VI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Микробиология чайного гриба (Medusomyces gisevi)

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Ястребова  С.И. 1

---

1БОУ г. Омска «Лицей №66»

Монтина  И.М. 1Борисова  Г.В. 2

---

1ОмГПУ

2БОУ г.Омска «Лицей №66»

Работа в формате PDF

0.9 MB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителяСвидетельство руководителя

Введение.

Есть такое понятие, как народная медицина. Издавна люди лечились настоями из трав, различными чаями и многими другими средствами. Одним таким средством можно назвать чайный гриб (Medusomyces gisevi). Напиток чайного гриба обладает профилактическими свойствами, помогает избежать множества заболеваний, а некоторые даже излечивает.

Чайный гриб – это великолепный домашний помощник, порой способный заменить доктора и приблизить момент выздоровления. [9] Уже доказано, что напиток чайного гриба может способствовать быстрому выздоровлению от таких инфекционных заболеваниях, какдифтерия, скарлатина, брюшной тиф. Некоторые источники литературу утверждают, что свойства чайного гриба, может восстанавливать слух, лечит глазные заболевания и многие другие.

В народной медицине чайный гриб применяют для лечения геморроя, фурункулеза, туберкулеза, неврастении, применяется наружно для промываний, полосканий и примочек. Все такие основное назначения чайного гриба – это профилактическое действие на организм.

Для того чтобы понять какие все такие полезные свойства включает в себя это чудный напиток, в лабораториях поводят химический анализ состава, биологии исследуют его биологические свойства и многие ученные.

Цель: Изучить культуральную жидкость на наличие микроорганизмов

Задача:

1. Проанализировать источники литературы по данной проблеме

2. Освоить методики микробиологических исследования объектов

3.Исследовать культуральную жидкость на наличие микроорганизмов, выросших на разных средах.

4. Провести посев на плотных питательных средах и описать культуральные и морфологические свойства выращенных колоний.

Предмет исследования: микробиологический состав изучаемой культуральной жидкости

Объект исследования: культуральная жидкость, полученная от чайного гриба на основе на основе черного (Приложение 1), зеленого (Приложение 2), желчегонного чая (Приложение 3).

Глава 1.

1.1 История изучения чайного гриба

Предполагается, что впервые чайный гриб появился в Китае. Есть сведения, что в период правления династии Цинь, а это 221–207 годы до нашей эры, там из чайного гриба начали готовить божественный напиток, обладавший волшебной силой. Его могли пить только короли и высокопоставленные особы, их подданным же он даже не снился. Из Китая чайный гриб постепенно перекочевал в соседние страны: в Японию, затем в Корею – и лишь потом попал в Россию [9].

В России о целебных свойствах чайного гриба стали говорить в XIX веке, до этого времени он считался освежающим, бодрящим напитком, которым угощали людей во время светских бесед, приготовленного из странного растения, напоминающего водоросли.

Долгое время считалось, что между морским индийским рисом и чайным грибом есть много общего и думали, что это одно и то же растение. Эти подозрения рассеялись в начале XX века швейцарскими ученными. В то же время было установлено, что данные особи вообще ошибочно называют грибами. На самом деле одним из компонентов, объединяющих их, является наличие в растениях уксуснокислых бактерий [9].

Чайный гриб наиболее полно было изучен именно в России. За годы изучения чайного гриба, его название менялось несколько раз. Сначала культура называлась чайным грибом, затем – волжским грибом, грибом морским, грибом маньчжурским, японской губкой, японской маткой, чайным квасом и просто квасом. Совершенно иначе чайный гриб именовался в Германии, Франции, Китае и Японии. Так, немцы предпочитали звать его чудесным грибом, французы именовали растение «фанго», китайцы – «кам-бу-ха» (слог «ха» означает «чай»), а японцы и сейчас называют его «комбуча» [9].

Современные ученые полагают, что родиной чайного гриба – Тибет. Затем он появился в Индии, Китае, потом уже России.

1.2. Микроорганизмы симбиоза гриба–бактерии.

Чайный гриб представляет собой симбиоз двух микроорганизмов, образованный несколькими видами дрожжевых грибов (Zygosaccharomycessp., Saccoharomysecsp.) и бактерий (Acetobactersp., Gluconobacteroxydans, Bacteriumgluconicum, Torula, Dekkera, Pichiasp.). В основном дрожежевые грибы, используют рода Torula.

Бактерии и дрожжевые грибы создают колонию, по внешнему виду она напоминает медузу желтовато-коричневого цвета.

