VI Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Эффективность и качество полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике мутации Лейдена

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Гуськова С.А. 1

---

1Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Средняя общеобразовательная школа №13" г.Калуги

Хегай Е.А. 1Кравцов А.К. 2

---

1ГБУЗКО "КОКБ"

2АО "Вектор-Бест" г.Новосибирск

Работа в формате PDF

0.9 MB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителяСвидетельство руководителя

ВВЕДЕНИЕ

Современная медицинская наука довольно полно исследовала систему гемостаза, однако общие скрининговые тесты, используемые для выявления маркеров тромбинемии не позволяют идентифицировать ту или иную причину склонности к внутрисосудистому свертыванию и, следовательно, этот прием недостаточен для выбора патогенетической терапии [9].

Склонность к повышенной коагуляции и формированию тромбов (тромбофилия) - глобальная проблема, основная причина смертности и инвалидизации во многих развитых странах мира. Частота венозных тромбозов, согласно мировым данным, составляет 1-2 случая на 1000 человек ежегодно [9].

Хорошо изучены различные формы тромбофилии, выявлена наследственная составляющая заболевания и установлены причины заболевания на молекулярно-генетическом уровне.

Особого внимания ученых заслуживают наследственные дефекты в системе гемостаза, обуславливающие состояние предтромбоза и предрасположенности к тромбозу, поскольку встречается у лиц молодого возраста и зачастую протекают без клинических проявлений [9].

Актуальность работы состоит в том, что полимеразная цепная реакция (ПЦР) является уникальным методом диагностики, и преимущество ее в определении полиморфизма.

Цель настоящего исследования – раскрыть перспективы использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике мутации Лейдена.

Задачи:

1.Дать краткий научный обзор проблемы лабораторной диагностики мутации Лейдена;

2.Изложить основные характеристики метода ПЦР;

3.Провести реакцию ПЦР;

4.Проанализировать полученные результаты;

5.Описать дальнейшую стратегию проекта.

Гипотеза: основным лабораторным методом для диагностики мутации Лейдена является полимеразная цепная реакция.

Объект исследования: венозная кровь.

Предмет исследования: использование ПЦР в лабораторной диагностике мутации Лейдена.

Методы исследования:

1. Изучение литературы.

2. Проведение эксперимента.

3. Анализ результатов.

Теоретическая новизна: на примере Калужской области России рассматриваются проблемы лабораторной диагностики мутации Лейдена.

Научная новизна работы: определен адекватный метод лабораторной диагностики мутации Лейдена полимеразная цепная реакция.

Практическая новизна: впервые в Калужской области России проведено внедрение в практическое здравоохранение методом ПЦР генетического полиморфизма человека. Получены новые данные о распространенности полиморфизма среди детского и взрослого населения.

Практическая значимость работы: исследователям в области медицины учитываются особенности каждого пациента, уникальное средство ранней диагностики позволяет направить человека на консультацию и лечение по нужному пути.

ГЛАВА I. ДИАГНОСТИКА СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

Мутация Лейдена в научных исследованиях

Тромбофилия - состояние системы крови, проявляющееся в нарушении гемостаза и склонности к развитию тромбов различной локализации. Отдельные полиморфизмы по – разному влияют на развитие патологических состояний. Наибольшее значение имеет мутация в гене F5. Коагуляционный фактор V является одним из важных компонентов свертывающей системы крови. Его функция заключается в активизации реакции образования тромбина из протромбина [8].

Впервые мутация была выявлена и описана группой ученых, работавших в городе Лейден (Нидерланды). Отсюда она и получила свое название — «мутация Лейден».

Лейденская мутация гена V фактора свертывания крови характеризуется заменой нуклеотида гуанина на нуклеотид аденин в позиции 1691. Это приводит к замене аминокислоты аргинина на аминокислоту глутамин в позиции 506 в белковой цепи. Каждую аминокислоту кодирует три нуклеотида ДНК, называемые кодоном. Поэтому лейденская мутация может обозначаться как G1691A (гуанин на аденин); Arg506Gln (аргинин на глютамин). При такой замене фактор V не расщепляется естественным антикоагулянтом протеином С в положении 506, как это происходит в норме, а становится устойчивым к его действию. Возникает резистентность V фактора к протеину С. В результате этой резистентности в крови повышается концентрация V фактора свертывающей системы, что приводит к тромбозам. При мутации фактора V возникает пожизненный риск тромбозов, который почти в 8 раз выше, чем без мутации, а при гомозиготном носительстве — почти в 90 раз [6].

