейросетевых алгоритмов определить наиболее вероятную белковую мишень ТАА и ее функции в клетке.

2. На основе биомедицинской статистики определить корреляцию между уровнем экспрессии гена белка-мишени ТАА и прогнозом выживания пациентов с раком.

3. С помощью молекулярного докинга определить возможное положение и аффинность взаимодействия между ТАА и белком-мишенью.

4. С помощью нейросетевых алгоритмов определить основные физико-химические и фармакокинетические свойства ТАА.

5. Оценить терапевтический потенциал ТАА на культуре клеток колоректального рака человека.

2. Основная часть

1. 1. Материалы и методы

      1. Низкомолекулярные соединения

Для работы были использованы низкомолекулярные соединения из коллекции Уральского федерального университета им. Б.Н. Ельцина. Все исследованные нами соединения относились к классу триазолоазинов и были синтезированы в Уральском федеральном университете по разработанной ранее методике [Khalymbadzha и др., 2015].

1. 1. 2. Предсказание спектра активности соединений

Для предсказания спектра биологической активности и возможных белковых мишеней для исследуемых низкомолекулярных соединений мы использовали нейросетевой алгоритм PASSonline, разработанный Институтом биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича и доступный онлайн всем заинтересованным лицам (https://www.way2drug.com/). Нейросетевого алгоритм, доступный для общего использования был обучен на основе уже известных спектров активности для большого количества различных низкомолекулярных соединений [Filimonov и др., 2014]. Результат анализа с помощью нейросетевого алгоритма PASSonline представляет собой таблицу, в которой указана вероятность проявления тестируемым соединением различных типов биологической активности (больше 0, меньше 1), а также параметр Confidence (достоверность, больше 0, меньше 1), который отражает вероятность связывания с различными белковыми мишенями.

1. 1. 3. Изучение роли белков в развитии опухолей

Для изучения корреляции между уровнем экспрессии генов белков в опухолях и продолжительностью выживания пациентов (общая продолжительность выживания и продолжительность безрецидивного выживания) мы использовали онлайн базу данных GEPIA (GeneExpressionProfilingAnalysis, http://gepia.cancer-pku.cn/) [Tang и др., 2017]. В общей сложности в базе данных содержится информация об уровне экспрессии генов в опухолях и продолжительности жизни приблизительно 10000 пациентов. Для корреляционного анализа мы использовали выборки пациентов с колоректальным раком, раком легкого и глиомой. Уровень экспрессии гена белка интереса нормировали на уровень экспрессии белка Hsc70. Для представления результатов в виде графика (кривая выживаемости Каплана-Мейера) мы использовали встроенный в онлайн-сервис интерактивный интерфейс. Результаты корреляционного анализа считали статистически значимыми при значении вероятности p<0.05 при общем количестве пациентов в анализируемой выборке не менее 100 человек.

1. 1. 4. Молекулярный докинг

Для изучения возможных сайтов взаимодействия низкомолекулярных соединений и белков интереса, включая параметры аффинности взаимодействия, мы использовали онлайн-сервис, разработанный Швейцарским институтом биоинформатики SwissDock (https://www.swissdock.ch/) [Bugnon и др., 2024]. Для представления результатов в виде трехмерной модели мы использовали встроенный в онлайн-сервис интерактивный интерфейс. Для определения аффинности взаимодействия мы ориентировались на рассчитанные с помощью сервиса значения.

1. 1. 5. Расчет физико-химических и фармакокинетических параметров

Для расчета физико-химических и фармакокинетических параметров низкомолекулярных соединений мы использовали онлайн-сервис, разработанный Швейцарским институтом биоинформатики SwissADME (http://www.swissadme.ch/) [Daina, Michielin, Zoete, 2017].

1. 1. 6. Культивирование клеточной линии колоректального рака человека

В ходе данной работы были использованы клетки колоректального рака человека HCT116-OxP-luc из коллекции лаборатории защитных механизмов клетки ИНЦ РАН. Клеточную линию культивировали на среде DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Capricorn Scientific, Германия) и 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина (Capricorn Scientific, Германия) при температуре 37°C и содержанием CO₂ 5% в атмосфере.

Клетки пересеивали каждые двое суток, тем самым поддерживая интенсивность пролиферации. Для открепления клеток с поверхности культурального пластика предварительно промывали монослой фосфатным буфером, а затем использовали раствор трипсина-версена в соотношении 1:3 (Биолот, Россия).

