III Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ И ФИЗИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Сучкова А.В. 1

---

1СОШ 197

Пахомова Н.В. 1

---

1Школа 197

Работа в формате PDF

1.8 MB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

В первую очередь хотелось бы дать определение самой науки о дрожжах – зимологии. Казалось бы, все знают, что такое дрожжи, и этот вопрос весьма простой: без них не приготовить кислого теста, вина, пива. И все же дать научное определение дрожжам и четко очертить границы этой группы микроорганизмов становится все труднее по мере расширения наших знаний об этих микроскопических существах, которые включают в царство Mycota.

С помощью дрожжей получают большой спектр соединений, использующихся в разных областях человеческой деятельности. К ним относятся витамины, различные полисахариды, липиды, которые могут служить заменителями растительных масел, разнообразные ферменты, используемые в пищевой промышленности. Развитие генетической инженерии позволило использовать легко культивируемые дрожжи для получения многих полезных веществ животной и растительной природы, например, инсулина.

Цели: Выявить жизнеспособность и физическую активность дрожжевых грибов торговых сетей: Саф-Левюр, Саф-момент, Preston.

Задачи:

1. Определить физическую активность различных сухих дрожжевых грибов

2. Оценить жизнеспособность разновидностей дрожжевых грибов

3. Сравнить микробиологические качества дрожжей торговых марок: Саф-Левюр, Саф-момент, Preston.

В этой главе речь пойдет о строении, компонентах, способах размножения, жизнедеятельности и физической активности дрожжевых грибов. Нами также будут рассмотрены пути использования дрожжей в промышленности и изучены проблемы их микробиологического качества.

Дрожжи являются одноклеточными неподвижными микроорганизмами небольшого размера — 10-15 мкм., которые широко распространены в природе: они встречаются в почве, на листьях, плодах и стеблях растений, в пищевых субстратах растительного и животного происхождения [Пехташева, 2013].

Несмотря на одноклеточное строение, более сходное с крупными бактериями дрожжи по ультраструктурной организации клетки и способам бесполого и полового размножения относятся к грибам, а именно к микроскопическим грибам царства Mycota [Бабьева, Чернов, 2004].

Дрожжевые клетки имеют разную форму: эллипсов, овалов, палочек, шаров (см. Рис. 2). Размерность также бывает разная: часто длина составляет 6-12 мкм, а ширина 2-8 мкм. Это зависит от условий культивирования, питательных компонентов, факторов внешней среды и условий их обитания. Стоит отметить, что «в диком состоянии дрожжи не известны» [Еленевский и др., 2005: 1259]

Во всех дрожжевых клетках содержится около 75% воды, на 50-60% — это связанная внутриклеточная, а остальные 10 — 30% — освобожденная. В сухом веществе клетки в зависимости от возраста и состояния в среднем содержится:

• азот 45—60 %;

• сахар 15—40 %;

• жир 2,5—13 %;

• минералы 7—11 %

• помимо этого, клетки включают в себя ряд важных компонентов, необходимых для их метаболизма — ферменты, витамины [Microbac].

Дрожжевые организмы имеют все стандартные компоненты, присущие эукариотическим клеткам, однако, помимо этого, обладают уникальными отличительными свойствами грибов, а именно, сочетанием признаков как растительной, так и животной клеток:

• стенки ригидны, как у растений;

• отсутствие хлоропластов и наличие гликогена, как у животных.

Клетки содержат мембраны, цитоплазму, а также такие органоиды, как:

• ядро;

• Гольджи аппарат;

• Митохондрии клеток;

• рибосомный аппарат;

• жировые включения, зерна гликогена, а также валютин [Бабьева, Чернов, 2004]. (см. Рис. 3)

Отдельные виды имеют в составе пигменты. У молодых дрожжей цитоплазма является гомогенной. В процессе роста внутри них появляются вакуоли (содержащие органические и минеральные компоненты). В процессе роста наблюдается образование зернистости, происходит увеличение вакуолей. Как правило, оболочки включают нескольких слоев с включенными полисахаридами, жирами и азотосодержащими компонентами. Некоторые из видов имеют ослизнелую оболочку, поэтому часто клетки склеены между собой и в жидкостях образовывают хлопья [Microbac].

