XXIX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

СРАВНЕНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФИТОНЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ МАСЕЛ ЛИСТЬЕВ И ЦВЕТКОВ ЧЕРЕМУХИ СОБСТВЕННОЙ МАЦЕРАЦИИ И КОММЕРЧЕСКИХ АНАЛОГОВ

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы

Романовская М.А. 1

---

1МБУДО "Созвездие"

Заостровская М.Ю. 1Плюснина А.А. 2

---

1МБУДО "Созвездие"

2Биотехнопарк

Работа в формате PDF

2.2 MB

Введение

Черёмуха обыкновенная (лат. Prúnus pádus) является широко распространённым растением на территории России, которое издревле используется в народной медицине благодаря своим бактерицидным свойствам. Археологические находки доказывают, что плоды черёмухи были востребованы ещё в эпоху палеолита. В Средние века её широко использовали в качестве антибактериального средства. Позднее эфирное масло, экстрагируемое из листвы черёмухи, служило компонентом парфюмерных композиций. Кора и другие части растения служили инсектицидами - отпугивают или убивают насекомых-вредителей. В период Второй мировой войны, в условиях нехватки современных антисептиков, сок из ягод черёмухи, применялся в качестве средства для обработки гнойных ран.

Однако, несмотря на популярность, сравнительный анализ фитонцидной активности различных частей этого растения (в частности, листьев и цветков) с другими известными эфирными маслами остаётся недостаточно изученным. Понимание различий в составе и силе действия этих масел позволит определить наиболее эффективное сырьё для дальнейшей разработки антисептических средств.

Актуальность исследования. В условиях растущей резистентности патогенных микроорганизмов к синтетическим лекарственным препаратам и антибиотикам, а также повышенного интереса общества к экологически чистым продуктам, изучение природных антимикробных средств приобретает особую значимость. Фитонциды — биологически активные вещества растительного происхождения, способные подавлять рост и развитие бактерий, грибов и простейших, — представляют собой перспективную альтернативу для создания новых препаратов в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.

Целью данной работы является сравнительное исследование фитонцидной активности эфирного масла из листьев и цветков черёмухи обыкновенной собственной мацерации по отношению к другим известным фитонцидным маслам.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить информацию о влиянии фитонцидов на микроорганизмы.

2. Экспериментально получить образцы эфирных масел из листьев и цветков черёмухи обыкновенной.

3. Провести эксперимент, позволяющий выявить влияние масел на микроорганизмы.

4. Провести подсчёт количества колониеобразующих единиц, выросших на питательных средах.

5. Проанализировать полученные результаты, выявить различия в эффективности и сформулировать выводы о потенциале использования исследованных масел.

Объектом исследования являются эфирные масла растений с высокой фитонцидной активностью.

Предметом исследования выступает сравнительная характеристика антимикробных свойств эфирных масел, полученных из листьев и цветков черёмухи обыкновенной, в сопоставлении с другими фитонцидными маслами.

1. Теоретическая часть

1.1. Теория фитонцидной активности: механизмы действия, классификация по силе.

Фитонциды (от греч. phyton — «растение» и лат. caedo — «убиваю») — это вещества, продуцируемые растениями и имеющие бактерицидные, антифунгальные (активные в отношении грибов и актиномицетов) и протистоцидные (активные в отношении клеточных простейших) свойства [1]. Фитонциды были открыты советским учёным Б. П. Токиным в 1928 году. Эти соединения играют ключевую роль в иммунитете растений, обеспечивая их химическую защиту от патогенов и вредителей, а также участвуют в аллелопатии — влиянии одних растений на другие через выделяемые вещества.

Механизмы антимикробного действия фитонцидов разнообразны и зависят от их химической структуры:

• Нарушение клеточных структур: многие фитонциды способны растворять и разрушать поверхностные слои и составные части протоплазмы микробной клетки.

