XXVII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Колонии черного садового муравья (Lasius niger) как модельный объект для исследования и апробации новых лекарственных средств в пчеловодстве, 2023-2026 гг.

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Масленников М.И. 1

---

1ЧОУ ДПО «Академия «Калашников»

Изибаев Е.В. 1

---

1ЧОУ ДПО «Академия «Калашников»

Работа в формате PDF

1.2 MB

Автор работы награжден дипломом победителя III степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Колонии черного садового муравья (Lasius niger) как модельный объект для исследования и апробации новых лекарственных средств в пчеловодстве

В конце 50-х, начале 60-х годов 20 века рядом исследователей, в частности Расселом и Берчем была предложена концепция 3R (три R) [3,6]. На сегодняшний день данная концепция является общепринятым мировым стандартом, позволившим в значительной степени сократить количество используемых лабораторных животных [1,3,5-8].

В последние годы в качестве альтернативных моделей для изучения эффективности и безопасности лекарственных средств, токсического воздействия ксенобиотиков используются модели насекомых. Данные модели имеют такие преимущества как отсутствие биоэтических ограничений, возможность большой выборки, сравнительно низкие затраты на проведение исследований [3,5].

По литературным данным в качестве модельного объекта достаточно эффективно показывают себя личинки большой восковой моли (Galleria mellonella). Ее используют в первичных тестах на определение микробной вирулентности, патогенности микроорганизмов, токсикологических исследованиях в лабораторной, медицинской и ветеринарной практиках [1,3,5].

Однако восковая моль не всегда подходит для исследований в области пчеловодства. В частности, при исследовании безопасности и эффективности лекарственных препаратов для пчел на тест-объекте восковой моли затруднительно оценить влияние исследуемых препаратов на хозяйственно-полезные признаки, физиологические показатели и др. Таким образом в пчеловодстве является актуальной задача разработки модели тестирования лекарственных средств на тест-объекте в лабораторных условиях. К тест-объекту выдвигаются такие требования как близкие с пчелами физиологические и этологические показатели. В частности, объект должен быть из числа общественных насекомых, легко разводиться и содержаться в лабораторных условиях, быть безопасным для исследователя.

В эволюционной теории предполагается, что предками пчел были хищные осы, которые перешли на потребление пыльцы, и муравьями. Пчелы относятся к отряду Hymenoptera, и тесная связь с муравьями дает нам возможность предполагать схожесть биологических процессов.

Проанализировав данные факты принято решение исследований муравьев в качестве тест-объекта. Для данной работы мы остановились на черном садовом муравье (Lasius niger) как на виде, который обитает повсеместно.

Целью наших исследований являлось выявить влияние изучаемых лекарственных средств на физиологические и этологические показатели жизнедеятельности колонии муравьев (Lasius niger) в лабораторных условиях и сопоставить полученные данные с влиянием данных лекарственных средств на пчелиные семьи в полевых условиях.

Задачей наших исследований является изучение воздействия новых лекарственных средств на пчелиные семьи. Проведение данных экспериментов на пчелах имеет ряд ограничений. Это сезонность экспериментов, высокая стоимость формирования опытных групп при проведении исследований, риски, связанные с негативным воздействием лекарственных средств на пчелосемьи.

В данном исследовании качестве модельного объекта при изучении воздействия новых лекарственных средств на пчел нами предложены колонии черного садового муравья (Lasius niger), выращиваемые в контролируемых условиях лаборатории, в формикариях.

Выбор черного садового муравья в качестве тест системы в наших исследованиях обусловлен относительной схожестью биологии муравьев и пчел, по сравнению с большой восковой молью.

Материалы и методы исследований

Объектом наших исследований являлись колонии чёрного садового муравья (лат. Lasius niger) и пчелиные семьи (Apis mellifera L.) карпатской породы. Муравьи содержались в пробирках с акриловой активной зоной размерами 4х4х4 см. По достижению численности колоний до 20 рабочих особей муравьи переселялись в формикарии (Приложение). Опытные группы подбирались методом пар-аналогов. Учитываемые показатели: количество муравьев в колонии, яйценоскость матки на начало эксперимента.

Суточный рацион изучаемых муравьев состоял из медовой сыты и белкового корма. В качестве белкового корма применяли личинок Большой восковой моли (лат. Galleria mellonella). Схема опыта представлена в таблице 1.

