IV Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ЦВЕТКОВ ПИЖМЫ ОБЫКНОВЕННОЙ, СОБРАННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ОКРУГА Г. ТУЛЫ П. РАССВЕТ
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Актуальность исследования. В последние годы значительно возрос спрос на эффективные препараты растительного происхождения. Область их распространения довольно широка: на современном рынке можно встретить эмульсии из экстрактов, порошкообразные препараты, отвары, настои, которые производят при переработке чистого растительного сырья. Источниками такого сырья являются растения, содержащие в своем составе биологически активные вещества (БАВ), такие, как флавоноиды, алкалоиды, эфирные масла и многие другие.
Однако для того чтобы применять препараты растительного происхождения для лечения необходимо установить химическими методами пригодность лекарственного сырья.
Таким образом, проблема исследования заключается в необходимости анализа лекарственного растительного сырья на примеси и биологически активных веществ, которые благоприятно влияют на физиологические особенности организма человека.
В виде объекта исследования было собрано в июле на территории округа города Тулы п. Рассвет лекарственное сырье пижмы обыкновенная. Так как данное растительное сырье обладает богатым комплексом биологически активных веществ (флавоноиды, витамины А, С, РР, органические кислоты, дубильные и эфирные вещества).
Для исследования биологически активных веществ были применены методы химического анализа (качественный и количественный): экстракция, определение влажности и зольности, качественные реакции на определение флавоноидов в сырье, спектрофотометрический метод.
Цель исследования – изучить химический состав лекарственного сырья пижмы обыкновенной на наличие биологически активных веществ,
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать научную и методическую литературу на данную тему исследования;
2. Провести качественный и количественный анализы химического растительного сырья на наличие биологически активных веществ;
3. Провести математические расчеты на количественное содержание биологически активных веществ в сырье, сделать выводы.
Теоретико-методологическая основа исследования биологически активных веществ лекарственных растений основывается на методических разработках таких ученых как Д.А. Муравьев, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев, Н.И. Гринкевич, Е.Я. Ладыгина, Л.Н. Сафронич, В.Э. Отряшенкова.
Лекарственное сырье пижмы обыкновенной было собрано в пик цветения (июль) на лугах территории п. Рассвет округа города Тулы. Химические исследования на содержание примесей и биологически активных веществ (флавоноиды) проходили на базе научно-исследовательской лаборатории факультета естественных наук ФГБОУ ВО «Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого».
Глава 1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.1.Характеристика местоположения сбора лекарственных растений
Цветки пижмы обыкновенной (TanacetumvulgareL.) собраны на окрестных лугах п. Рассвет округа города Тулы в сухую погоду в начале цветения (июль 2016 г).
Посёлок расположен на северо-западной части Тульской области. Рельеф лежит на высоте уровня равнинной поверхности и имеет различную расчлененность. Встречаются притоки р. Упы, участки эвтрофных болот и бывшие озёра.
Климат умеренно-континентальный, занимает переходное положение от лесной зоны к лесостепи и имеет сложный почвенный покров: дерново-подзолистые, серые лесные почвы.
По распространенности растительного покрова территорию поселка можно разделить на три неравные полосы: хвойно-широколиственных лесов, широколиственных лесов и лесостепную.
Хвойно-широколиственные и широколиственные леса проходят узкую линию и образуют боры сосновых и еловых лесов. Основные представители – дуб, липа, клен остролистный, вязы; из деревьев второго яруса – клен равнинный, яблоня лесная.
Зона лесостепи чередуется с широколиственными лесами и степными участками, в основном растут березняки и осинники, водные и околоводные сообщества, луга. Из травянистых растений – пижма обыкновенная, мать-и-мачеха, ромашка аптечная, тысячелистник, полынь горькая и др. [4].
1.2. Заготовка лекарственного растительного сырья
Заготовка лекарственного сырья производится в определенное время года. Собирают ту часть растения, где в большей степени накапливаются биологически активные вещества: цветки, листья, трава, корни и корневища.