Для дыхательных процессов дрожжевым клеткам нужен кислород, но стоит отметить, что многие их виды (факультативно-анаэробные) могут обходиться временно и без него и получать энергию от процессов брожения (бескислородное дыхание), образуя при этом спирты (см. Рис. 4).В этом заключается одно из главных их отличий от бактерий: среди дрожжей нет представителей, способных жить абсолютно без кислорода.«Спектр углеродных соединений, усваиваемых дрожжами за счет аэробного дыхания, значительно шире, чем в случае брожения» и способствует более быстрому росту клеток [Бабьева, Чернов, 2004: 61].

В бескислородных условиях для своего питания дрожжи предпочитают использовать такие углеводы, как гексоза и синтезированные из нее олигосахариды. Но некоторые виды могут усваивать и другие виды углеводов — пентозу, крахмал, инулин. При доступе кислорода они способны к потреблению жировых, углеводородных, спиртовых и других веществ. Многие дрожжи хемоорганогетеротрофны, и для того, чтобы получить энергию для питания и получения энергии используют органические питательные компоненты. К основным минеральным компонентам, необходимым для роста и размножения дрожжей, относятся азот, фосфор, калий, сера и магний, которые составляют основную массу золы [Меледина, Давыденко, Васильева, 2014].

Половое размножение - это сложная цепь событий, которая включает в себя контакт двух гаплоидных клеток, их слияние, образование диплоидной зиготы, ядро которой затем либо делится мейотически с восстановлением гаплоидного состояния, либо дает начало диплоидному поколению клеток (см. Рис. 5) Иными словами, половое размножение связано со сменой ядерных фаз. У дрожжей чередование ядерных фаз проходит вместе с образованием половых гаплоидных спор – аскоспор или базидиоспор. Полный жизненный цикл включает вегетативную стадию, в течение которой клетки размножаются при помощи митотического деления, и половой цикл, включающий мейотическое деление ядра. Отличительной особенностью дрожжевых клеток является их возможность вегетативно размножаться, при сравнении с остальными грибами, что происходит как от почкование спор или, например, зигот клеток (как, например, родов Candida или Pichia). Вегетативное размножение у дрожжей может происходить в любой фазе жизненного цикла. У дрожжей встречаются различные типы полового процесса. У большинства видов в половом процессе у дрожжей участвуют обычные соматические, то есть неспециализированные клетки. Такой тип полового процесса называется соматогамией. Существуют разновидности соматогамии:

• гологамия - слияние (копуляция) двух морфологически сходных соматических клеток;

• педогамия - слияние материнской и дочерней клетки-почки;

• адельфогамия - слияние сестринских клеток-почек;

• гаметангиогамия - копуляцию специальных клеток мицелия – гаметангиев [Бабьева, 1979].

Процессы роста дрожжевых организмов зависят от таких факторов внешней среды, как температура, влажность, кислотность, осмотическое давление. Большинство дрожжей предпочитают среднюю температуру, среди них практически нет видов-экстремофилов, которые предпочитают чересчур высокую или, напротив, низкую температуру. Известно существование видов, способных переносить неблагоприятные условия окружающей среды [Квасников, Щелокова, 1991].

Часто дрожжи применяются в домашнем хозяйстве или промышленности, например, при приготовлении хлеба и напитков. Они были первыми микроорганизмами, которые человек стал использовать из-за их способности к образованию довольно больших количеств спирта из сахара. Дрожжи также используют в биотехнологических процессах при производстве лекарственных веществ таких, как инсулин, интерферон, гетерологичные белки. Более подробно о хозяйственной ценности дрожжей речь пойдет в следующем параграфе.