1. 1. 7. Определение жизнеспособности клеток с использованием МТТ теста

Для определения эффективности комбинированной терапии колоректального рака с помощью оксалиплатина (OxP) и производных триазолоазина Клетки HCT116-OxP-luc помещали в ростовую среду в концентрации 1,5 х 10⁵ кл/мл и рассеивали в 96-луночные планшеты в объеме 100 мкл/лунка. Через сутки заменяли среду на свежую, содержащую производные триазолоазина ТАА-13, либо ТАА-14, либо ТАА-15 в конценитрации 45 µМ. Ещё через сутки в лунки добавляли химиотерапевтический препарат оксалиплатин (Фарева Унтерах ГмбХ, Австрия) в концентрации 12.5 µМ. По прошествии 48 часов клетки промывали фосфатным буфером и добавляли ростовую среду с 10% содержанием раствора вещества МТТ (бромид 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-тетразолия, Панэко, Россия), который предварительно разводили в стерильном фосфатном буфере в концентрации 5 мг/мл. Через 1 час убирали среду, содержащую МТТ, и добавляли 100 мкл диметилсульфоксид (Биолот, Россия) для растворения образовавшихся фиолетовых кристаллов формазана. Далее определяли оптическую плотность полученного раствора. Измерение производили при длине волны 570 нм, для этого использовали мультимодальный планшетный ридер Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific, США).

1. 1. 8. Статистический анализ

Для выражения всех данных использовалось среднее значение ± стандартное отклонение. Данные анализировались с использованием непараметрического теста Манна–Уитни с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8. Каждый эксперимент проводился минимум три раза. Статистическая значимость была установлена при p < 0.05.

1. 2. Результаты и обсуждение

      1. Определение наиболее вероятной белковой мишени ТАА и ее функции в клетке

Первым этапом работы стало определение возможного влияния на физиологию организма трех низкомолекулярных соединений из класса триазолоазинов. Структурные формулы соединений представлены на Рисунке 1. Для этого мы использовали нейросетевой алгоритм PASSonline. Результаты компьютерного предсказания биологической активности соединений ТАА-13, ТАА-14 и ТАА-15 представлены в Таблице 1. Мы установили, что для всех соединений с наибольшей вероятностью должна быть действительно характерна противоопухолевая активность («Antineoplasticenhancing»). Далее также с помощью сервиса PASSonline мы определили наиболее вероятные белковые мишени для всех трех соединений. Результаты компьютерного расчета представлены в Таблице 2. Ориентируясь на параметр «Confidence» (достоверность), мы определили, что для соединений ТАА-13, ТАА-14 и ТАА-15 наиболее вероятной белковой мишенью в клетках может быть polo-подобная киназа 3 (PLK3).

Р исунок 1. Структурные формулы исследуемых низкомолекулярных соединений из класса триазолоазинов.

Таблица 1. Результаты компьютерного расчета наиболее вероятной биологической активности для производных триазолоазина ТАА-13, ТАА-14 и ТАА-15. В таблице представлены 10 наиболее вероятных типов активности. Pa – вероятность индукции соответствующей активности, Pi – вероятность ингибирования соответствующей активности.

Таблица 2. Результаты компьютерного расчета наиболее вероятной белковой мишени для соединений ТАА-13, ТАА-14 и ТАА-15. В таблице представлены 10 наиболее вероятных белковых мишеней.

1. 1. 2. Корреляция между уровнем экспрессии гена белка PLK3 и прогнозом выживания пациентов с раком

Следующим этапом работы стало изучение роли PLK3 в прогрессии опухолевого роста. Для этого мы оценили корреляцию между уровнем экспрессии гена PLK3 в опухолевых клетках и общей либо безрецидивной выживаемостью пациентов (Рисунок 4). В качестве источника данных и программного обеспечения для анализа мы использовали онлайн сервис GEPIA. Мы установили, что существует статистически достоверное отличие как по продолжительности общей выживаемости, так и по продолжительности безрецидивной выживаемости между выборками пациентов с пониженным уровнем экспрессии PLK3 и повышенным уровнем экспрессии PLK3. Так, мы продемонстрировали, что повышенный уровень экспрессии PLK3 коррелировал с сокращением продолжительности общей и безрецидивной выживаемости для пациентов с раком легкого, глиомой и колоректальным раком. При этом, для пациентов с раком легкого различие по продолжительности жизни составляло 50-70%, для пациентов с глиомой – 120-150%, а для пациентов с колоректальным раком – 70%. В целом, такие результаты согласуются с литературными данными – в качестве примера можно привести данные о том, что уровень PLK3 ассоциирован с неблагоприятным прогнозом, а также участвует в регуляции пролиферации и метастазирования у пациентов с раком простаты [Lin и др., 2019].

Таким образом, полученные нами данные позволяют сделать вывод о целесообразности блокирования PLK3 с помощью низкомолекулярных соединений, например с помощью ТАА.