Цветки собирают в начале цветения растения (май – август), в сухую погоду. Обычно в это время они содержат больше действующих веществ, выдерживают сушку, сохраняют окраску и меньше осыпаются.
Сбор отдельных цветков (ромашка аптечная) или соцветий (пижма обыкновенная) ведут вручную или срезают ножницами. Сушат под навесом в темных местах или в сушилке при 40°C, распределяя тонким слоем.
Траву собирают в начале (мать-и-мачеха) или во время цветения (полынь горькая), июнь – середина августа.
Срезают ножницами цветущие верхушки (тысячелистник, пижма) или весь побег. Перед сушкой выбирают одревесневшие стебли и примеси, сушат в темном проветриваемом месте или в сушилке при 35-40°С.
Листья заготавливают в период бутонизации или цветения (июнь-июль). Срезают ножницами или осторожно обрывают вручную. Собирают развитые листья, а увядающие, пораженные насекомыми выбраковывают. Срезанные листья моют, провяливают на воздухе, а затем досушивают в сушилке при 60°С.
Корни, корневища собирают в период отмирания надземной части, то есть осенью (одуванчик лекарственный) или ранней весной. Выкапывают их осторожно лопатами или копалками, не травмируя поверхность корня. После сбора отделяют остатки побега и отряхивают землю. Затем промывают и сушат в светлых проветриваемых местах [5].
Глава 2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
2.1. Методики определения химического состава лекарственных растений
2.1.1. Методика определения влажности
Сырье измельчают в ступке и просеивают. Навеску массой 1,0 0,1 г помещают в предварительно взвешенный бюкс, распределяют траву ровным слоем и высушивают при 150-160 ºС. Через 10 минут бюкс вынимают, закрывают крышкой и переносят в эксикатор. После охлаждения до комнатной температуры, его взвешивают на аналитических весах. Для контроля проводят повторное высушивание пробы в течение 10 мин. Если его потеря массы не превышает 0,01 г, анализ считают законченным, в противном случае опыт повторяют.
Содержание влаги (Wa, %) рассчитывают по формуле (1):
, (1)
где: m – масса сырья до высушивания, г; m1 – масса сырья после высушивания, г.
2.1.2. Методика определения зольности
Навеску травы 1,0 0,1 г отвесить в предварительно прокаленную и взвешенную фарфоровую лодочку, поместить в муфельную печь, нагретую до 250-300 ºС.
Затем температура печи в течение 1-2 ч постепенно повышают до 850-875 ºС и выдерживают при указанной температуре 1 ч. После этого лодочку вынимают из муфельной печи и переносят в эксикатор, где она охлаждается до комнатной температуры. Затем взвешивают на аналитических весах. Для контроля проводят повторное прокаливание в течение 15 мин. Если потеря массы при этом не превышает 0,001 г, анализ считают законченным, в противном случае прокаливание повторяют.
Содержание золы (Аа, %) рассчитывают по формуле (2):
, (2)
где: mз - масса золы, г; mт- масса травы, г [2].
2.1.3. Выделение флавоноидов из растительного сырья и их качественное определение
Извлечение флавоноидных соединений проводят, сочетая метод мацерации (24 ч) и циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета до полного истощения сырья (72 ч) [1].
Флавоноиды обнаруживают по следующим качественным реакциям.
1. Цианидиновая проба или проба Шинода.
Реакция основана на восстановлении водородом карбонила пиронового кольца в кислой среде в присутствии магния и образование антоцианидинов, окрашивающихся в оранжевый или красный цвет.
Методика проведения. К 2 мл экстракта добавляют 5-7 капель концентрированной соляной кислоты и 20-30 мг порошка магния. Наблюдают красное окрашивание при наличии флавоноидных соединений.
Химизм реакции.
хроменол цианидин хлорид
2. Борно-лимонная проба (реактив Вильсона).
Методика проведения. К 2 мл экстракта добавляют 1 мл 2% раствора борной кислоты и 1 мл 2% спиртового раствора лимонной кислоты. Наблюдают появление ярко-желтого окрашивания с желто-зеленой флуоресценцией (батохромный комплекс).
