V Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Гены как конструктор
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
В данное время генная инженерия окружает людей повсеместно: новые продукты которые не подвержены болезням и паразитам, искусственно выращенные кожа и органы, биологический материал которым можно печатать на специальном принтере.
Специалисты отмечают, что генная инженерия за весь период своего существования не оказала негативного воздействия на самих исследователей, не причинила вреда человеку и не принесла ущерба природе.
Ученые отмечают, что достигнутые результаты как в процессе изучения функционирования механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность организмов, так и в прикладной отрасли являются весьма внушительными. При этом перспективы представляются поистине невероятными.
Таким образом, генная инженерия активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.
Несмотря на большое значение генетики и генной инженерии в сельском хозяйстве и медицине, главные ее результаты еще не достигнуты.
Поэтому в данном проекте рассмотрена генная инженерия и перспективы ее развития.
Целями данной научно-исследовательской работы являются:
- исследование истории возникновения и развития генной инженерии;
- определение целей и задач генной инженерии;
- получение общего представления о процессе создания новых генов.
Предметом исследования выступает изучение генной инженерии и ее возможностей.
Объектом исследования выступает процесс изучения важности генной инженерии.
В соответствии с целью, предметом и объектом исследования необходимо решить следующие задачи:
- исследовать историю генной инженерии;
- определить основные причины торможения развития;
- определить перспективные возможности генной инженерии.
Изученная информация должна позволить наглядно показать значимость развития данной области.
Особую роль в этом сыграло учебно-справочное пособие «Генетическая инженерия», автором которой является Щелкунов С.Н, а так же «Наглядная биотехнология и генетическая инженерия» Р. Шмида.
Мною был проработан теоретический материал, представленный в данной работе, так же в приложенной литературе, выявлены основные проблемы застоя в развитии и определены основные направления развития данной области.
Сущность генетической инженерии.
История генной инженерии.
Ген — участок молекулы ДНК, в нем находится информация о первичной структуре какого-либо одного белка (один ген - один белок). Поскольку в организмах присутствуют десятки тысяч белков, и как следствие существует столько же генов, все гены клетки составляют ее геном.
Все клетки организма содержат одинаковый набор генов, но «рабочий» набор генов у каждой клетки уникален. Поэтому, например, нервные клетки и по структурно-функциональным, и по биологическим особенностям отличаются от клеток печени. Благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики появилась генная инженерия. Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа:
Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.
Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.
Годом рождения генетики можно условно считать 1900 год, когда Корренс, Чермак и де Фриз независимо друг от друга обнаружили определенные закономерности в передаче наследственных признаков. Открытие законов наследственности состоялось, по существу, вторично - еще в 1865 году чешский ученый-естествоиспытатель Грегор Мендель получил те же результаты, экспериментируя с садовым горохом.
Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК.
С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Двойная спираль ДНК при репликации разделяется в две нити ДНК, специальные ферменты-полимеры, собирают точные копии материнской ДНК, таким образом в клетке перед делением две совершенно одинаковые молекулы ДНК, одна из которых после деления клетки попадает в дочернюю клетку. Дочерняя клетка несет ту же самую информацию, что и материнская, следовательно выполняет те же самые функции. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.
На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК.
Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.
На данный момент совершено два фундаментальных открытия, переоценить значения которых невозможно.
Первое – это возможность работать с изолированными генами. Она получена благодаря выделению гена в чистом виде и синтезу его. Важно подчеркнуть, что для синтеза гена применяют разные методы, то есть уже имеется выбор, когда речь пойдет о таком сложном механизме как человек.
Второе достижение – это доказательство включения чужеродной информации в геном, а также функционирования его в клетках высших животных и человека.
С развитием генетической инженерии ученые получили возможность синтезировать, выделять, комбинировать и перемещать гены и любые другие фрагменты ДНК. Появилась ранее недоступная возможность изучения молекулярной организации геномов (в том числе высших эукариот).