Дрожжи из класса аскомицетов насчитывает около 33 родов. К этому классу относится род Saccoharomysec, который составляет основу для симбиоза чайного гриба с бактериями. Данный род включает природные виды, культурные, применяемые в промышленности. Они используются как пекарские, винные и пивные дрожжи. Вышеупомянутый род представлен клетками круглыми, овальными, иногда удлиненными. При росте на плотных питательных средах образуют пастообразные колонии серо-белого цвета. Эти виды могут сбраживать сахар. Используют дрожжи этого вида еще с давних времен в виноделии и бродильной промышленности, поэтому они более изучены.

Уксуснокислые бактерии рода Acetobacter sp. и Gluconobacter oxydans, эти группы бактерий, являются грамотрицательными палочками, которые окисляют спирт в уксусную кислоту. Они обладают стойкостью к антисептическому действию хмеля, снисходительны к этиловому спирту, кислой среде. Группы бактерий могут, портят пиво, вызывают образования мути и слизи.

В исследование напитка чайного гриба находится микроорганизмы рода Acetobacter – состоит из 11 видов, главный вид из которых Bact. aceti – уксусная палочка [1]. Палочка неподвижная, короткая, бесспоровая, аэробная, располагается изолированно, длинными палочками.

1.3. Свойства чайного гриба.

Во время исследований химических, так и биологических было установлено, что культурная жидкость чайного гриба обладает противомикробным действием. Такие свойства связаны с образованием за период роста антибиотика – медузина. Медузин не ядовит, устойчив к кислотам и нагреванию.

Помимо антибиотика, в чайном грибе содержатся витамины группы B, витамин С, витамин PP и витамин D, органические кислоты: глюконовая, молочная, уксусная, щавелевая, яблочная, лимонная, ферменты: протеаза, каталаза, амилаза – органические вещества белковой природы со свойствами катализатора. Ферменты играют важную роль и ускоряют химические процессы в организме.

Витамин С (аскорбиновая кислота) представляет собой органическое соединение, родственное к глюкозе. Источником витамина являются: свежие овощи и фрукты, зелень (апельсины, облепиха, лимоны и т.д.). Особенностью аскорбиновой кислоты является, то, что она может легко окислятся и восстанавливаться, именно поэтому она участвует во многих реакциях гидроксилирования.

Витамин PP (никотиновая кислота, никотинамид, витамин B₃) – может образовываться из триптофана, что снижает потребность в употребление витамина с аминокислотой. Встретить витамин можно в растительной пище, в отрубях, рисе, много содержание его и в печени крупного рогатого скота. Никотиновая кислота в организме человека выполняет роль кофермента. Участвует в метаболизме жиров, белков и углеводов.

Витамин D (кальциферолы) – группа соединений, относящихся к производным стеринов. Существует несколько форм витамина D, но наиболее активными среди них являются формы Вит. D₂ , Вит. D₃ . Формы витамина D₂ встречается в некоторых видах грибах, дрожжах растительных маслах, а витамин D₃ образуется в кое человека под действием УФ – лучей. У человека витамин D играется основную роль – это обеспечения нормального роста и развитие костей.

Из представителей группы B, рассмотрим витаминB₁.Витамин В₁ (тиамин) – структура витамины включает пиримидиновое и тиазоловое кольцо, соединенные метановым мостиком. Источником витамина является растительная пища (рис, горох, фасоль и др.). Витамин служит для окисления кетокислот, участвует в углеводном, жировом, белковом обмене. Тимин, улучшает циркуляцию крови и участвует в кроветворении.

Уксусная кислота образуется при уксуснокислом брожение, при гниении и брожение, например: в кислом молоке, сыре. В свободном виде можно встретить в виде солей сложных эфиров в растениях. Уксусная кислота используется в медицине, является компонентом многих лекарственных препаратов, поэтому нахождения в напитке чайного гриба, является еще одним доказательством пользы напитка.

Глюконовая кислота является веществом природного происхождения, путь образования при окислении глюкозы. Также как и уксусная кислота используется в качестве. Глюконовая кислота способна активизировать обмен веществ и повышает работу всего организма.

Молочная кислота образуется в результате действия молочнокислых бактерий, они в результате анаэробного процесса превращают углеводы в ту самую молочную кислоту. Кислоту используют, как в химической, промышленной сфере, так и в медицинской.