Диагностика тромбофилии

Генетическая предрасположенность к тромбофилии – это не диагноз, а склонность к развитию тромбозов и других сердечно - сосудистых заболеваний в определенных ситуациях.

Скрининг генетических особенностей помогает на раннем этапе выявить пациентов группы риска и внести соответствующие коррективы в тактику их ведения [7].

Для того чтобы понять, реализуется ли генетическая предрасположенность, за состоянием пациентов необходимо наблюдать с помощью рутинных лабораторных исследований [6].

1.2.1. Коагулограмма – основные понятия

Оценка состояния системы антикоагулянтов проводится по их функциональной активности в рамках исследования коагулограммы. Это сложный комплексный анализ. Врач оценивает не столько каждый конкретный показатель в отдельности, сколько цельную картину свертывания крови. Два глобальных теста, которые должны быть - активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и протромбин. Остальные тесты в разных комбинациях дополняют картину (приложение № 1 рис.1) [1].

Диагностику лейденовской мутации фактора V проводят путем определения АЧТВ без активированного протеина С (белок системы гемостаза) и c ним. Резистентность к активированному протеину С устанавливается по способности плазмы больного противостоять пролонгированию АЧТВ, вызванному добавлением активированного протеина С [6,7]. Однако в большинстве случаев никаких отклонений выявить не удается. Чувствительность анализа составляет 85%, а специфичность – 90%. Исследование можно проводить не менее чем через 2-3 недели после завершения антикоагулянтной терапии, проводимой в связи с тромбозом картину (приложение № 1 рис.2).

1.2.2. Принцип метода ПЦР

ПЦР - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале. Процесс увеличения числа копий ДНК называется амплификацией.

Принцип метода основан на амплификации in vitro заданных фрагментов ДНК человека и последующей детекции кривых плавления продуктов ПЦР и специфических зондов с полностью или частично известной последовательность [5].

Для реализации этого принципа необходимо наличие реакционной смеси, в состав которой должны входить следующие компоненты: (приложение № 2, рис.3).

*Праймеры состоят из оснований ДНК и РНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания.

*Tag – полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3^/ - конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

*Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Это строительный материал, используемый Tag – полимеразой для синтеза цепи ДНК.

*Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение pH.

*Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, служащую мишенью для последующего многократного копирования.

Процесс амплификации состоит из трех этапов: (приложение №2, рис.4)

Денатурация ("плавление") ДНК.

Переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под действием высоких температур

Отжиг - связывание праймеров с матричной ДНК.

Присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК – мишени. Праймеры производители реагентов подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Элонгация (синтез) цепи.

После отжига праймеров Tag – полимераза, которая с максимальной эффективностью начинает синтез второй цепи ДНК от 3^/ - конца праймера, связанного с матрицей т, и движется в направлении от 3^/ - к 5^/ концу.

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается (приложение №2, рис.5).

Для анализа в режиме реального времени используют специальные ДНК - амплификаторы с оптическим блоком, позволяющие детектировать сигнал внутри реакционной пробирки во время каждого цикла (приложение №2, рис.6).

ГЛАВА II. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И КАЧЕСТВО МЕТОДИКИ ПЦР

2.1. Оборудование и материалы

Для проведения исследования включена группа пациентов, из обращавшихся за медицинской помощью в стационар (включая амбулаторное отделение) за 2018 год. В работе тестировано 69 образцов плазмы крови (23 мужчины и 46 женщин). Группа состоит из пациентов с диагнозом «нарушение свертываемости крови, неуточненное» в возрасте от 3 – х дней до 70 лет - 55 человек. Группа контроля составляет 14 пациентов без венозной тромбоэмболии соответствующего возраста.

Забор материала произведен в условиях процедурного кабинета, сертифицированным медицинским персоналом соответствующего профиля, ГБУЗ КО «КОКБ». Пробы доставлены в клинико - диагностическую лабораторию областной клинической больницы.