Сухие хлебопекарные дрожжи – биологический разрыхлитель теста в виде маленьких гранул серого цвета со специфическим запахом. Такие дрожжи используются при изготовлении хлебобулочных изделий, а также кондитерской продукции. Добавление сухих дрожжей в тесто позволяет в итоге получить сдобную выпечку [Кондитер клуб].

Так как прессованные дрожжи являются скоропортящимся продуктом, их консервируют путем высушивания. Срок годности сухих дрожжей составляет до 2 лет, если хранить их в сухом и прохладном месте. Благодаря такому сроку годности сухие хлебопекарные дрожжи больше подходят для домашнего использования, чем жидкие и прессованные, которые чаще используются в производстве. Сушеные дрожжи подразделяют на два основных типа: сухие высокоактивные и сухие высокоактивные «инстантные». Они отличаются способом подготовки перед внесением в тесто [Красникова, Кострова, 2001: 26].

В хлебопечении используют лишь два вида дрожжей сахаромицетов Sacсharomyces cerevisiae и Saccharomyces minor, более подробно речь о них будет идти во второй главе. Ценными производственными свойствами данных дрожжей являются подъемная сила (время, необходимое для подъема стандартного теста на высоту 70 мм от дна стандартной формочки), мальтазная и зимазная активность (время, затрачиваемое на выделение 10 мл СО₂ при сбраживании 1 г мальтозы), осмочувствительность (т. е. «чувствительность к определенной концентрации сахара и хлорида натрия») [Красникова, Кострова, 2001: 15].

Согласно же М. П. Нейману, важнейшими свойствами хлебопекарных дрожжей должны быть: «хорошая сбраживаемость, следовательно - высокое содержание зимазы, определенная способность к размножению, достаточное содержание энзимов для расщепления углеводов и белка, стойкость против высоких температур и прочность» [Нейман, 1935: 152].

В отношении их внешних свойств прежде всего требуют, чтобы у дрожжей были хорошие и здоровые запах и вкус. Запах хороших прессованных дрожжей свеж и приятен, чуть-чуть кисловат; вкус мягкий и чистый. Далее дрожжи должны быть нежной, равномерной, матово-желтой или беловато-желтой окраски. Белый налет на поверхности куска дрожжей может происходить из-за заражения плесневыми дрожжами или же плесневым грибком Oidium. Дрожжи более темной желтой окраски заставляют предположить примесь пивных дрожжей. Белые изломы в ядре могут указывать на примесь различных старых, следовательно — с различной влажностью дрожжей. Голубовато-серая окраска дрожжей происходит из-за железистой воды, но может быть и свойством данной расы. Она не указывает на понижение подъемной силы; но при выпечке из хорошей муки она может оказать влияние на окраску корки [Нейман, 1935].

Консистенция дрожжей тоже играет роль при их внешней оценке. Они должны противостоять нажатию пальцем, должны давать «раковинный» излом и при разминании между пальцами не размазываться. Иначе перед нами будут старые или сильно загрязненные инфекцией дрожжи. Дрожжи, изготовленные воздушным способом, почти всегда остаются прочными; дрожжи, приготовленные по старому способу, часто становятся мягкими, точно также, как слишком рано собранные или слишком хорошо питавшиеся дрожжи [Нейман, 1935].

В следующем параграфе речь пойдет о проблемах микробиологического качества дрожжей и о требованиях к продовольственной и микробиологической безопасности продукции в хлебопекарной промышленности.

В современных условиях развития хлебопекарной промышленности возросли требованиями к продовольственной и микробиологической безопасности продукции, а соответственно актуальной проблемой стало качество хлебобулочных изделий.