• Подавление дыхания: летучие фракции могут блокировать дыхательные ферменты микроорганизмов, лишая их энергии.

• Окислительные процессы: действие ряда фитонцидов обусловлено их высокой окисляющей способностью. В результате их жизнедеятельности и распада в окружающей среде могут образовываться активные формы кислорода (например, озон и перекись водорода), обладающие мощным антисептическим эффектом.

• Специфичность действия: фитонциды обладают избирательностью. В микроскопических дозах они могут подавлять одни микроорганизмы, но стимулировать рост других (антагонистов патогенных микробов), тем самым регулируя состав микрофлоры воздуха, почвы и воды.

Выделение фитонцидов происходит постоянно, но значительно усиливается при повреждении растения (механических травмах, атаке вредителей). Различают летучие фракции (действуют на расстоянии) и нелетучие (тканевые соки), которые часто обладают более мощным и быстрым эффектом.

Сила и спектр антимикробного действия фитонцидов весьма разнообразны. В научной и учебной литературе принято выделять следующие уровни активности:

• Бактерицидное действие: способность вызывать гибель микроорганизмов. Это наиболее сильный тип действия. Фитонциды чеснока, лука, хрена, красного перца, черёмухи способны убивать многие виды бактерий, простейших и низших грибов в первые минуты и даже секунды контакта.

• Бактериостатическое действие: способность задерживать рост и размножение микроорганизмов, не убивая их полностью.

По силе воздействия растения можно условно разделить на группы:

• Сильнодействующие: фитонциды вызывают быструю гибель широкого спектра патогенов.

• Умеренного действия: растения также выделяют фитонциды, но их активность может быть ниже или направлена на более узкий круг микроорганизмов.

Степень активности зависит от вида растения, его возраста, физиологического состояния, условий произрастания (освещённость, состав почвы) и времени года.

Таким образом, фитонцидная активность представляет собой сложный комплекс химических взаимодействий, обеспечивающий выживание растений в биосфере и представляющий огромный интерес для медицины и пищевой промышленности как источник природных антибиотиков.

1.2. Характеристика черёмухи обыкновенной: ботаника, география, химический состав листьев и цветков.

Черёмуха обыкновенная (лат. Prúnus pádus L.) — это широко распространённое древесное растение, относящееся к семейству Розовые (Rosaceae) (Приложение 1).

Ботаническая характеристика: это небольшое дерево или крупный кустарник, достигающий в высоту 3–10 метров. Кора матовая, чёрно-серая, с хорошо заметными чечевичками. Листья очередные, короткочерешковые, эллиптической формы с заострённой верхушкой и пильчатым краем, тёмно-зелёного цвета. Характерной чертой является наличие прилистников, которые рано опадают. Цветки обоеполые, белые, очень душистые, собраны в длинные поникающие кисти. Плоды — шаровидные костянки диаметром около 0,8–1 см, при созревании становятся чёрными, блестящими. Цветёт в мае — июне, плоды созревают в июле — августе (Рисунок 1).

Рисунок 1. Черемуха обыкновенная

География и экология: черёмуха обыкновенная имеет обширный ареал. Она широко распространена в лесной и лесостепной зонах европейской части России, в Западной Сибири (доходит до реки Енисей), на Кавказе и в Средней Азии. Часто культивируется в садах. В дикой природе предпочитает расти по берегам рек и ручьёв, в приречных лесах, на лесных опушках, в зарослях кустарников и на прогалинах [2].

Химический состав листьев и цветков: листья и цветки черёмухи содержат комплекс биологически активных веществ [3].

Таблица 1. Химический состав листьев и цветков черемухи

Таким образом, химический профиль листьев и цветков черёмухи определяет их высокую фитонцидную активность и объясняет традиционное использование растения как природного антисептика и инсектицида.

2. Экспериментальная часть

2.1. Приготовление масляного раствора из листьев и цветов черемухи.