Рисунок 4. На рисунке представлены кривые Каплана-Мейера для общей выживаемости (верхние панели) либо безрецидивной выживаемости (нижние панели) пациентов с раком легкого, глиомой и колоректальным раком. Синим цветом изображены кривые Каплана-Мейера для пациентов с пониженным уровнем экспрессии гена PLK3, красным цветом изображены кривые Каплана-Мейера для пациентов с повышенным уровнем экспрессии гена PLK3.

1. 1. 3. Определение возможного сайта и аффинности взаимодействия между ТАА и PLK3

Для решения задачи локализации возможного сайта взаимодействия с ТАА на молекуле PLK3 мы использовали онлайн-сервис для молекулярного докинга SwissDock. Мы установили наиболее вероятные положения (сайты) для связывания соединений ТАА-13, ТАА-14 и ТАА-15 на молекуле PLK3. Наиболее энергетически выгодный сайт взаимодействия расположен в средней части молекулы PLK3 (Рисунок 5). Кроме того, мы определили энергию аффинности для 10 наиболее энергетически выгодных сайтов взаимодействия для каждого из трех ТАА, соответствующие данные представлены в Таблице 3. На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что исследованные нами производные ТАА обладают ярко выраженным сродством к PLK3 и действительно могут являться низкомолекулярными ингибиторами PLK3.

Рисунок 5. На рисунке представлена репрезентативная иллюстрация результата молекулярного докинга ТАА-15 на молекулу PLK3.

Таблица 3. Результат расчета аффинности взаимодействия производных триазолоазина с киназой PLK3. В таблице представлены рассчитанные аффинности взаимодействия для 10 наиболее энергетически выгодных позиций для каждого из исследованных соединений.

1. 1. 4. Определение основных физико-химические и фармакокинетические свойства ТАА

Следующим этапом работы после подтверждения сродства производных ТАА к PLK3 стало определение основных фармакологических параметров исследуемых соединений. Для этого мы использовали онлайн-сервис SwissADME. Полученные параметры для соединений ТАА-13, ТАА-14 и ТАА-15 мы сравнили с рекомендованными для лекарственных препаратов значениями (Таблица 4). Мы установили, что исследуемые нами соединения полностью удовлетворяют стандартным критериям Липински [Lipinski и др., 2001] и Leadlikeness[Polinsky, 2008] (критерии соответствия химических субстанций типичным лекарственным препаратам). Таким образом, можно утверждать, что исследуемые нами производные ТАА действительно являются перспективными противопухолевыми препаратами нацеленными на блокирование PLK3.

Таблица 3. Основные физико-химические и фармакокинетические параметры ТАА.

1. 1. 5. Изучение сочетанного действия производных триазолоазина и оксалиплатина на клетки колоректального рака человека

С ледующим этапом работы стало определение способности ТАА повышать чувствительность клеток колоректального рака человека к действию противоопухолевого препарата оксалиплатина. Для этого мы оценили жизнеспособность клеток HCT116-OxP-luc в условиях комбинированного действия оксалиплатина и ТАА с помощью теста МТТ (Рисунок 6). Мы установили, что предварительное культивирование HCT116-OxP-luc в присутствии 45µM ТАА значительно снижало устойчивость клеток колоректального рака к действию оксалиплатина.

Рисунок 6. Определение жизнеспособности клеток колоректального рака человека HCT116-OxP-luc в условиях комбинированного действия ТАА и оксалиплатина. Представлены результаты теста МТТ. * p<0.05.

Так, комбинированная терапия с помощью оксалиплатина и ТАА-13 вызывала гибель 23% клеточной популяции, оксалиплатина и ТАА-14 – 24.6%, оксалиплатина и ТАА-15 – 35.1%, при этом монотерапия оксалиплатином вызывала гибель 12,5% клеток.

3. Заключение

В рамках исследования проведен комплексный биоинформатический анализ низкомолекулярных соединений класса триазолоазинов (ТАА-13, ТАА-14, ТАА-15) для оценки их потенциала в качестве противоопухолевых агентов. Используя алгоритм PASSonline, было установлено, что все три соединения проявляют высокую вероятность противоопухолевой активности («Antineoplasticenhancing»), а их основной белковой мишенью с высокой вероятностью является polo-подобная киназа 3 (PLK3). Клиническая значимость PLK3 подтверждена данными базы GEPIA, на основе которых было установлено, что повышенная экспрессия гена PLK3 коррелировала с сокращением общей и безрецидивной выживаемости пациентов с раком легкого, глиомой и колоректальным раком.

Молекулярный докинг продемонстрировал высокое сродство производных ТАА к PLK3, с энергией аффинности до -10.2 ккал/моль, что подтверждает их способность эффективно ингибировать киназу. Расчет физико-химических и фармакокинетических параметров (SwissADME) показал соответствие соединений критериям Липински и Leadlikeness, что делает их перспективными кандидатами для доклинических исследований.