Для решения проблемы качества хлебобулочных изделий в последние годы разработаны новые технологии, в том числе:

• интенсивная «холодная» технология изготовления хлебобулочных изделий из пшеничной муки, с применением взаимоувязанных элементов - интенсивного замеса теста, ферментативно-активных или активированных дрожжей, комплексных улучшителей, пониженной температуры теста и др. Используется в основном на предприятиях малой мощности (пекарня) и отдельных хлебозаводах с 1 и 2-х сменным режимом работы;

• технологии на заквасках с направленным культивированием микроорганизмов, в основу которых положены оптимизация микробиологического состава с продуцированием в заквасках витаминов, антибиотиков, органических кислот и других БАД;

• комплексные технологии изготовления хлебобулочных изделий из муки с пониженными свойствами, пониженным содержанием и качеством клейковины, повышенной или пониженной ферментативной активностью, повышенной микробиологической загрязненностью и др.;

• технологии изготовления хлебобулочных изделий в зонах экологического неблагополучия, условиях жаркого климата, с удлиненными сроками хранения и др [Мовсарова, 2006].

Эффективность указанных технологий в значительной степени определяется биотехнологическими свойствами используемых хлебопекарных дрожжей [Поландова и др., 2004].

В данной главе речь пойдет о дрожжах вида Saccharomy cescerevisiae, а также о методах их исследования.

Род сахарные грибы, или сахаромицеты (Saccharomyces), объединяет как природные виды, так и «культурные» (производственные), существование которых тесно связано со всей историей бродильной промышленности. Наиболее общим признаком всех дрожжей этого рода является их способность к активному сбраживанию сахаров с образованием наибольшего, по сравнению с другими дрожжами, количества спирта (от 10 до 19% по объему). Сюда входят пивные, винные и пекарские дрожжи [Федоров, 1974].

Родовое название Saccharomyces принято сокращать до Sacch. В настоящее время в пределах названных видов получено большое количество штаммов, обладающих рядом особенностей. Например, получены штаммы, устойчивые к заражению вирусами, штаммы способные к слипанию в конце процесса (флоккулирующие штаммы), штаммы, уничтожающие виды диких дрожжей, которые загрязняют производственный процесс, и т.п [Федоров, 1974].

Морфологически все виды этого рода довольно сходны: они имеют сферические и овальные клетки, размножающиеся вегетативно почкованием. Клетки дрожжей данного вида имеют овальную, округлую, яйцевидную или слегка удлиненную форму размером (5…6)  (10…14) мкм. Иногда в цитоплазме встречаются одно-два зернышка полифосфатов. В более зрелых клетках оболочка утолщается, цитоплазма становится зернистой, число и размеры вакуолей увеличиваются. При старении культуры в цитоплазме клеток появляются капли жира в виде круглых, резко преломляющих свет блестящих включений [Красникова, Кострова, 2001].

Клетки Saccharomyces cerevisiae размножаются вегетативным образом при помощи почкования. Сначала появляется вырост на материнской клетке, затем происходит митотическое деление ядра, образование клеточной стенки и отделение клеток друг от друга. На материнской клетке остается шрам от почкования, что позволяет определить её возраст. Обычно материнская клетка может образовывать 20—30 почек [Федоров, 1974].

Saccharomycescerevisiae — один из наиболее изученных модельных организмов, на примере которого происходит исследование клеток эукариотов, они легко выращиваются и не являются патогенными для человеческого организма. По сравнению с кишечной палочкой (Escherichia coli), клетка дрожжей содержит в несколько раз больше ДНК и имеет более сложную организацию, чем бактерии. Клетки сохраняют жизнеспособность даже с множественными генетическими маркерами в своем генотипе, что существенно с точки зрения генной инженерии [Федоров, 1974].

Раздавленная капля — это метод приготовления препаратов для микроскопического изучения живых объектов. Применяется при исследовании бактерий, клеток культуры тканей, простейших, ряда водорослей и других мелких организмов. Этот метод мы применяем для выявления подвижности клеток микроорганизмов.