Химизм реакции.
3. Реакция с хлоридом алюминия (III).
Методика проведения. К 2 мл экстракта из сырья прибавляют 1 мл 2%-ного спиртового раствора хлорида алюминия. Наблюдают желтое или желто-зеленое окрашивание.
Химизм реакции.
4.Реакция с хлоридом железа (III).
Методика проведения. К 2 мл извлечения прибавляют 2-3 капли 1%-ного спиртового раствора хлорида железа. Наблюдают зеленое окрашивание.
Химизм реакции.
5. Реакции с раствором щелочи.
Методика проведения. К 2 мл экстракта прибавляют 1-2 капли 10%-ного спиртового раствора щелочи. Раствор приобретает желтую окраску, при нагревании переходящий в оранжевый.
Флавоны, флавононы, флавонолы дают желтое окрашивание; халконы и ауроны сразу дают красную окраску; антоцианы приобретают синий цвет [3].
2.1.4. Количественное определение флавоноидов спектрофотометрическим методом
Количественное определение флавоноидов в лекарственном сырье проводят спектрофотометрическим методом, основанном на измерении поглощения комплекса флавоноидов со спиртовым раствором хлорида алюминия(III).
Методика проведения. 1 мл извлеченного раствора пижмы переносили в мерную колбу (25 мл) и доводили до метки 70%-ным этиловым спиртом. Из полученного раствора отбирали 5 мл аликвоту и добавляли 1 мл 5 %-ного раствора хлорида алюминия(III), доводя до метки 70%-ным этиловым спиртом.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина и строят градуировочный график.
УФ-спектры снимали на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Для построения градуировочного графика в мерные колбы (25 мл) вносили по 2 мл 5 %-ного спиртового раствора хлорида алюминия(III) и следующие объемы стандартного раствора рутина с концентрацией 0,1 мг/мл: 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0 мл и доводили до метки 70 %-ным этанолом.
Для определения содержания флавоноидов готовили две серии образцов с хлоридом алюминия(III) и без него (растворы сравнения), т.е. применяли дифференциальную спектрофотометрию, которая позволяет исключить влияние на результаты анализа сопутствующих веществ.
Содержание флавоноидов (в %) в пересчете на рутин и сухое сырье вычисляли по формуле (4):
, (4)
где: D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность раствора ГСО рутина; m– масса сырья, г; m0 – масса ГСО рутина, W – потеря массы при высушивании, % [6].
2.2.Результаты определения химического состава лекарственного сырья
Пижма обыкновенная (TanacetumvulgareL.) является ценным лекарственным сырьем, произрастает повсеместно на территории средней полосы России. Цветки содержат значительное количество флавоноидных соединений (лютеолин, апигенин, акацетин, кверцетин и изорамнетин), в виде различных лекарственных форм широко применяются в качестве противоглистных, желчегонных и спазмолитических средств (рис. 1) [5].
Рис.1. Пижма обыкновенная Tanacetum vulgare L.
Заготовка лекарственного растения проводилась в середине июля 2016 года на территории п. Рассвет Ленинского района Тульской области, сушили в темном проветриваемом месте в течение недели. Затем определяли растительное сырье на влажность и зольность. Массовая доля влаги – 10 масс. %, содержание общей золы – 7,5 масс. %.
Извлечение флавоноидных соединений из сырья проводили, сочетая метод мацерации (24 ч) и циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета до полного истощения сырья (72 ч). Полученное спиртовое извлечение исследовали качественными и количественными методами (рис. 2).
Рис.2. Результаты качественных реакций на флавоноиды:
1 – цианидиновая проба; 2 – борно-лимонная проба; 3 – реакция с хлоридом алюминия(III);
4 – реакция с хлоридом железа(III); 5 – реакции с раствором щелочи.
Оценку количественного содержания флавоноидов в цветках пижмы обыкновенной в пересчете на рутин проводили методом спектрофотометрического анализа. Определение основано на способности флавоноидов образовывать со спиртовым раствором хлорида алюминия окрашенный комплекс, который дает максимумы поглощения в интервале 408-420 нм.
