XXVII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Определение лизоцима в куриных и перепелиных яйцах электрофоретическим и хроматографическим методами
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Лизоцим – энзим, защищающий живые организмы от проникновения болезнетворных бактерий и грибов. Он содержится в слюне, слёзной жидкости, слизи носоглотки, грудном молоке млекопитающих и яичном белке. Молекула лизоцима куриного белка представляет собой полипептидную цепь, содержащую 129 аминокислотных остатка с четырьмя внутримолекулярными дисульфидными мостиками. Являясь ферментом, катализирует гидролиз β-1,4 гликозидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином в пептидогликане клеточной стенки бактерий.
В отличие от большинства белков, лизоцим легко кристаллизуется, и эти кристаллы имеют хорошие преломляющие свойства. Молекулы лизоцима способны разрушать клеточные стенки микроорганизмов и встраиваться в их клеточную мембрану с образованием в ней пор. Благодаря этому механизму, данный фермент может вызывать гибель бактерий и грибов. Кроме того, образование пор в клеточных мембранах способствует увеличению их проницаемости для других антибактериальных веществ и препаратов.
Лизоцим также оказывает положительное стимулирующее действие на иммунную систему и на синтез интерферонов, благодаря которым клетки становятся невосприимчивы к вирусам. На основе лизоцима производятся различные лекарственные средства с высокими лечебно-профилактическими эффектами. Он также применяется в пищевой промышленности в качестве консерванта [1, 2].
Для подобных целей лизоцим выделяется из яичного белка, т.к. именно он является наиболее доступным источником этого фермента [3, 4]. Куриные и перепелиные яйца являются ценными источниками питательных веществ, и определение содержания лизоцима в них имеет значение для оценки их качества, безопасности и потенциального использования в пищевой и фармацевтической промышленности. Однако в яйцах разных птиц количество лизоцима может отличаться. Содержание фермента может зависеть также от категории (веса и размера) яиц. В связи с этим, актуальным является вопрос о количественном содержании лизоцима в перепелиных яйцах и в куриных яйцах различных весовых категорий.
Цель исследования – сравнительный анализ содержания лизоцима в перепелиных яйцах и в куриных яйцах разных категорий с применением электрофореза и ионообменной хроматографии.
Задачи исследования:
-
Определить лизоцим в яйцах с применением электрофореза;
-
Определить лизоцим в яйцах с применением ионообменной хроматографии;
-
Провести сравнительный анализ содержания лизоцима в перепелиных яйцах и в куриных яйцах разных категорий.
Материалы и методы исследований
Анализ содержания лизоцима в куриных и перепелиных яйцах проводили с использованием методов электрофореза и хроматографии [5].
Растворы белков получали отделением белка одного яйца от желтка. Белок переносили в химический стакан и доводили раствором 1 М соляной кислоты до рН раствора до 5,0. Полученные растворы оставляли в холодильнике при температуре 4 °С на 12 ч. После отстаивания растворы центрифугировали в течение 5 мин при 7500 об/мин. Осадок отбрасывали, надосадочную жидкость фильтровали через фильтр «синяя лента».
Электрофорез проводили около часа при напряжении 180 В. По окончании электрофореза гель извлекали и проводили фиксацию, а затем окрашивание образцов. Излишки красителя удаляли при отмывке образцов горячей дистиллированной водой. Апробировали различные условия и выявили оптимальное количество образца для проведения эффективного электрофореза в ПААГ-ДСН: 5 % - концентрирующий, 15 % - разделяющий гель, ток 180 В, по 10 мкл пробы белкового раствора в лунке.
При проведении ионообменной хроматографии, непосредственно перед анализом, раствор фильтровали через мембранный фильтр PVDF с диаметром пор 0,45 мкм до отсутствия видимых включений. Далее пробы вносили в петлю-дозатор хроматографа и проводили хроматографический анализ. Апробировали условия проведения ионообменной хроматографии белкового раствора: колонка хроматографическая катионообменная UNO S6, подвижные фазы состава – А (100мМ глицерин, рН 9,3) и В (100мМ глицерин с 1 М натрия хлоридом, рН 9,3).