Наибольшее распространение получил метод выявления мертвых клеток с помощью метиленового синего. После попадания в клеточную цитоплазму под действием ферментов редуктаз этот краситель восстанавливается живыми дрожжевыми клетками до бесцветных соединений. Мертвые клетки окрашиваются в синий цвет. Эффективность данного метода зависит не только от состояния клеточной мембраны, но и от активности оксидоредуктаз в клетке.

Приборы и посуда:

микроскоп;

предметные и покровные стекла;

тонкая стеклянная палочка.

Реактивы:

метиленовая синь.

Материалы:

суспензия дрожжей концентрацией около 107 клеток/мл.

Витальное окрашивание — метод окрашивания организмов или живых препаратов их тканей для повышения контраста при наблюдении под микроскопом.

Красители, пригодные для прижизненного окрашивания, называются витальными. В отличие от многих других красителей, используемых в микроскопировании, они обладают двумя дополнительными свойствами: имеют низкую токсичность и обладают способностью легко проникать в живые клетки и их структуры через клеточные оболочки и цитоплазматические мембраны.

Метиленовый синий — используется для витального окрашивания простейших, изолированных клеток, культур тканей, тонких плёнок живых тканей. Используется раствор 1:1000 — 1:10 000. В ботанике используется для окраски вакуолей, накапливаясь в клетках, содержащих дубильные вещества. Может использоваться для окраски митохондрий(см. Рис. 7).

В настоящее время российский рынок сушеных хлебопекарных дрожжей представлен большим числом торговых марок разных стран: Франции, Финляндии, Турции, Швеции, Англии и др.

Для эксперимента нами были выбраны сухие дрожжи трех производителей «Саф-момент» (Франция), «Саф-левюр» (Россия) и «Preston» (Россия).

Для определения количества мертвых клеток на предметное стекло наносят по одной капле нефильтрованной дрожжевой суспензии и раствора метиленовой сини (1:5000). Каплю закрывают покровным стеклом, излишек жидкости собирают листком фильтровальной бумаги и через 2 мин наблюдают окрашенный препарат с помощью микроскопа. В поле зрения микроскопа считают общее количество дрожжевых клеток, затем только синие, после чего препарат передвигают и подсчет ведут в новом поле зрения. Таким образом подсчитывают общее количество клеток в трех полях зрения.

1 - мало почкуются, 2 - слабо, 3 – активно, 0 - не почкуются.

Таблица №1

Для эксперимента мы сделали три суспензии дрожжей разных производителей (см. Рис. 8). С помощью микробиологического препарата «раздавленная капля» нам удалось определить численность дрожжевых клеток каждого вида в трех полях зрения. Для точности мы так же подсчитали среднее значение трех полей.

Исходя из этих данных, мы видим, что дрожжи «Саф-левюр» в отношении численного состава содержат больше всего дрожжевых клеток.

Диаграмма №1

По данным таблицы, мы видим, что у дрожжей Саф-Левюр (2,0 условных единиц) наибольшая физическая активность в отношении почкования. А у марки Preston (1,0 условных единиц) данные намного ниже.

1. В результате наших исследований показано, что наибольшая физическая активность в отношении почкования наблюдается у дрожжей Саф-Левюр (2,0 условных единиц). Гораздо ниже данные с дрожжами марки Preston (1,0 условных единиц).

2. Оценка средней жизнеспособности дрожжевых клеток показало, что наибольший процент жизнеспособности отмечен нами в марке Саф-Левюр(47%) и Саф-момент(42%),по сравнению с маркой Preston(27%).

3. Сравнивая микробиологическую активность и жизнеспособность клетки, можно прийти к выводу, что дрожжевые клетки марок Саф-Левюр и Саф-момент отвечают большему микробиологическому качеству, по сравнению с исследованной нами маркой Preston.

4. Таким образом, наиболее микробиологическим качественными являются дрожжевые клетки марки Саф-Левюр, обладающие значительной процентной долей клеток и наибольшей отзывчивостью к повышению температуры и добавлению сахара в среду (2 из 3 балов). Такие отличия можно объяснить, как индивидуальными особенностями данной марки, так и технологическими условиями их производства.

