XXVII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Плазмаферез крови у насекомых
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Насекомые — самый обширный из всех классов, он насчитывает около 1 миллиона видов. Эти маленькие существа действительно интересны по своему строению, одна из их удивительных способностей — это моментальное заживление ран и высокий иммунитет. За счёт чего же насекомые добиваются такого?
В теле любого животного существуют разные системы, одной из таких систем является кровеносная, у человека она представлена сердцем, венами, артериями, капиллярными сосудами, а у насекомых всё гораздо сложнее, у насекомых незамкнутая кровеносная система, кровь свободно омывает органы, а так как дыхательные функции в теле насекомого выполняет система трахей, то крови насекомых уже не нужно самостоятельно перетаскивать кислород, но забот у неё не уменьшается. Тело насекомых можно представить как мешок с водой, если его лопнуть, то вся вода вытечет, поэтому кровь у насекомых имеет особую функцию — быстро заживлять раны, а также способна к хорошему иммунитету, синтезу питательных веществ и защите органов от механических повреждений, всё это даёт особая клеточная ткань, которая называется гемолимфа.
Объект исследования: Гемолимфа личинок жуков Tenebrio molitor.
Предмет исследования: Способы разделения гемолимфы насекомых на составляющие.
Цель работы: Нахождение и тестирование метода отделения от гемолимфы мучного хрущака (tenebrio molitor) гемоцитов или других клеток, для дальнейших исследований.
Задачи:
1. Охарактеризовать состав и функции гемолимфы.
2. Проанализировать способы плазмафереза гемолимфы.
3. Провести эксперимент с разделением гемолимфы личинок tenebrio molitor путём гравитационного плазмафереза.
4. Определить перспективные направления исследований.
Актуальность: Моя работа актуальна, потому что понимание механизмов работы гемоцитов насекомых может помочь в разработке новых подходов к борьбе с инфекциями, в том числе у человека. Например, изучение белков гемолимфы, участвующих в иммунных функциях, может привести к созданию препаратов с антимикробным действием. Применение в сельском хозяйстве и защите растений. Изучение гемолимфы и гемоцитов вредителей (например, саранчи, шелкопрядов) помогает прогнозировать массовые размножения насекомых-вредителей и разрабатывать меры по их контролю. Понимание роли гемоцитов в метаболизме и иммунитете насекомых может способствовать созданию более эффективных и безопасных методов защиты растений.
Гипотеза: Существуют способы плазмафереза (разделения на составляющие) гемолимфы насекомых.
Методы: Теоретические: анализ и изучение информации по данной теме.
Практические: эксперимент, наблюдение, сравнение, фотографирование.
1. Теоретическая часть
1.1 Гемолимфа. Клеточная такань
Гемоли́мфа — жидкость, циркулирующая в сосудах и межклеточных полостях многих беспозвоночных животных с незамкнутой кровеносной системой. Выполняет те же функции, что кровь и лимфа у животных с замкнутой системой кровообращения, но не переносит газы. Основным переносчиком кислорода является молекула гемоцианина. Функционирует, перенося питательные вещества и удаляя экскременты. У моллюсков гемолимфа транспортирует по всему организму также кислород и углекислый газ. Гемолимфа является единственной тканевой жидкостью в теле насекомых. Подобно крови у позвоночных животных, гемолимфа образована жидким межклеточным веществом — плазмой — и находящимися в ней клетками — гемоцитами. Но в отличие от крови позвоночных, гемолимфа циркулирует не по замкнутым кровеносным сосудам, а в полости тела (в гемоцеле). Также в гемолимфе отсутствуют клетки, снабжённые гемоглобином или другими дыхательными пигментами. Плазма гемолимфы содержит в себе неорганические и органические соединения. Гемоциты либо находятся в свободном взвешенном состоянии в плазме, либо оседают на поверхности внутренних органов. У большинства насекомых в 1 мм3 гемолимфы содержится от 10 000 до 100 000 клеток. Число гемоцитов, циркулирующих в теле таракана, составляет 9—13 миллионов, а их суммарный объём достигает 10 % от общего объёма гемолимфы. Гемолимфа осуществляет транспортировку питательных веществ от стенок пищеварительного канала ко всем органам. В выполнении данной функции принимают непосредственное участие как гемоциты, так и целый ряд химических соединений самой плазмы. Часть питательных веществ поступает из гемолимфы в клетки жирового тела. При голодании, диапаузе или во время линьки данные резервные продукты вновь переходят в гемолимфу и могут быть доставлены к местам их использования. У насекомых, развивающихся с полным превращением, те продукты, которые освобождаются при гистолизе личиночных тканей, тоже транспортируются гемолимфой. Вторая важная функция гемолимфы связана с её участием в защите насекомых от инфекционных заболеваний и заражения паразитами. В выполнении данной защитной функции участвуют белки плазмы, гемоциты, способные к фагоцитозу, и клетки, образующие гемоцитарные капсулы вокруг многоклеточных паразитов. Гидростатическое давление, развиваемое гемолимфой, используется при выполнении ею механической функции. Оно обеспечивает раскручивание хоботка у бабочек и расправление крыльев после выхода из куколки или после превращения бескрылой личинки в крылатое взрослое насекомое.[1] Гемоциты насекомых играют ключевую роль в их иммунной системе: они участвуют в фагоцитозе, инкапсуляции паразитов, синтезе антимикробных пептидов и других защитных реакциях.