Процедуры с кровью на преаналитическом этапе, в том числе сроки и длительность центрифугирования, время хранения образцов до момента постановки тестов проведено согласно правилам проведения преаналитических мероприятий [4].

* Материал для исследования: цельная кровь (2 - 3 мл), взятая с ЭДТА.

* Амплификатор «CFX96 Touch TM Real-Time PCR Detection System» («Bio-Rad», США). Температурный режим: 50⁰С-2 мин; 95⁰С-1 мин; 50 циклов-94⁰С-10 с, 60⁰С- 20 с; градиент 27-75⁰С с шагом в 1⁰С, инкубация 5 с на каждом шаге и регистрация флуоресценции. Полученные результаты анализировали с помощью программы «РеалБест-Генетика» (ЗАО «Вектор-Бест»).

* ПЦР-боксы UVC/T-AR Biosan

* Пипетки (дозаторы) механические 1-20 мкл, 20-200 мкл, 50-1000мкл

* Вортекс Микроспин FV-2400, Biosan

* Штативы "рабочее место" для пробирок 1,5 и 0,2 мл

* Перчатки без талька

* Лабораторная микроцентрифуга Eppendorf MiniSpin

* Набор реагентов «РеалБест - Генетика F2/F5»

* ПЦР-пробирки 0,2 мл

2.2. Выделение ДНК

Для выделения ДНК из образцов плазмы крови с помощью магнитных частиц применяли набор «РеалБест Генетика» (ЗАО «Вектор-Бест»). Исследование проводили согласно инструкции к набору (приложение № 3, рис.6).

Этапы пробоподготовки (приложение № 3, рис.7-9):

* лизис - к исследуемым образцам добавляют лизирующий раствор и магнитные шарики;

* изоляция НК - выделенная ДНК связывается с магнитными шариками;

* освобождение от ингибиторов - вымывание клеточных элементов в процессе отмывания;

* элюция - переведение ДНК с помощью низкосолевого буферав раствор.

2.3. Постановка ПЦР

Для выявления ДНК в полученных образцах нуклеиновых кислот использовали набор реагентов «РеалБест Генетика Гемостаз». Сама реакция проходит в одноразовой пластиковой микропробирке, которую помещают в амплификатор Real – time CFX96 (Bio - Rad, США) (приложение №4, рис.10). Задача прибора – поддерживать, быстро менять заданный температурный режим, держать ее в течение заданного времени и переходить к следующему этапу. Измерение проводят в режиме реального времени, его результатом являются кривые плавления (приложение №4, рис.11-12).

Детекция осуществляется по двум каналам: А – канал FAM, B – канал ROX. В канале FAM видны кривые плавления, соответствующие генотипам: А/А – нормальная гомозигота (температура плавления Tm = 47), A/G– гетерозигота (Tm = 47/55), G/G– мутантная гомозигота (Tm = 55).

В канале ROX видны кривые плавления, соответствующие генотипам: А/А – нормальная гомозигота (температура плавления Tm = 48), A/G– гетерозигота (Tm = 48/59), G/G– мутантная гомозигота (Tm = 59).

Варианты заключений по этому гену:

G/G – то есть в обоих вариантах генов гуанин, замены нет, то есть вариант гена без лейденской мутации.

G/A – в одном варианте есть полиморфизм, называемый лейденской мутацией, а в другом нет (гетерозигота).

A/A – в обоих вариантах генов обнаружен полиморфизм G1691A.

2.4. Результаты и обсуждение

По данным исследования, распространенность лейденской мутации среди населения, проживающего на территории Калужской области, в целом по группе составила 6 человек (8,6%) (приложение №5, таблица 1). Гомозиготная форма мутации не выявлена. Одна из причин - может быть малое число образцов в аналитической серии (приложение №5, таблица 2), т.к. гомозиготное носительство патологического аллеля встречается крайне редко, но относится к строгим факторам риска тромбоза (увеличение риска от 7 до 80 раз) [4].