Использование биоинформатических инструментов позволило интегрировать данные о структурных, функциональных и клинических аспектах PLK3, что обеспечило системный подход к оценке новых потенциальных терапевтических агентов. Результаты работы расширяют понимание роли PLK3 в онкологии и открывают пути для разработки инновационных препаратов, направленных на подавление этой киназы. Новизна исследования заключается в комбинации методов in silico для валидации мишени и соединений, такой подход обеспечил основу для перехода к экспериментам in vitro, в ходе которых мы подтвердили терапевтический потенциал ТАА.

Таким образом, ТАА-13, ТАА-14 и ТАА-15 обладают выраженным потенциалом в качестве таргетных ингибиторов PLK3, подавление которой может замедлить прогрессию опухоли и улучшить прогноз пациентов. Ключевым результатом настоящей работы стала гипотеза о принципиально новом молекулярном механизме противоопухолевого действия производных триазолоазина, реализуемом через блокирование киназы PLK3. Проделанная нами работа формирует основу для дальнейшего исследования производных триазолоазина invitroиinvivo.

Выводы:

1. Наиболее вероятной белковой мишенью ТАА является киназа PLK3.

2. Повышенный уровень экспрессии гена PLK3 коррелирует с неблагоприятным прогнозом выживаемости пациентов с колоректальным раком, раком легкого и глиомой.

3. Был определен наиболее вероятный сайт связывания ТАА на молекуле PLK3 и рассчитана аффинность взаимодействия.

4. Физико-химические и фармакокинетические параметры ТАА соответствуют ключевым критериям, предъявляемым к лекарственным препаратам.

5. Производные триазолоазина снижают устойчивость клеток колоректального рака человека к оксалиплатину.

Финансирование работы

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект №19-74-20161.

4. Список использованной литературы

1. Babagana M. и др. The role of polo-like kinase 3 in the response of BRAF-mutant cells to targeted anticancer therapies // Mol Carcinog. 2020. Т. 59. № 1. С. 5–14.

2. Braga S. Resistance to targeted therapies in breast cancer // Methods in Molecular Biology. 2016. Т. 1395. С. 105–136.

3. Bugnon M. и др. SwissDock 2024: major enhancements for small-molecule docking with Attracting Cavities and AutoDock Vina // Nucleic Acids Res. 2024. Т. 52. № W1. С. W324–W332.

4. Daina A., Michielin O., Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules // Sci Rep. 2017. Т. 7. № 1. С. 1–13.

5. Deev S. L. и др. 1,2,4-Triazoloazine derivatives as a new type of herpes simplex virus inhibitors // Bioorg Chem. 2010. Т. 38. № 6. С. 265–270.

6. Filimonov D. A. и др. Prediction of the biological activity spectra of organic compounds using the pass online web resource // Chem Heterocycl Compd (N Y). 2014. Т. 50. № 3. С. 444–457.

7. Franceschini A. и др. STRING v9.1: protein-protein interaction networks, with increased coverage and integration // Nucleic Acids Res. 2013. Т. 41. № D1. С. D808–D815.

8. Ivanova A. и др. The antioxidant screening of potential materials for drugs based on 6-nitro-1,2,4-triazoloazines containing natural polyphenol fragments // Anal Bioanal Chem. 2020. Т. 412. № 21. С. 5147–5155.

9. Khalymbadzha I. и др. Synthesis of acyclic nucleoside analogues based on 1,2,4-triazolo[1,5-a]pyrimidine-7-ones by one-step Vorbrüggen glycosylation // Chimica Techno Acta. 2015. Т. 2. № 2. С. 158–163.

10. Lin C. и др. Polo-like kinase 3 is associated with poor prognosis and regulates proliferation and metastasis in prostate cancer // Cancer Manag Res. 2019. Т. 11. С. 1517–1524.

11. Lipinski C. A. и др. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings // Adv Drug Deliv Rev. 2001. Т. 46. № 1–3. С. 3–26.

12. Mitra A., Mishra L., Li S. EMT, CTCs and CSCs in tumor relapse and drug-resistance // Oncotarget. 2015. Т. 6. № 13. С. 10697–10711.

13. Polinsky A. Lead-Likeness and Drug-Likeness // The Practice of Medicinal Chemistry. 2008. С. 244–254.

14. Serebrennikova P. O. и др. Synthesis and biological evaluation of 1,2,4-triazoloazines as potent anticancer agents // New Journal of Chemistry. 2023. Т. 47. № 39. С. 18325–18331.

15. Tang Z. и др. GEPIA: A web server for cancer and normal gene expression profiling and interactive analyses // Nucleic Acids Res. 2017. Т. 45. № W1. С. W98–W102.