Щавелевая кислота является органической кислотой, которая в природе встречается в некоторых растениях. Щавелевая кислота способствует усвоению кальция, в свою очередь – это дает возможность стимулировать перистальтические функции организма.

Яблочная кислота может содержаться в свободном виде не только в культивированной жидкости чайного гриба, но и в яблоках, винограде, рябине, апельсине и др. Оксиянтарная кислота является промежуточным продуктом цикла трикарбоновых кислот, так называемый цикл Кребса. Применение свое кислота нашла как в пищевой промышленности, так и медицине.

Лимонная кислота, как и яблочная, встречается в плодах и ягодах, находит применения в пищевой и текстильной промышленности, в медицине. Лимонную кислоту получают циклом Кребса.

По источникам в чайном грибе содержится такие ферменты, как каталаза, протеаза, амилаза. Они относятся к двум классам ферментов: оксидоредуктазы, гидролазы.

Оксиредуктазы катализируют реакция окислительно-восстановительные реакции. К оксиредуктазам относится каталаза. Каталаза – это фермент катализирующий разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Биологическая роль состоит в том, что каталаза разрушает молекулу перекиси водорода, образующихся в клетках.

Гидролазы катализируют реакции гидролиза. В исследованной жидкости содержатся ферменты класса гидролаз – протеаза, амилаза.

Протеазы способствуют расщеплению протеина на аминокислоты, и играет существенную роль в животном белке.

Амилаза – это фермент, катализирующий гидролитическое расщепление углеводов. Образование амилазы происходит преимущественно в слюной железе и поджелудочной. Амилаза предотвращает повышения с содержание сахара в крови, расщепляя крахмал.

Без ферментов невозможно нормальное развития и жизнедеятельность организма. С возрастом содержание ферментов в организме падает, возможность поддержание ферментного состава дает чайный гриб

В 1947 году изучением чайного гриба занимались ученные Г.А. Шакарян и Л.Т. Даниелян. В результате их работы было выявлено много антибактериальных веществ: кристаллических бактериацидий КА, КБ, КМ.

В 1952 году К.М. Дубровский изучал влияние чайного гриба на развития острых и хронических заболеваний. Именно ему получилось добыть медузин, который вошел в лекарство названное ученым «ММ» – медузоминетин. Лекарство обладает терапевтическими, антимикробными и бактерицидными свойствами.

По полученным данным медиков, было выявлено, что биологические особенности чайного гриба, физико-химические свойства и химический состав самого настоя, установили механизм его действия на микроорганизмы. Оказалось, что настой влияет на антигенные свойства патогенных микробов, на биологические факторы микробов, обладает антибактериальной активностью, токсическими и фармакологическими свойствами. Почти сразу после этого препараты чайного гриба были разрешены к практическому применению[7].

Глава 2 Практическая часть

2.1. Методика микроскопии.

Основными задачами микроскопии является выявление микроорганизмов в различных объектах, ориентировочная идентификация микроорганизмов в образцах, определение морфологических признаков и структур организмов, изучения окрашенных мазков из колонии и структур.

На практике больше всего отдают предпочтение к световой микроскопии. Световая микроскопия позволяет увеличивать объект в 2-3 тысячи раз, возможно цветное и подвижное изображения объекта. Различают несколько приемов микрокопирования живых объектов. Нативные препараты готовят для живых неокрашенных бактерий. Наиболее распространенными являются: метод «Висячей капли», «раздавленной капли», «отпечаток», «агаровая пленка».

Для метода «раздавленная капля», микропрепарат готовят следующем образом: на предметное стекло на носят каплю воды, помещают в него небольшое количество клеток микроорганизмов, размешивают, а после накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные на плотной или жидкой питательной среды, переносят в каплю, воды бактериологической петлей, а микроорганизмы, находящиеся в жидкости, переносятся стерильной пипеткой, в этом случае каплю воды можно не наносить.

2.2 Методика приготовление питательной среды

Культивирование микроорганизмов самый распространенный метод в микробиологии. Для этого нужны особые субстраты – питательные среды, где микроорганизмы питаются, дышат, размножаются и т.д. Есть особые условия для создания питательной среды, т.е. они должны способствовать всем условиям жизни микробов. Мы использовали стандартную методику приготовления МПА.

2.3 Техника посева

На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Существует много техник посева на питательную и жидкую среду, исследование мы воспользовались посевом штрихом.