Результаты исследования
В работе проводили подбор концентрации и количества пробы белкового раствора для получения качественного разделения белков на фракции при работе методом электрофореза в ПААГ-ДСН.
Установили необходимость разбавления исходного раствора белков исходной пробы 0,9 % раствором хлорида натрия 10-кратно. В результате работы были получены электрофореграммы, отражающие распределение белковых фракций в яичных белках.
При их анализе была установлена разница в содержании лизоцима в исследуемых образцах (рис. 1).
Рисунок 1. ДСН-ПААГ (5 % - концентрирующий, 15 % - разделяющий гель, ток 180 В, в лунке 10 мкл пробы)
Были апробированы условия хроматографирования (хроматографическая колонка и подвижные фазы) белковых растворов образцов методом высокоэффективной ионообменной хроматографии. Исследовали хроматограммы ионообменной хроматографии, подтверждающие результаты электрофореза в ПААГ-ДСН. Ионообменные хроматограммы показали распределение типичных белков в яичном белке и подтвердили результаты электрофореза (рис. 2).
Рисунок 2. Хроматографические профили белков
Результаты исследования могут быть полезны для предприятий по промышленному выделению лизоцима и потребителей, которые заботятся о своем здоровье и выбирают продукты с повышенными антибактериальными свойствами. Кроме того, яйца с высокой лизоцимной активностью дольше сохраняют свои качества при хранении. Исследования такого рода можно применить для контроля качества продукции и выявления аномальных образцов.
Заключение
Апробированы различные условия и выявлено оптимальное количество образца для проведения эффективного электрофореза в ПААГ-ДСН: 5 % - концентрирующий, 15 % - разделяющий гель, ток 180 В, по 10 мкл пробы белкового раствора в лунке. Установлена необходимость разбавления исходного раствора белков исходной пробы 0,9 % раствором хлорида натрия 10-кратно.
Апробированы условия проведения ионообменной хроматографии белкового раствора: колонка хроматографическая катионообменная UNO S6, подвижные фазы состава – А (100мМ глицерин, рН 9,3) и В (100мМ глицерин с 1 М натрия хлоридом, рН 9,3). Исследованы хроматограммы ионообменной хроматографии, подтверждающие результаты электрофореза в ПААГ-ДСН.
При оценке электрофореграмм и хроматограмм было выявлено, что наибольшее количество лизоцима содержится в яйцах домашних кур, наименьшее – в перепелиных яйцах, а в куриных яйцах категорий С0, С1 и С2 количество лизоцима оказалось приблизительно одинаковым.
Планируется продолжить исследовательскую работу по данному направлению и провести количественное определение содержания лизоцима в яйцах разных видов птиц.
Список литературы
-
Бычкова М.В. Ещё раз про лизоцим // Журнал переработка молока, 2019; 11(241):39
-
Никифорова Д.В., Пашаян С.А. Биологическое значение лизоцима // Сборник трудов LVI научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Достижения молодёжной науки для агропромышленного комплекса», 2023:81
-
Овсянников В.Г., Торопкина Ю.Е., Краскевич В.В., Алексеев В.В., Бойченко А.Е., Алексеева Н.С., Краскевич Д.А. Лизоцим – грани возможного // Современные проблемы науки и образования, 2020;3:147. DOI:10.17513/spno.29903
-
Шуваева Г.П., Ворон П.А., Свиридова Т.В., Мещерякова О.Л. Новое в биотехнологии лизоцима из животного сырья // Актуальная биотехнология. 2019; 3(30):659-661. https://doi.org/10.20914/2304-4691-2019-3-659-661
-
Dong S, Jiang Z, Liu Z, Chen L, Zhang Q, Tian Y, Sohail A, Khan MI, Xiao H, Liu X, Wang Y, Li H, Wu H, Liu W, Cao C. Purification of low-abundance lysozyme in egg white via free-flow electrophoresis with gel-filtration chromatography. Electrophoresis. 2020;41(16-17):1529-1538. doi: 10.1002/elps.201900479