Получение биоэтанола из циллюлозосодержащего сырья при участии микроорганизмов

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Трофимова В.О. 1

---

1НУ"Школа"Престиж"

Игнатова Л.В. 1

---

1КазНУ им. аль-Фараби

Работа в формате PDF

1.5 MB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Современные способы получения энергии путем переработки горючих полезных ископаемых приводят к серьезному загрязнению окружающей среды. Поиск возобновляемых альтернативных способов получения энергии, связан, прежде всего, с использованием биосистем. Среди этих методов достаточно хорошо освоены биологические технологии превращения растительной биомассы в энергоносители (биогаз, биоэтанол, водород), так как растительные биомассы, вовлекаемые в процесс производства, характеризуются высоким содержанием целлюлозы. Активную роль в ее деструкции играют целлюлозолитические микроорганизмы. Микробная конверсия целлюлозы продолжает оставаться важнейшим направлением исследований в биотехнологии, в связи с этим активно ведется поиск и селекция микроорганизмов, способных к активной деструкции целлюлозы. Таким образом, создание коллекции целлюлозолитических микроорганизмов и получение биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья при их участии – одна из важнейших научно-производственных задач.

В последние годы, в связи с ростом цен на традиционное углеводородное топливо, истощения запасов нефти и ухудшения экологической ситуации в мире все больше внимания уделяется поиску альтернативных источников энергии, способных достойно заменить нефтяное топливо. Решением этой проблемы является использование биотоплив. Согласно прогнозам, к 2030 г. в зависимости от региона биотопливо может занять от 10 до 30% совокупного энергетического потребления. В настоящее время около 90% мирового потребления биотоплива приходится на биоэтанол и биодизель [1, 2].

Существуют следующие причины необходимости получения и использования биотоплива в Республике Казахстан:

1. Развитие сельских регионов. 2. Уменьшение стоимости топлива. 3. Предотвращение загрязнения окружающей среды. 4. Снижение объема выбросов газов, вызывающих парниковый эффект и других ядовитых веществ.

В тоже время известно, что потребителями нефти являются автомобильный, авиационный и другие виды транспорта (60–65 мас. %); тепло- и электростанции (25–30 мас. %) и нефтехимическая промышленность (10–15 мас. %). Из этого следует, что почти 85–90 мас. % потребляемой нефти сжигается. Это порождает серьезную экологическую проблему. Основным продуктом сжигания нефти является двуокись углерода. Предполагают, что повышение содержания СО₂ в атмосфере ведет к глобальному парниковому эффекту, потеплению и известным всем нам его последствиям. Вместе с СО₂ в атмосферу выбрасывается огромное количество ядовитых веществ, которые наносят непоправимый ущерб всему биоразнообразию окружающей среды [2].

Эта проблема в сочетании с топливными кризисами выявила острую необходимость в поисках новых, более экологически чистых возобновляемых видов моторных топлив. К числу таковых относятся биоэтанол, биодизель и ряд других (диметиловый эфир, метан, водород и т.п.).

Целлюлозная биомасса является наиболее распространенным биологическим материалом на Земле. Исходная база для получения биоэтанола огромна и включает как пищевое, так и непищевое сырье. К растительным непищевым материалам, которые могут быть использованы в качестве гидролизного сырья, относятся различные отходы лесопиления и деревообработки (кора, стружка, щепа, шпон, дрова, опилки, древесная мука), отходы производства и переработки сельскохозяйственных культур (хлопковая шелуха и стебли хлопчатника, кукурузная кочерыжка, подсолнечная, рисовая и просяная лузга; костра льна; солома) и ряд дикорастущих растений [3-6].

Цель проекта: сформировать коллекцию целлюлозолитических штаммов аэробных микроорганизмов, перспективных для получения биоэтанола.

Задачи:

- выделение целлюлозолитических микроорганизмов из почвенных образцов;

- скрининг штаммов микроорганизмов с высокой целлюллазной активностью;

- экспериментальное доказательство возможности получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья при участии микроорганизмов, осуществляющих его осахаривание.