Таблица 1

Схема опыта

В опытной группе I в качестве витаминно-минеральной и аминокислотной подкормки использовали ж

идкий концентрат ВитаМэлАм-К, содержащий в своем составе витамины и аминокислоты. Состав данного препарата представлен в таблице 2.

Таблица 2

Витаминно-минеральный и аминокислотный состав ВитаМэлАм-К*

*данные НВП «БашИнком»

В качестве пробиотических добавок использовались препараты ПчелоНормСил и Апиврач, производимые НВП «БашИнком» (опытная группа II и III, соответственно). Данные препараты содержат штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, дрожжей-сахаромицетов Saccharomyces cerevisiae, а также содержащие природные антагонисты патогенных микроорганизмов, возбудителей бактериальных и грибковых инфекций.

Показатели развития колонии, такие как яйценоскость матки и количество муравьев в изучаемых колониях определяли подсчетами в натуральных значениях. Для достоверного подсчета пользовались фотографическим методом.

Этологические показатели, такие как гигиеническое поведение, стрессоустойчивость, время обнаружения и поедания корма определяли в течении всего эксперимента.

Гигиеническое поведение изучали детекцией заплесневелых участков на территории обитания муравьев.

Показатели скорость обнаружения и поедания корма исследовали наблюдением за подопытными животными. Время измерялось с помощью секундомера.

Продолжительность жизни муравьев определяли количеством погибших муравьев с начала эксперимента.

Изучение влияния исследуемых препаратов на пчелиные семьи проводили в полевой сезон. Пчелиные семьи для эксперимента подбирали методом пар-аналогов. Учитывали следующие показатели: породность (карпатская порода), сила семей в улочках, яйценоскость матки, летная активность, гигиеническое поведение колонии, гибель пчел за период эксперимента. Подтверждение породности пчел проводили методом молекулярно-генетического анализа. Исследовались локусы митохондриальной ДНК (локус COI-COII) и 9 микросателлитных локусов. Исследования проводили на базах УдмФИЦ УрО РАН, Института биологии развития им. Н.К. Кольцова и УдГАУ. Результаты генотипирования представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты генотипирования подопытных пчел Республики Удмуртия на основе локусов митохондриальной ДНК (локус COI-COII) и 9 микросателлитных локусов

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических формул Exel.

Результаты исследований и их обсуждения.

В таблице 4 и 5 представлены результаты исследований силы подопытных пчелиных семей и колоний муравьев при исследовании влияния лекарственных средств. При анализе исходных данных мы видим следующую картину. Во всех опытных группах пчел мы наблюдаем положительную разницу с контролем. К концу периода наблюдений данная разница составила в I опытной группе 36,7 %, во II опытной группе – 14,8%, в III группе – 19,5% в пользу опытных групп.

Таблица 4

Сила подопытных пчелиных семей при изучении воздействия лекарственных средств

В эксперименте с муравьями разница с контролем составила в I опытной группе 44,4%, во II группе – 26, 3%, в третьей – 20,5%.

Таблица 5

«Сила» подопытных колоний муравьев при изучении воздействия лекарственных средств

Таким образом, если сравнивать полученную разницу мы видим единый тренд как в эксперименте с пчелами, так и муравьями.

Для уточнения полученных данных был проведен расчет коэффициента корреляции признака (таблица 6).

Таблица 6

Показатели коэффициента корреляции силы пчелиных семей и населенности колоний муравьев

При анализе данного показателя получена сильная прямая взаимосвязь признаков. Показатели коэффициента корреляции силы пчелиных семей и населенности колоний муравьев составили от 0,8 в контроле до 0,9 в опытной группе.

В данном эксперименте максимальную эффективность показала первая опытная группа, где использовали витаминно-минеральную и аминокислотную подкормку ВитаМэлАм-К.

Летную активность пчел мы сравнивали с временем, потраченным муравьями на поиск пищи. Интенсивность летной активности пчел была выше в опытных группах по сравнению с контролем на протяжении всего периода наблюдений. К концу периода наблюдений данная разница составила в I опытной группе 10,3%, в остальных опытных группах разница была незначительна и составила от1до 5%.

Таблица 7

Летная активность рабочих пчел при исследовании экспериментальных лекарственных средств (шт. за 3 мин.)