Для определения диагностической эффективности показателя, имеющего предикторную роль, проводили расчет индекса отношения шансов OR (odds ratio). OR определяется как шансы развития заболевания при наличии фактора риска (мутации), деленные на шансы развития заболевания без наличия фактора риска (мутации). OR >1 говорит об увеличении риска заболевания при наличии мутации [3].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что в мировой практике молекулярно – генетический анализ не используется в качестве скринингового, действительность показывает, что вопрос терапии не может решаться без генетического тестирования пациентов с целью выявления наследственной предрасположенностью к тромбозам.

Таким образом, проведя исследовательскую работу, я могу сделать следующие выводы:

ПЦР – основной оптимальный метод лабораторной диагностики.

ПЦР – этоспособ наработки в больших количествах и выявления специфических участков нуклеиновых кислот: ДНК и РНК

Проведена реакция ПЦР.

Образцы генотипированы по антигену F5. Получены результаты(приложение № 5, таблица 1).

Статистический анализ полученных результатов не выявил достоверных отличий от средних по Европейской популяции. Частота встречаемостиисследуемой мутации Лейдена согласуется с литературными данными о частоте встречаемости этого полиморфизма в России (около 5%) [10].OR = 1,3. Мутация позитивно ассоциирована с тромбоэмболией (приложение №5, таблица 3).

В начале своей работы я выдвигала гипотезу, чтоосновной лабораторный метод для диагностики мутации Лейдена – полимеразная - цепная реакция. Применение метода дает возможность определять обоснованную профилактику и лечение и, тем самым снижать риск тромботических осложнений. Эффективность диагностики и лечения во многом зависит от понимания врачом возможностей использования данных генетического анализа для выяснения механизмов развития наследственной тромбофилии.

Печатные источники

Долгов В.В. Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М.: Издательство «Триада», 2005.

Власов В.В. Эффективность диагностических исследований. М.: Медицина, 1988. 256 с

ГОСТ Р 50779.42-99. Статистические методы. Контрольные карты Шухарта.

Меньшиков В. В. Обеспечение качества лабораторных исследований. Преаналитический этап. Москва – 1999. С.252-262; 306

Цветовская Г.А., Чикова Е.Д., Лифшиц Г.И. и др. // Фундаментальные исследования. 2010. No 10. С. 72–79.

Doix S., Mahrousseh M., Jolak M. e.a. Factor V Leiden and myocardial infarction: a case, review of the literature with a meta-analysis // Ann Cardiol Angeiol (Paris). - 2003. - V. 52, N 3. - P. 143-149.

Miletich J.P., Prescott S.M., White R., Majerus P.W., Bovill E.G. Inherited predisposition to thrombosis. Cell 1993; 72: 477 — 80.

Nachman R.L., Silverstein R. Hypercoagulable states. Ann Intern Med 1993; 119: 819 — 27.

Williams P.S. and Morgan L//Pharmacogenomics Pers.Med.2012/ V.5.P.37-51.

Интернет – ресурсы

URL: https://meduniver.com/Medical/genetika/trombofilia.html MedUniver (дата обращения 28.09.2018).

Приложение № 1

Диагностика системы гемостаза

Рис. 1. Коагулограмма

Рис. 2. STA COMPACT (Stago, Франция)

Приложение № 2

Полимеразная цепная реакция

Рис. 3. Основные компоненты реакционной смеси для ПЦР.

Рис. 4. Процесс амплификации

Рис. 5. Общая схема ПЦР Рис. 6. Амплификатор «CFX 96 Touch» («Bio-Rad», США)

Приложение №3

Выделение нуклеиновых кислот

Рис. 7. Наборы производителя Рис. 8. Первый этап выделения

Рис. 9. Схема выделения.

Приложение№ 3

Постановка ПЦР

Рис. 10 Амплификатор «CFX96 Touch», («Bio-Rad», США).

Рис. 11. График зависимости производной флуоресценции от температуры и кривые плавления при выявлении генотипов с помощью ГРС-1 набора «РеалБест - Генетика F2/F5».

Рис. 12. Анализ оптических измерений прибором «CFX96 Touch», («Bio-Rad», США).

Приложение №5

Анализ результатов

Таблица 1. Результаты определения мутации их двух различных групп.

Таблица 2. Выявление мутации Лейдена в образцах плазмы крови.

Таблица 3. Расчет индекса.