Перестройка генотипов, при выполнении задач генной инженерии, представляет собой качественные изменения генов не связанные с видимыми в микроскопе изменениями строения хромосом. Изменения генов прежде всего связано с преобразованием химической структуры ДНК.
Информация о структуре белка, записанная в виде последовательности нуклеотидов, реализуется в виде последовательности аминокислот в синтезируемой молекуле белка. Изменение последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК, выпадение одних и включение других нуклеотидов меняют состав образующихся на ДНК молекулы РНК, а это, в свою очередь, обуславливает новую последовательность аминокислот при синтезе. В результате в клетке начинает синтезироваться новый белок, что приводит к появлению у организма новых свойств.
Сущность методов генной инженерии заключается в том, что в генотип организма встраиваются или исключаются из него отдельные гены или группы генов. В результате встраивания в генотип ранее отсутствующего гена можно заставить клетку синтезировать белки, которые ранее она не синтезировала.
Еще с 80-х годов появились программы по изучению генома человека. В процессе выполнения этих программ уже прочитано около 5 тысяч генов (полный геном человека содержит 50 - 100 тысяч). Обнаружен ряд новых генов человека. Генная инженерия приобретает все большее значение в генотерапии. Потому, что многие болезни заложены на генетическом уровне. Именно в геноме заложена предрасположенность ко многим болезням или стойкость к ним. Многие ученые считают, что в XXI веке будет функционировать геномная медицина и генная инженерия.
В тоже время энергично развивается клеточная инженерия. Микробный продуцент пополняется новым источником получения полезных веществ – культурой изолированных клеток и тканей растений и животных. На этой основе разрабатываются принципиально новые методы селекции эукариот. Особенно больших успехов удалось достичь в области микроклонального размножения растений и получить растения с новыми свойствами.
В действительности использованием мутаций, т.е. селекцией, люди начали заниматься задолго до Дарвина и Менделя. Во второй половине XX века материал для селекции стали готовить искусственно, генерируя мутации специально, воздействуя радиацией или колхицином и отбирая случайно появившиеся положительные признаки.
В 60-70гг.. XX века были разработаны основные методы генной инженерии – отрасли молекулярной биологии, основной задачей которой является конструирование in vitro (вне живого организма, а именно эта область нас интересует в первую очередь) новых функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) и создание организмов с новыми свойствами.
2. Этапы создания организмов с генетически измененной программой. 2.1. Выделение генов, содержащих необходимую информацию.
Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.
Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые «тупые» концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие. Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), Превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплементарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.
Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одно цепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие последовательности одноцепочечной ДНК
Нужная последовательность оснований вводится на клавишный пульт управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помощью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нукеотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка наполена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В данном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со скростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.
Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК(мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в отобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплементарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.
Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина). Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена.
2.2. Применение генно-инженерных технологий в медицине.
В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.
Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генно-инженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генно-инженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генно-инженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.
С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генно-инженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — игрунка обыкновенная.
Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей. Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем.
Проблема нехватки донорских органов для пересадки заставляет искать биомедицинские решения, не требующие использования донорского материала. Технологии регенеративной медицины на сегодняшний день считаются наиболее перспективными. К ним относят генную и клеточную терапию и инженеринг тканей. В последнее время бурное развитие получило ещё одно направление регенеративной медицины — 3D-биопринтинг. Суть метода — сборка тканей и органов из конгломератов клеток, подобно конструктору. Осуществляют такую сборку, или биопечать, на специально разработанных 3D-биопринтерах, подобно тому, как печатают на 3D-принтерах различные детали — послойно, по цифровой (компьютерной) трёхмерной модели. Картриджи принтеров при этом заправляют сфероидами — конгломератами клеток, которые «капают» на специальную подложку — своеобразную биобумагу. Напечатав один слой из клеточных сфероидов, сверху наносят второй, который «срастается» с первым. Так постепенно получают объёмный живой объект — ткань или орган. Один из пионеров в области биопечати органов и биофабрикации тканей — Владимир Александрович Миронов, профессор университета Вирджинии и научный руководитель компании «3D Bioprinting Solutions» (Россия). В числе его разработок аппарат для производства тканевых сфероидов и гидрогель для получения объёмных тканевых конструкторов. Именно такой гидрогель выполняет роль «биобумаги» для биопечати.