При приготовлении масляного раствора из листьев и цветов черемухи использовали метод мацерации в масле.

Мацерация (от лат. maceratio — «размягчение», «размачивание») - это метод жидкостной экстракции, при котором растительное сырьё (травы, цветы, корни) настаивается в растворителе (экстрагенте) при комнатной или слегка повышенной температуре. Говоря проще, это способ «вытянуть» нужное вещество из одной среды в другую.

Этапы мацерации (Таблица 2):

1. Подготовка сырья

Сырье (листья и цветы) собирали в сухую и жаркую погоду. Затем сырье перебрали, удалили посторонний мусор. Подвесили сушить с сухом, теплом и хорошо проветриваемом месте при температуре +25 - +35 С на 14 дней.

2. Смешивание фаз (контактирование)

Высушенные листья и цветы измельчили (отдельно). Уложили в стеклянные банки по 1 г сухого вещества в каждую. Добавили 40 мл нерафинированного оливкового масла холодного отжима FILIPPO BERIO Extra Virgin (пр-во Италия). Масло залили таким образом, чтобы оно покрывало сухое вещество на 1 см и сухое сырье не контактировало с воздухом и не портилось. Затем банки убрали в темное место на 4 недели, периодически встряхивая и перемешивая.

На этой стадии происходит основной физико-химический процесс: молекулы жирорастворимых веществ переходят из водной фазы в масляную фазу. Вещество стремится распределиться между двумя средами до достижения равновесия.

3. Фильтрация

По истечении 4 недель отфильтровали масло от сырья через марлю, чтобы отделить твердые частицы.

Таблица 2. Этапы мацерации листьев и цветов черемухи в масле

2.2. Выбор фитонцидных масел для исследования.

При выборе масел руководствовались критериями:

1. Масла должны быть в топ-10 масел по фитонцидным свойствам.

2. Должны быть изготовленными из древесных растений, как и черемуха.

3. Растения, из которых изготовлены масла должны относиться к разным семействам.

4. Масла должны быть от одного производителя.

Исходя из данных критериев выбрали 3 масла: лимона, можжевельника

и чайного дерева (Таблица 3) от коммерческого производителя.

Таблица 3. Фитонцидные свойства растений

2.3. Определение антимикробного потенциала эфирных масел.

Посев микроорганизмов производили в учебном классе МБУДО «Созвездие» седиментационным методом Коха на предварительно подготовленные чашки Петри с двумя питательными средами №1 ГРМ (ПС1) (Приложение 2) и №2 ГРМ (ПС2) (Приложение 3).

Седиментационный метод Коха (метод оседания) — это способ оценки микробной обсеменённости воздуха закрытых помещений, основанный на естественном оседании микроорганизмов вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля на поверхность плотной питательной среды. Метод был предложен Робертом Кохом в 1881 году. 

Питательная среда № 1 ГРМ обеспечивает рост тест-штаммов Bacillus cereus, Staphylococcus aureus и Enterobacter cloacae при температуре (332) С. Питательная среда № 2 ГРМ обеспечивает рост тест-штамма Candida albicans при температуре (232) С и подавляет рост тест-штаммов Staphylococcus aureus и Enterobacter cloacae.

При посеве микроорганизмов чашки Петри поставили на парту, открыли и оставили на 30 минут. В лабораторном центре АК «Биотехнопарк» в чашки Петри добавили экспериментальные масла и поставили в термостат: ПС1 при температуре 33 ℃ на 3 дня, ПС2 при температуре 23 ℃ на 5 дней (Рисунок 2). В последующие дни фиксировали количество колоний и вели фотофиксацию (вид колоний определяли предположительно) (Приложение 4). Данные подсчета занесли в таблицу 4 и таблицу 5.

В качестве контроля использовали положительный и отрицательный контроль: положительный контроль – чашки также открывали на 30 минут в учебном классе, но не добавляли масла, чашки с отрицательным контролем не открывали — для проверки стерильности среды и отсутствия контаминации.