Практическая база. Работа выполнена на кафедре биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби, научный руководитель к.б.н., доцент Игнатова Л.В.

1. Выделение целлюлозолитических микроорганизмов

Целлюлозолитические микроорганизмы выделяли из образцов темно-каштановой почвы (г.Алматы), используя метод приманок [4]. Образцы почвы увлажняли до пастообразного состояния (60% от полной влагоёмкости) и тонким слоем вносили в стерильную чашку Петри. На поверхность почвенных образцов наносили приманки: кристаллическую целлюлозу, фильтровальную бумагу и газету. Тем самым добивались выделения определённых физиологических групп микроорганизмов, способных усваивать сложный субстрат (рисунок 1).

а б в

Рисунок 1 - Рост микроорганизмов на целлюлозосодержащих субстратах: а) 0 сутки; б) 14 сутки; в) 94 сутки.

Материал из зоны разложения отсевали на питательный агар для дальнейшей очистки и получения чистой культуры с последующим определением микроорганизмов (рис.2).

Рисунок 2 – Колонии целлюлозолитических микроорганизмов, выделенные из почвенных образцов

В результате было выделено 17 культур бактерий и 21 изолят микроскопических грибов.

При изучении бактерий обнаружили 5 морфотипов колоний:

Белые, гладкие, блестящие, край ровный. 2. Желтые, шероховатые, блестящие, выпуклые. 3. Оранжевые, блестящие, выпуклые. 4. Круглые, блестящие, гладкие колонии с желтоватым оттенком. 5. Колонии неправильной формы, фестончатый край, гладкая поверхность.

Морфология клеток бактерий приведенных выше типов колоний, представлена на рисунке 3.

Рисунок 3 - Морфология клеток целлюлозолитических бактерий

Все морфотипы бактерий представлены спорообразующими и неспорообразующими палочковидными клетками.

Среди выделенных изолятов микроскопических грибов были определены представители трех родов Aspergillus, Trichodermaи Penicillium.

В таблицах 1-3 и на рисунке 4 приведено описание культурально-морфологических особенностей выделенных грибов.

Таблица 1 - Макро- и микроморфология микроскопических грибов рода Aspergillus

а б

в г

а - колония штамма Р-1 на 8-ой день культивирования, б - микроморфология, в - формирующиеся конидии, г - верхушечная часть конидиеносца

д е

Рисунок 4- Микроморфология грибов рода Aspergillus

д – колония штамма Р-5 на 8-ой день, е – верхушечная часть конидиеносца

культивирования при 24⁰С

Был проведён макро- и микроморфологический анализ грибов рода Trichoderma. Результаты анализа показаны в таблице 2 и на рисунке 5.

Таблица 2 - Морфологические особенности грибов рода Trichoderma

а б

Рисунок 5 - Микроморфология грибов рода Trichoderma

а - колония на 14-ый день культивирования, б - разветвленный конидиеносец с верхушечными конидиями

Макро- и микроморфологический анализ грибов рода Penicillium показан в таблице 3 и на рисунке 6.

Таблица 3 - Макроморфология микроскопических грибов рода Penicillium

а б

Рисунок 6 - Микроморфология грибов рода Penicillium

а - колония на 14-ый день культивирования, б - верхушечная часть конидиеносца

После микроскопирования чистые культуры микробов высевали штрихами на твердую среду Гетчинсона с 0,1 % натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (Na- КЦМ) для подтверждения способности изолятов усваивать целлюлозу в качестве единственного источника углерода [7-9].

В результате проделанной работы из почвенных образцов выделено 28 изолятов микроорганизмов, способных расти на среде с целлюлозой в качестве единственного источника углерода. На следующем этапе работы у всех выделенных культур определялся уровень целлюлозолитической активности.

1.2 Скрининг штаммов микроорганизмов с высокой целлюллазной активностью

Скрининг штаммов состоял из нескольких этапов. На первом из них полученные изоляты высевали на твердую агаризованную среду Гетчинсона с 0,1% Na- КЦМ для подтверждения их способности усваивать целлюлозу и определения уровня целлюллазной активности (табл.4-5).