В соответствии с методикой снимали УФ-спектры раствора с добавленным хлоридом алюминия и раствора сравнения ГСО рутина на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) при длине волны максимума поглощения.
Спектры поглощения исследуемых экстрактов имеют близкие максимумы поглощения к спектру комплекса рутина с алюминием, поэтому это флавоноидное соединение было выбрано в качестве стандартного образца.
С целью выбора аналитической длины волны предварительно были получены УФ-спектры стандартного образца (ГСО) рутина и построен градуировочный график зависимости оптической плотности от содержания рутина в растворе, который имеет вид прямой линии.
Оптическая плотность (Do) раствора ГСО рутина с концентрацией 0,022 мг/ мл и объемом 0,5 мл экспериментально получилась 0, 2408 (рис. 3-4).
Рис. 3. УФ-спектр поглощения ГСО рутина
Рис.4. Градуировочный график стандартного раствора ГСО рутина
Максимум поглощения окрашенного комплекса спиртового извлечения рутина с раствором хлорида алюминия наблюдался при длине волны 410 нм, что дает возможность использовать эту длину волны в качестве аналитической для количественного определения флавоноидов в цветках пижмы обыкновенной.
Зависимость оптической плотности от количества флавоноидов в образцах пижмы (рис. 5) 1,29284.
Рис. 5. Зависимость оптической плотности от количества флавоноидов в образце пижмы
В соответствии с оптической плотностью ГСО рутина и экстракта рассчитано содержание флавоноидов в растительном сырье по формуле (4).
УФ-спектры поглощения экстракта исследуемого образца представлены на рис. 6.
Рис. 6. УФ-спектры поглощения раствора ГСО рутина (1) и экстракта пижмы с хлоридом алюминия (2)
Результаты статистической обработки данных пяти параллельных измерений показали, что содержание флавоноидов составило 0,18 масс.% на сухое сырье.
Данные качественные и количественные методы определения химического состава лекарственного растительного сырья были экспериментально исследованы на базе научно-исследовательской лаборатории факультета естественных наук ТГПУ им. Л.Н. Толстого.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В соответствии с целью научного исследования сделаны следующие выводы:
1. Проанализирована научная и методическая литература по исследованию химического состава лекарственных растений.
2. Подобраны и апробированы методики исследования качественного и количественного химического состава флавоноидных соединений пижмы обыкновенной.
3. Проанализированы образцы пижмы обыкновенной, собранной на территории п. Рассвет округа Тулы. Установлено содержание флавоноидных соединений (0,18 масс.%).
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ
1. Государственная Фармакопея СССР. Общие методы анализа, 11-е изд. Выпуск 1. – Издательство «Медицина», Москва. – 1987. – 333 с.
2. ГОСТ 24027.2-80 Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных и дубильных веществ, эфирного масла/ Межгосударственный стандарт, 1999. – 119-136 с.
3. Гринкевич, Н.И. Химический анализ лекарственных растений: Учеб. пособие для фармацевтических вузов/ Н.И. Гринкевич, Е.Я. Ладыгина, Л.Н. Сафронич, В.Э. Отряшенкова. – М.: Высш. школа, 1983. – 176 с.
4. Дымов, В.С. Недра Тульской области/ В.С. Дымов, А.И. Сычев, В.В. Гуркин, Л.Л. Ваулин// Тула: Гриф и К., 2000. – 124 с.
5. Муравьев, Д.А. Фармакогнозия: Учебник/ Д.А. Муравьев, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев// 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2002. – 656 с.
6. Половецкая, О.С. Исследование состава флавоноидных соединений цветков пижмы обыкновенной (Tanacetum Vulgare L.)/ О.С. Половецкая, А.В. Тимохина, Н.А. Сибирякина// Молодой ученый: вызовы и перспективы. Сб. ст. по материалам XII междунар. заочной науч. – практ. конф. – № 10 (12). – М., Изд. «Интернаука», 2016. – 465 с.