Рисунок 2. Проведение эксперимента

Таблица 4. Количество колоний на ПС1

Таблица 5. Количество колоний на ПС2

Для сравнения результатов произвели расчет средних значений и занесли в таблицы 6,7 и на основании данных построили графики (Рисунок 3,4) и гистограммы (Рисунок 5,6)

Таблица 6. Среднее количество колоний на ПС1

Таблица 7. Среднее количество колоний на ПС2

Рисунок 3. Среднее количество колоний на ПС1

Рисунок 4. Среднее количество колоний на ПС2

Рисунок 5. Среднее количество колоний на ПС1 (с погрешностью)

Рисунок 6. Среднее количество колоний на ПС2 (с погрешностью)

2.4. Расчет эффективности масел

Произведем расчет эффективности действия масел по формуле

где:

ЭФм – эффективность масла, процент подавления роста колоний от их количества, выросших в контроле;

Км – количество колоний, выросших в образцах с маслом;

Кк – количество колоний, выросших в контроле.

Данные расчета занесем в таблицу 8.

Таблица 8. Эффективность масел

Согласно данным графиков и таблиц видим:

• наибольший ингибирующий эффект на бактерии (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus и Enterobacter cloacae) оказывает масло чайного дерева, его эффективность составляет 50% по сравнению с контролем;

• наибольший ингибирующий эффект на дрожжевые и плесневые грибы оказывает масло цветов черемухи и масло лимона, их эффективность составляет 60% по сравнению с контролем, также высокую эффективность оказывает масло чайного дерева - 50%;

• наименьшую ингибирующую эффективность на бактерии (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus и Enterobacter cloacae) оказывает масло можжевельника - 6,38%;

• наименьшую ингибирующую эффективность на дрожжевые и плесневые грибы оказывает масло листьев черемухи – 14%, и масло можжевельника – 20%.

3. Заключение

3.1. Результаты исследования

В результате исследования:

1. Изучили информацию о фитонцидах и их влиянии на микроорганизмы.

2. Методом мацерации в масле получили образцы эфирных масел из листьев и цветков черемухи обыкновенной.

3. Провели посев микроорганизмов в учебном классе МБУДО «Созвездие» на подготовленные чашки Петри с питательными средами №1 ГРМ и №2 ГРМ (ПС1 и ПС2), поставили их в термостат при 33℃ и 23℃ на 3 и 5 дней соответственно.

4. Провели подсчет колониеобразующих единиц, выросших на экспериментальных и контрольных чашках и предположительно определили виды колоний бактерий, плесневых и дрожжевых грибов, выросших на питательных средах ПС1 и ПС2.

5. В результате эксперимента оценили эффективность эфирных масел:

• на ПС1 лучшую эффективность показало масло чайного дерева;

• на ПС2 лучшую эффективность показали масло лимона, масло цветов черемухи и масло чайного дерева;

• на ПС1 низкую эффективность показало масло можжевельника;

• на ПС2 низкую эффективность показали масло листьев черемухи и масло можжевельника;

3.2 Выводы

Наше исследование подтвердило, что фитонциды обладают избирательной антибактериальной и фунгицидной активностью.

Самостоятельное получение эфирных масел методом мацерации позволило изучить их действие на микрофлору учебного кабинета и сравнить с коммерческими маслами по эффективности.

Эффективность фитонцидов зависит от состава микрофлоры.
На ПС1 (33 °C) лучшим оказался экстракт чайного дерева, а на ПС2 (23 °C) — лимон и цветки черемухи. Это подтверждает теорию о том, что разные компоненты фитонцидов специфичны к определенным группам микроорганизмов.

Низкую эффективность показали можжевеловое масло и масло листьев черемухи. Возможно, это связано с низкой концентрацией активных веществ в домашнем экстракте листьев черемухи или особенностями химического состава сырья.