Таблица 8

Время, потраченное на поиск пищи муравьями при исследовании экспериментальных лекарственных средств, мин

В эксперименте с муравьями мы видим разницу по опытным группам от 20 секунд (I опытная группа) до 1 минуты в опыте против 3 минут в контроле.

Таблица 9

Показатели коэффициента корреляции летной активности пчелиных семей и времени, потраченного на поиски пищи муравьями

При расчете коэффициента корреляции мы видим сильную отрицательную взаимосвязь признаков по изучаемым показателям.

При анализе воздействия исследуемых препаратов на показатели яйцекладки мы видим следующие результаты. В опытах на пчелах в первой опытной группе разница с контролем к концу эксперимента составила 35%, в опытных группах II и III – 11,8 и 4,7 %, соответственно.

Таблица 10

Взаимосвязь яйцекладки пчелиной матки в зависимости от экспериментального лекарственного средства в течение трех суток, М±m, шт.

Таблица 11

Взаимосвязь яйцекладки матки черного садового муравья в зависимости от экспериментального лекарственного средства в течение трех суток, М±m, шт.

В опыте с муравьями данный показатель составил в I опытной группе 73,6 %, во II и III группах - 38 и 49% соответственно.

Таблица 12

Показатели коэффициента корреляции яйцекладки в пчелиных семьях и колониях муравьев

Коэффициент корреляции по данному показателю имеет высокую прямую взаимосвязь признаков.

При анализе массива экспериментальных данных мы видим, что наиболее выдающиеся результаты, отражающие физиологическое состояния подопытных животных, получены в опытных группах I как в вариантах с пчелами, так и муравьями, где применяли витаминно-минеральную подкормку. Опытные группы II и III, так же показали более высокие результаты в сравнении с контролем.

Таким образом, на исследуемых препаратах в условиях лабораторных экспериментов на муравьях и в полевых исследованиях на пчелах мы получили схожие результаты, что дает возможность рекомендовать черного садового муравья в доклинических исследованиях в качестве тест – объекта.

Список используемых источников

1. Васильев С.А., Матвеева И.Н., Круглова М.И. Применение принципов 3R при тестировании рекомбинантных вакцин. / Биотехнология: Научные исследования и связь с производством // Материалы Международной научно-практической конференции. Лосино-Петровский, 2024 - Изд-во: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

2. Шарипов А, Влияние стимулирующих подкормок на летную активность в весенний период развития семей пчел. / А.Шарипов //. - Диссертация. Повышение воспроизводительных и продуктивный свойств, разработка эффективной системы управления жизнедеятельностью медоносных пчел в Республике Таджикистан. -Москва 2012. -С.-169-174.

3. Макарова М. Н., Крышень К.Л., Гайдай Д.С., Гайдай Е.А. Личинки большой восковой моли (Galleria mellonella) как модельный объект для исследования новых лекарственных средств // ЗАО «Научно-производственное объединение «Дом Фармации», Санкт-Петербург [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://doclinika.ru/wp-content/uploads/2014/12/Lichinki-bol-shoj-voskovoj-moli-Galleria-mellonella-kak-model-ny-j-ob-ekt-dlya-issledovaniya-novy-h-lekarstvenny-h-sredstv-.pdf

4. Малков В.В. Естественное размножение пчелиных семей. /В.В.Малков//. -Естественное размножение медоносных пчел (Роение). Рыбное 2004.С.25-29.

5. Poh WT, Stanslas J. The new paradigm in animal testing - “3Rs alternatives”. Regul Toxicol Pharmacol. 2024;153:105705.

6. Russell WMS, Burch RL, Hume CW. The principles of humane experimental technique. London: Methuen & Co Ltd.; 1959.

7. Tannenbaum J, Bennett BT. Russell and Burch’s 3Rs then and now: The need for clarity in definition and purpose. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2015;54(2):120–32. PMID: 25836957

8. Halder M. Three Rs potential in the development and quality control of immunobiologicals. ALTEX. 2001;18(Suppl.1):13–47. PMID: 11854853

ПРИЛОЖЕНИЕ

Фото 1. Заселение формикария колонией черного садового муравья (Lasius niger)

Фото 2. Наблюдение за этологическими показателями колонии черного садового муравья в процессе эксперимента

Фото 3. Проведение экспериментов на пасеке

Фото 4. Отбор проб пчел для установления породной принадлежности

Фото 5. Контроль за динамикой развития пчел в процессе эксперимента