Посев штрихом нужно осуществлять на свежее приготовленных питательных средах. Чтобы сделать посев на питательную среду, понадобится бактериальная петля, дистиллированная вода, спиртовка, спички, образец исследования. Первым шагом, обжигаем петлю под пламенем спиртовки, для того чтобы убить уже существующие бактерии на петле, затем отпускаем в дистиллированную воду, чтоб остудить петлю и не повредить исследуемый объект. Набираем петлей исследуемый объект, и проводим по питательной среде, находящийся в чашках Петри, проводим петлей по поверхности среды зигзагом от одной стенки чашки в другую. После обжигаем петлю, тем самым убив, оставшихся бактерий (приложение 4).

2.4 Приготовления мазка

Для приготовления мазка с плотной питательной среды, нужно обезжирить стеклом раствором Никифорова или 96% раствора спирта, на обезжиренное стекло наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия (0,09%). Потом берут бактериальную петлю и прокаливают на спиртовке, остужают, берут пробу с питательной средой петлей. Петлю с культуральной жидкостью растирают в капле изотонического раствора. Остатки на бактериальной петле прожигают в пламени спиртовки, мазок высушивают, фиксируют и окрашивают.

2.5 Окрашивания по Граму.

Методика окрашивание по Граму, позволяет выявить грамположительных (окрашенных в синий цвет) или грамотрицательных бактерий (окрашенных в красный цвет). К грамположительным бактериям относятся почти все кокки и спорообразующие бациллы, а к грамотрицательным – большая часть неспороносных микробов.

2.6 Описание культуральных и морфологических свойств

К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газон. В зависимости от того на какой среде выращивают микроорганизмы (на жидких или плотных) учитывают разных характеристики для описания.

Для плотных питательных сред учитывают следующие критерии:

Форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;

Размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

Поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

Профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;

Прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

Цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;

Край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;

Структуру колонии - однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;

Консистенцию колонии; определяют, прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар-агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя четырех-семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях. В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

Для описание роста микроорганизмах на жидких питательных средах, используют следующие критерии:

Степень помутнения - слабая, умеренная или сильная

Особенности пленки -тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая

При образовании осадка указывают, скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый или хлопьевидный.

Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа.

2.7 Подсчет КОЕ

Определение количество клеток высевом на плотные питательные среды проводился методом Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Результаты количественного учета микроорганизмов, проведенного методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных единицах - так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ).

Определение числа микроорганизмов этим методом включает в себя:

Приготовление разведений

Посев на платную питательную среду в чашки Петри.

Подсчет выросших колоний

Колонии микроорганизмов подсчитывают на 2 – 15 сутки инкубации. Подсчет выросших колоний, как правило, проводят, не открывая чашек Петри, для удобства каждую колонию отмечают точкой на стороне дна чашки. Для большего удобство делят чашки Петри на секторы, считают в каждом секторе число колоний и суммируют результаты, а затем вычисляют по формуле:

С – среднее число колоний на чашке Петри

n – КОЕ в 1 мл исходного инокуляра

Глава 3. Результаты

При микроскопии было выявлено, что Acetobacter aceti представляют собой вытянутые палочки (приложение 5). При подсчёте микроорганизмов в мазке, было получено (таб. 1).Микроскопию проводили с помощью микроскопа БИОМЕД при увеличении х540 х1600.

Таблица 1

Выявление микроорганизмов в культуральной жидкости чайного гриба

Исходя из данных (таб. 1), можно видеть, что в первый день микроорганизмов в составе культуральной жидкости больше, чем в последующие дни. С каждым днем процентное содержание микроорганизмов уменьшается, потому что в культуральной жидкости чайного гриба происходит образование плодового тела.

После изучения культуральной жидкости методом микроскопии, на 4 сутки был сделан посев на заранее приготовленные плотные среды.

Таблица 2

Рост колоний на плотных питательных средах

При сравнение роста микроорганизмов на питательных средах (табл. 2) выявлено, что микроорганизмы культуральных жидкостей чайного гриба, растут одинаково, не зависимо от основы напитка-субстрата. (приложение 6).

Таблица 3

Рост в жидких питательных средах

При росте на жидких питательных средах (табл. 3), выяснено, что особенность пленки одинакова у зеленого чая и желчегонного сбора ­– тонкая и рыхлая, а у черного чая наблюдается выделения газа, пленка плотная с гладкой поверхностью (приложение 7).

Определение количества клеток посевом на плотные питательные среды, проводился секторным методом (метод Коха), в результате которого было выявлено, сколько клеток понадобилось для образования колоний. В черном чае – 80000 клеток, в зеленом – 30000 клеток, в желчегонном сборе – 60000 клеток.