Вообще, идея вставлять в человека заранее выращенный органический орган – отличная. Посмотрим на три варианта развития технологии:
Вы берёте каркас из неорганики, засеиваете его клетками – и получаете готовый орган. Метод грубый, но работающий. Именно про него идет речь в большинстве тех случаев, когда говорят «мы напечатали орган». Проблема в том, что где-то нужно взять «стройматериал» — сами клетки. А если они есть, то глупо использовать какой-то внешний каркас, когда есть возможность просто собрать орган из них. Но самая болезненная проблема – неполная эндотелизация. Например, для бронхов, сделанных так, уровень — около 70%. Это значит, что поверхностные сосуды тромбогенны – вылечивая пациента, вы сразу же привносите ему новую болезнь. Дальше он должен жить на гепарине или других препаратах, либо ждать, когда образуется тромб и эмболия. А здесь уже с нетерпением ждут юристы США, которые готовы отыграть по старому сценарию. И проблема эндотелизации пока не решена. Возможный вариант – выделение клеток-предшественников костного мозга с помощью мобилизации специальными препаратами и хомингом на органе, но это пока очень далёкая от практики фантазия.
Второй метод крайне оригинален и очень радует своей циничностью. Берём клетку (фибробласт) пациента, добавляем 4 гена. Кладём полученную клетку в бластоцисту (зародыша животного) и начинаем выращивать зверушку. Получается, например, свинья с человеческой поджелудочной железой – так называемая химера. Орган полностью «родной», только вся инфраструктура вокруг – кровеносные сосуды, ткани и так далее – от свиньи. А они будут отторгаться. Но ничего. Мы берём свинью, вырезаем нужный орган (свинья при этом полностью расходуется), а затем убираем с помощью специальной обработки все свиные ткани – получается как бы органический каркас органа, который можно использовать для выращивания нового. Некоторые исследователи пошли дальше и предложили следующий лайфхак: давайте заменим свинью на суррогатную мать. Тут как: кроме 4 генов в клетку добавляется ещё один, отвечающий за ацефалию (отсутствие головы). Нанимается суррогатная мать, которая вынашивает нашего общего друга-эмбриона. Он развивается без головы, у ацефалов это хорошо получается. Затем – УЗИ, выяснение, что ребёнок получается неполноценный, и юридически-разрешённый аборт. Нет головы – нет человека, значит, никого мы не убивали. И тут – раз! — у нас тут появился теоретически легальный биоматериал с неразвитым органами пациента. Быстро имплантируем их! Из очевидных минусов – ну, кроме моральной стороны – организационная сложность и возможные юридические осложнения в будущем.
И, наконец, есть третий метод, про который и идёт речь. Он же самый современный — трёхмерная печать органов. И именно им занимаются в новой лаборатории. Смысл такой: не нужны неорганические каркасы (клетки сами себя прекрасно держат), не нужно у кого-то брать органы. Пациент отдаёт немного своей жировой ткани (есть у каждого, в ходе экспериментов жаловались только тощие японцы), из неё методом последовательной обработки клеток получаются необходимые конструкционные элементы. Создаётся трёхмерная модель органа, конвертируется в CAD-файл, затем этот отдаётся 3D-принтеру, который умеет печатать нашими клетками и понимает в какую точку трехмерного пространства ему нужно «уложить» конкретный тип клетки. На выходе – тканевый конструкт, который надо поместить в специальную среду, пока не начались проблемы с гипоксией. В биорекаторе тканевый конструкт «созревает». Потом орган можно «трансплантировать» пациенту.
Очевидные сложные места метода следующие:
Получение модели органа. Нужно где-то взять схему. Это довольно просто.