Нужно заметить, что на ПС1 лимон показал себя хуже, чем на ПС2, а масло чайного дерева, наоборот, на ПС2 показало себя хуже, чем на ПС1. Вероятно это объясняется разным составом фитонцидов, поэтому одни фитонциды работают как антибиотики, а другие — как фунгициды.

Научная новизна: мы показали, что домашние экстракты черемухи могут конкурировать с промышленными маслами по эффективности в определенных условиях.

Практическая значимость: полученные данные позволяют подобрать оптимальные натуральные средства для санации воздуха в детских коллективах.

Список сокращений

ПС1 - питательными средами №1 ГРМ

ПС2 - питательными средами №2 ГРМ

К- - контроль отрицательный

К+ - контроль отрицательный

МЦЧ - масло цветов черемухи

МЛЧ - масло листьев черемухи

МЛ – масло лимона

ММЖ - масло можжевельника

МЧД - масло чайного дерева

Список литературы

1. Цыбуля Н.В., Фершалова Т.Д. Фитонцидные растения в интерьере (оздоравливание воздуха с помощью растений). – Новосибирск: Новосибирское книжное издательство – 2000. 112 с., 52 рис.

2. Черёмуха обыкновенная [Электронный ресурс] // Большая российская энциклопедия: онлайн-версия. — Электрон. дан. — Москва, 2023. — Режим доступа: https://bigenc.ru/biology/text/262b99. — Загл. с экрана.

3. Шашкова Е.В., Голышева Т.В., Курченко А.А. Характеристика качества и химического состава плодов сортов и новых гибридов черёмухи [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://cyberleninka.ru/article/n/harakteristika-kachestva-i-himicheskogo-sostava-plodov-sortov-i-novyh-gibridov-cheremuhi

Приложение 1.

Научная классификация

Классификация черемухи обыкновенной (лат. Prunus padus)

Приложение 2.

Питательная среда №1 ГРМ

НАЗНАЧЕНИЕ

Питательная среда № 1 ГРМ предназначена для культивирования и подсчета общего числа бактерий при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств, а также при проведении исследований в санитарной и клинической микробиологии. Выпускается в полиэтиленовых банках по 250 г.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Количественное определение микробной загрязненности объектов исследования – осуществляется микробиологическим методом. Принцип метода – визуальное обнаружение и подсчет количества жизнеспособных бактерий выросших на питательной среде при посеве исследуемых образцов.

СОСТАВ

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Питательная среда № 1 ГРМ обеспечивает рост тест-штаммов Bacillus cereus NCTC 8035 (АТСС 10702) из разведения 10-5, Staphylococcus aureus FDA 209-P (АТСС 6538-Р) и Enterobacter cloacae ГИСК A-186 из разведения 10-6 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси через (213) ч инкубации при температуре (332) С.

Приложение 3.

Питательная среда №2 ГРМ

НАЗНАЧЕНИЕ

«Питательная среда № 2 ГРМ (Сабуро)» предназначена для выращивания и подсчета общего числа дрожжевых и плесневых грибов при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств, а также при проведении исследований в санитарной и клинической микробиологии. «Питательная среда № 2 ГРМ (Сабуро)» представляет собой мелкодисперсный гигроскопичный порошок светло-желтого цвета.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Определение общего числа дрожжевых и плесневых грибов осуществляется микробиологическим методом. Принцип метода – визуальное обнаружение колоний в результате роста культур, выделенных из исследуемых образцов.

СОСТАВ

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

«Питательная среда № 2 ГРМ (Сабуро)» должна обеспечивать на всех засеянных чашках Петри рост тест-штамма Candida albicans NCTC 885-653 через (453) ч инкубации при температуре (232) С. Питательная среда с ингибитором роста бактерий должна полностью подавлять рост тест-штаммов Staphylococcus aureus и Enterobacter cloacae.

Приложение 4

Фотографии колоний в ПС1 и ПС2