При окрашивании по Граму бактерии рода Acetobacter длинные палочки, оказались грамотрицательные (приложение 8).

Выводы

В результате проделанной работы, можно сделать вывод о том, что чайный гриб был известен еще до нашей эра в Китае, тогда же были известно, что чайный гриб проявляет полезные свойства. В России же о целебных свойствах чайного гриба стали, говорить только в XIX веке. Ученные доказали, что чайный гриб – это симбиоз микроорганизмов и дрожжевых грибов. В составе чайного гриба были обнаружены витамины, кислоты, ферменты и из чайного гриба был введен антибиотик медузин. Именно, из-за своего химического, биологического состава чайный гриб применяют в народной медицине при лечение различных заболеваний.

В ходе курсовой работы по микробиологии чайного гриба, были освоены методики для проведения анализа, такие: методика микроскопии, раздавленная капля; методика приготовления плотных питательных сред, МПА; приготовления мазка с плотной питательной среды; окрашивание по Граму; расчет КОЕ, секторным методом, описание культуральных и морфологических свойств.

В микробиологическом исследование культуральной жидкости чайного гриба на наличие в нем микроорганизмов, выявлено, что в напитке присутствуют микроорганизмы рода Acetobacte. При окрашивание по Граму выявлено, что данный род является грамотрицательными. На плотных питательных средах больше всего клеток на образование колоний потребовалось в напитке чайного гриба настоянного на черном чае – 80000 клеток.

Микроорганизмы, выросшие на плотных питательных средах растут одинаково не зависимо от состава напитка (табл. 2). На жидких питательных средах, плотное плодовое тело микроорганизмов образуют только микроорганизмы в напитке чайного гриба основой, которого является черный чай, при этом наблюдается выделения газа. В напитках чайного гриба полученный на основе зеленого чая и желчегонного сбора, образуется тоненькая рыхлая пленка (табл.3).

Библиографический список.

Асташкина А. П. Приготовление питательных сред и культивирование микроорганизмов, методические указания к выполнению лабораторной работы по дисциплинам «Микробиология», «Фармакология, биохимия, микробиология» и «Биотехнология» для студентов ИПР, ИФВТ дневной формы обучения/ А. П. Асташкина – Томский политехнический университет – Томск: изд–во томского политехнического университета, 2015. – 19 с.

Васильев Д. А. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: малый практикум/ Д. А. Васильев, С.Н. Золотухин, Е. А. Корнеев – 2-е издание, расширенное и дополненное. – Ульяновск, 2003.– 95 с.

Даниелян Л.Т. Чайный гриб и его биологические особенности/ Медицина, Москва, 2005. – 83 с.

Ким А. М. Органическая химия [Текст] / А.М. Ким – 4-eиздание, исправленное и дополненное – Новосибирск: сибирское университетское издание, 2004.– 844 с.

Концевая И. И. Микробиология практическое пособие / И. И. Концевая – Гомель: УО «ГГУ им. Ф. Скорины», 2011 – 125 с.

Красникова Л.В., Гунькова П.И., Савкина О.А. Общая и пищевая микробиология: Учеб.пособие. Часть II.– СПб.: Университет ИТМО, 2016. 127 с.

Неумывакин И. П. Чайный гриб. Природный целитель. Мифы и реальность, изд. Диля, 2007

Никитин Е. Б. Микробиология с основами иммунологии/ Е. Б. Никитин – Павлодар: Издательство Арман-ПВ, 2004.– 181 с.

Николаева Ю. Чай, травяные настои, чайный гриб/ Рипол-классик 2017.– 193 с.

Приложение.

Приложение 1.

Рис.1 Культуральная жидкость чайного гриба на основе черного чая

4 день (фото автора)

Приложение 2.

Рис.2 Культуральная жидкость чайного гриба на основе зеленого чая

4 день (фото автора).

Приложение 3.

Рис.3 Культуральная жидкость чайного гриба на основе желчегонного сбора 4 день (фото автора).

Приложение 4.

Рис.4 Посев на плотные питательные среды 4 день (фото автора).

Приложение 5.

Рис.5 Acetobacter aceti при микроскопии (фото автора).

Приложение 6.

Рис. 6 Образование колоний на плотных питательных средах (фото автора).

Приложения 7.

Рис.7 Рост на жидких питательных средах (фото автора).

Приложение 8.

Рис.8 Окрашивание по Граму (фото автора)