1. Бабьева И. П., Голубев В. И. Методы выделения и идентификации дрожжей. Справ, пособие. М.: Пищевая промышленность, 1979. 120 с.

2. Бабьева И. П., Чернов И. Ю. Биология дрожжей. М.: Т−во науч. изд. КМК, 2004 г. 221 c.

3. Еленевский А. Г. и др. Учебный справочник школьника // Биология. М.: Дрофа, 2005 г. 1695 c.

4. Квасников Е. И., Щелокова И. Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования. Киев: Наукова Думка, 1991 г. 328 c.

5. Кондитер клуб: Энциклопедия кондитера // Дрожжи сухие хлебопекарные. [Электронный ресурс]. URL: http://www.konditer-club.ru/encyclopedia /suhie_hlebopekarnye_drozhzhi.htm (дата обращения: 23.04.2017)

6. Красникова Л. В., Кострова И. Е. Микробиология хлебопекарного, кондитерского и макаронного производств: Учеб. пособие. СПб.: СПбГУНиПТ, 2001. 81 с.

7. Меледина Т. В., Давыденко С. Г., Васильева Л. М. Физиологическое состояние дрожжей: Учеб. пособие. СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2013. 48 с.

8. Мовсарова З. Х. Повышение качества хлебобулочных изделий на основе регулирования биотехнологических свойств дрожжей: Дис. … к. пед. н. Москва, 2006. 161 с.

9. Нейман М. П. Зерно и хлеб / Под ред. Сарычева Б. Г., Журавлева Н. Н. Ленинград: Снабтехиздат, 1935 г. 556 c.

10. Пехташева Е. Л. Биоповреждения непродовольственных товаров: Учебник для бакалавров / Под ред. проф. А. Н Неверова. М.: Издательско-торговая корпорация «Дашков и К», 2013. 332 с.

11. Поландова Р.Д., Козюкина О.Ю., Еркинбаева Р.К. Технология хлебобулочных изделий с удлиненными сроками // Хлебопечение России №5, 2004. C. 16-17.

12. Федоров А. А. Жизнь растений: в 6-ти томах / Под редакцией А. Л. Тахтаджяна. М.: Просвещение,1974.

13. Microbac: Строение и жизнедеятельность дрожжей. [Электронный ресурс]. URL: http://microbak.ru/obshhaya-xarakteristika-mikrobov /gribi/drozhzhi.html (дата обращения: 22.04.2017)

Рис. 1. Разнообразие видов дрожжей: 1 — пекарские (Saccharomyces cerevisiae); 2 — мечниковия прекраснейшая (Metschnikowia pulcherrima); 3 — кандида земляная (Candida humicola); 4 — родоторула клейкая (Rhodotorula glutinis); 5 — родоторула красная (R. rubra); 6 — родоторула золотистая (R. aurantiaca); 7 — дебариомицес Кантарелли (Debaryomyces cantarelli); 8 — криптококк Лавра (Cryptococcus laurentii); 9 — надсония продолговатая (Nadsonia elongata); 10 — спороболомицес розовый (Sporobolomyces roseus); 11 — спороболомицес хольсатикус (S. holsaticus); 12 — родоспоридиум диобоватум (Rhodosporidium diobovatum).

Рис. 2 Строение клетки дрожжей

Рис. 3 Клетки дрожжевых организмов под микроскопом

Рис. 4 Дыхательные процессы дрожжей

Рис. 5 Процессы размножения дрожжей

Рис. 6 Методика учета физиологической активности (почкования) методом раздавления капли

1. Саф-Левюр

2. Саф-момент

3. Preston

*фотография автора

Рис. 7 Методика определения жизнеспособности дрожжевых клеток методом витального окрашивания метиленом синим

*фотография автора

Рис. 8 Хлебопекарные дрожжи разных торговых сетей под микроскопом:

1. Саф-Левюр

2. Саф-момент

3. Preston

*фотография автора