Получение самих клеток. Очевидно, нам нужен материал для печати органа.
Сборка принтера, чтобы клетками можно было печатать (куча проблем с образованием структуры органа).
Гипоксия (отсутствие кислорода) во время создания органа.
Реализации питания органа и его созревание до готовности.
Итак, 3D-принтер – это только кусок линии по фабрикации органов: его нужно обеспечить чертежом, материалом, а затем полученную модель органа из клеток ещё вырастить. Теперь давайте посмотрим по шагам, как все описанные выше задачи решаются.
Заключение
Проводя свою научно исследовательскую работу мне хотелось акцентировать ваше внимание на том, что несмотря на большое значение генетики и генной инженерии в сельском хозяйстве и медицине, главные ее результаты еще не достигнуты.
Перед учеными стоит колоссальная работа по определению не только функции и назначение каждого гена, но и условия, при которых происходит его активация, в какие именно периоды жизни, под воздействием каких факторов, в каких именно участках организма он включается и провоцирует синтез соответствующего белка. Кроме того, немаловажно выяснить роль этого белка в жизни организма, какие реакции он запускает, выходит ли за клеточные пределы, какую несет информацию. Достаточно сложной является проблема сворачивания белков.
Развитие исследований по генетической инженерии обещает открыть принципиально новые методы борьбы с раком – методы генетического контроля злокачественных наследственных изменений в соматических клетках, а также вооружить человека новыми средствами в борьбе за долголетие.
Разработка технологии 3D-биопринтинга играет большую роль в выращивания органов и разработке инновационных материалов, прежде всего биоматериалов - материалов, подготовленных и используемых для печати трёхмерных объектов. Ткани, лекарства (в перспективе — целые органы), изготавливаемые путём 3D-биопринтинга, в будущем смогут выступать в качестве заменителей «природных» человеческих органов, в некоторых случаях обладая свойствами, превосходящими природные органы.
Таким образом, рассмотрев необходимую литературу, в том числе и интернет-ресурсы, были решены поставленные задачи и цели проекта.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Бекиш О.-Я.Л. Медицинская биология. – Мн.: Ураджай, 2015. – с.114-119.
Грин У, Стаут Д. «Биология» / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор, Верстак - СПб.: Питер, 2017. - 672 с.
Киберштерн Ф, Стаут Д. «Гены и генетика» / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор, Параграф - СПб.: Москва, 2017. - 672 с.
Мутовин Г.Р. Основы клинической генетики. – М.: Высшая школа, 2015. – с. 83-84.
Заяц Р.С. Основы медицинской генетики. – Мн.: Высшая школа, 2015. – с. 60-65.
Фогель Ф, Мотульски А. «Генетика человека» / Ф. Фогель, А. Мотульски Верстак - СПб.: Питер, 2017. - 672 с.
Шмид, Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия / Р. Шмид - М.: Диалектика, 2014. - 327 с.
«Генетическая инженерия» (реальность, перспективы). Сборник. М.,
Генетическая инженерия Клеточная инженерия in vivo Генная инженерия [Электронный ресурс]/ 25.02.18. - Режим доступа: http://present5.com/geneticheskaya-inzheneriya-kletochnaya-inzheneriya-in-vivo-gennaya-inzheneriya/.
3D-печать органов человека [Электронный ресурс]/ 26.02.18. - Режим доступа: https://habrahabr.ru/company/invitro/blog/194064/.
3D-печать органов: революция в медицине? [Электронный ресурс]/ 22.02.18. - Режим доступа: https://hi-news.ru/science/chtivo-3d-pechat-organov-revolyuciya-v-medicine.html.
Биопринтинг функционального васкуляризированной мышь щитовидной железы построить [Электронный ресурс]/ 22.02.18. - Режим доступа: http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aa7fdd/meta;jsessionid=DB24313BD9CDEC8B00A4A62177D36E29.c2.iopscience.cld.iop.org.