Гемоциты разделяют на:
-
Прогемоциты — базовый тип клеток, из которых дифференцируются все остальные гемоциты.
-
Плазматоциты — чаще всего агранулярные клетки, обычно специализированные на выполнении фагоцитарных функций.
-
Гранулоциты — клетки со специфическими включениями в цитоплазме метаболического характера. Высвобождают содержимое гранул, например, в процессе капсулообразования.
-
Сферулоциты — большие округлые клетки, которые содержат небольшое количество крупных включений — сферул.
-
Эноцитоиды — клетки, содержащие фенолоксидазу. У дрозофилы это кристаллические клетки.
-
Цистоциты (иногда описывают как коагулоциты) — содержат большое количество гранул, которые активно высвобождаются при препарировании. [2]
1.2 Способы плазмафереза гемолимфы насекомых
Плазмаферез гемолимфы насекомых — важный этап при её исследовании. Ниже — основные методы, применяемые в лабораторной практике.
Основные способы сепарации гемолимфы
1. Механическое отделение с помощью микропипеток
Суть метода: гемолимфу собирают из ранки (например, после отсечения конечности насекомого) с помощью капиллярной микропипетки.
Этапы:
-
фиксация насекомого;
-
аккуратное повреждение покрова (например, отрезание ноги пинцетом или офтальмологическим скальпелем);
-
забор выделяющейся гемолимфы капиллярной трубкой;
-
перенос образца в буферный раствор.
Особенности: важно избегать загрязнения жировыми тельцами (отбрасывать капли с белыми хлопьями).
2. Центрифугирование. Цель: отделение клеточных элементов (гемоцитов) от плазмы.
Параметры:
-
скорость — около 1000 g;
-
время — 10 мин;
-
температура — 4 C.
Результат:
-
осадок — гемоциты;
-
надосадочная жидкость (супернатант) — плазма гемолимфы.
3. Фильтрация. Применение: удаление крупных частиц и агрегатов.
Материалы: мембранные фильтры с размером пор 0,2–0,45 мкм.
Преимущества: сохраняет биомолекулы (белки, ферменты) в нативном состоянии.
4. Хроматографические методы
Цели:
-
разделение белков по молекулярной массе (гель‑фильтрация);
-
очистка целевых компонентов (аффинная хроматография);
-
анализ метаболитов (обращённо‑фазовая ВЭЖХ).
Примеры:
SEC (Size Exclusion Chromatography) для фракционирования белков;
ионно‑обменная хроматография для разделения заряженных молекул.
5. Электрофорез. Назначение: разделение белков и других макромолекул по заряду и размеру.
Варианты:
-
SDS‑PAGE (для белков);
-
агарозный гель (для нуклеиновых кислот).
Итог: визуализация фракций после окрашивания (например, Кумасси синий для белков).
6. Преципитация (осаждение). Принцип: высаливание белков сульфатом аммония или осаждение органическими растворителями (например, ацетоном).
Шаг:
-
добавление реагента к гемолимфе;
-
центрифугирование для сбора осадка;
-
растворение осадка в буфере.
Использование: концентрирование белков.
7. Диализ
Задача: удаление низкомолекулярных примесей (солей, метаболитов).
Процедура:
-
помещение образца в диализный мешок;
-
инкубация в буфере с низким содержанием солей;
-
диффузия малых молекул через мембрану.
Время: от 12 до 24 ч.
2. Практическая часть
2.1 Эксперимент по выделению гемоцитов из гемолимфы Tenebrio molitor.
Я решила использовать метод центрифугирования для своей исследовательской работы.
Для проведения эксперимента мы использовали такое оборудование, как:
мини-центрифуга; пробирки Эпендорфа; пипетки; шприц медицинский; игла инъекционная 22G; спиртовка; предметные стекла; лимонная кислота и гидрокарбонат натрия.
А также использовались личинки мучного хрущака.
Сначала мы должны были достать гемолимфу, для этого с помощью ультратонкой иглы мы прокалывали покровы личинки в области головы и собирали каплю гемолимфы (Приложение 1, рис.1), нам понадобилось около тридцати личинок, в это время мы получали антикоагулянт цитрат натрия, для этого мы смешали лимонную кислоту и гидрокарбонат натрия. В процессе реакции выделялся CO2, H2O и цитрат натрия (Приложение 1, рис.2).
Далее мы добавили цитрат натрия (для предотвращения свертывания гемолимфы) и саму гемолимфу, полученную из личинок, в пробирку Эпендорф для центрифугирования (Приложение 1, рис.3).
Дальше мы оцентрифугировали смесь на протяжении 10 минут и получили осадок из гемоцитов (Приложение 1, рис. 4) далее, слив плазму, которая образовалась на поверхности, мы получили чистые гемоциты, которые поместили на предметные стекла, (Приложение.1 рис.1) после чего высушили в течение нескольких часов, дальше данные образцы мы закрепили на протяжении часа в растворе этанола 95%. По истечению времени мы повторно закрепили образцы, но уже физически, с использованием высоких температур спиртовой горелки (Приложение 1 рис.1).
Как только микропрепарат остыли мы окрасили их сначала 2 минуты метиленовым синим, потом 30 секунд раствором фуксина, после чего промыли дистиллятом по ребру и высушили.
Последним этапом мы произвели микроскопирование, на котором мы точно определили, что осадок состоит из различных гемоцитов гемолимфы мучного хрущака(Приложение 1 рис.2)
Перспективы применения добытых нами гемоцитов
Возможные направления:
Исследования иммунной системы
Изоляция гемоцитов позволяет детально изучать механизмы врождённого иммунитета насекомых, которые во многом схожи с иммунными реакциями других организмов, включая млекопитающих. исследовать клеточные и молекулярные механизмы распознавания патогенов (бактерий, грибов, вирусов);
изучать процессы фагоцитоза, инкапсуляции и меланизации;
выяснять роль различных типов гемоцитов (плазматоцитов, гранулоцитов, сфероцитов и др.) в иммунном ответе. [3]
Токсикологические исследования
Гемоциты насекомых могут служить моделью для тестирования токсичности химических веществ, наночастиц и других агентов.
Разработка биопестицидов и методов контроля вредителей
Изучение реакции гемоцитов на патогены (энтомопатогенные грибы, бактерии, вирусы) может помочь в создании более эффективных биопестицидов.
Заключение
В ходе моего исследования была подтверждена гипотеза о возможности плазмафереза у насекомых. Данный метод имеет перспективы для изучения гемолимфы насекомых и ее клеток для создания биопестицидов, антимикробных препаратов, для мониторинга насекомых и понимания работы их иммунной системы. Поставленные мною задачи были выполнены, а цели-достигнуты. Мой проект был для меня интересным и в будущем я хочу еще больше изучать насекомых и энтомологию.
Практическая значимость:
Информация собранная в данной работе может быть использована как учителями, так и студентами естественно-научных факультетов.
Список литературы и интернет-источников
-
Гемолимфа — Википедия
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%93%D0%B5%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%BC%D1%84%D0%B0
2. https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/Kruglikova.Dissert.pdf
3. disser.spbu.ru/files/disser2/disser/Kruglikova4.
Приложение 1. Этапы эксперимента
Рисунок 1 - Забор гемолимфы
Рисунок 2 - Получение антикоагулянта
Рисунок 3 – Добавление антикоагулянта в гемолимфу
Рисунок 4 – Центрифугирование
Рисунок 5 – Сушка гемоцитов на стекле
Рисунок 6 – Повторное закрепление
Рисунок 7 – Микроскопирование гемоцитов