Таблица 4 - Целлюллазная активность бактерий, выделенных из почвы

Таблица 5 - Целлюллазная активность микроскопических грибов, выделенных из почвы

Исследование изолятов микроорганизмов различных морфологических типов проводили по измерению диаметра зон просветления окраски вокруг выросших колоний после прокрашивания чашек красителем конго красным и раствором Люголя [6].

В соответствии с имеющимися литературными данными [6], зона гидролиза до 10 мм свидетельствует о низкой ферментативной активности, в диапазоне 10-20 мм о ее среднем уровне, и только свыше 20 мм высоком. Согласно полученным данным, 6 штаммов проявили низкую активность (зона гидролиза- 0-10 мм). Большинство штаммов (17) проявили средний уровень активности – зона гидролиза 10-20 мм. 5 изолятов обладали высокой активностью в данном тесте (рисунок 7, 8).

Рисунок 7 - Зоны гидролиза Na-КМЦ штаммами грибов при окрашивании конго красным

Рисунок 8 - Целлюлозолитическая активность выделенных штаммов при окрашивании колоний раствором Люголя.

На втором этапе скрининга у штаммов, вокруг колоний которых выявлены зоны гидролиза КМЦ более 20 мм, целлюлозолитическую активность определяли весовым методом. Суть этого метода заключается в определении весовой убыли целлюлозы после инкубирования с культурами микроорганизмов. Для этого исследуемые штаммы засевали в жидкую среду, в которой в качестве источника целлюлозы использовали фильтровальную бумагу «Filtrak» № 88. Учет убыли субстрата проводили через 24-72 часа инкубации, отбирая каждый раз по 3 пробы. Показателем целлюлозолитичсекой активности штаммов служила величина изменения веса целлюлозы, выражаемая в процентах от исходного значения. Результаты этих анализов приведены в таблице 6.

В результате скрининга были отобраны штаммы, в которых была отмечена убыль массы фильтра более чем на 18%. Это 3 штамма - Р-2, Р-4, Р-5. После их культивирования на среде с целлюлозой (фильтровальная бумага) происходила деградация последней на 18,96-19,21%.

Таблица 6 – Расщепление целлюлозы штаммами микроорганизмов

Таким образом, двуступенчатый скрининг 38 изолятов по уровню активности ферментов, определяемому в чашечном и весовом тесте позволил отобрать 3 активных штамма: Р-2, Р-4 и Р-5.

1.3. Определение возможности получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья при участии микроорганизмов

Одним из наиболее привлекательных направлений получения биоэтанола является использование в качестве сырья целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства и деревообработки. Главной задачей превращения такого сырья в этанол является предварительная подготовка к ферментации [17-18]. Одна из задач проводимого исследования – экспериментальное доказательство возможности получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья при участии микроорганизмов, осуществляющих его осахаривание. Для этого была проведена серия специальных экспериментов.

Культуры целлюлозолитических микроорганизмов выращивали в течение 3 дней в шейкере-инкубаторе при 37° C на питательной среде ФС-1, содержащей подсолнечный шрот. В наших экспериментах целлюлозосодержащим субстратом служила не «чистая целлюлоза», а измельченный в кофемолке подсолнечный шрот, который вносили в ферментационную среду в количестве 1%. Полученные в экспериментах и представленные в таблице 18 данные подтвердили возможность использования измельченного шрота для .образования биоэтанола.

После завершения инкубации, в культуральный бульон добавляли дрожжи Saccharomycescerevisae ИС-53 (суспендированные в стерильном солевом растворе). Ферментация проводились при 27° С в течение 5 дней в стационарном состоянии. Доза инокулята составляла 10%. Дрожжи находились в экспоненциальной фазе развития.

Процент содержания спирта в культуральной жидкости к концу культивирования определяли с реагентом K₂Cr₂O₇ [14]. Результаты этих экспериментов, представленные в таблице 8 свидетельствуют об образовании этанола из подсолнечного шрота за счет осахаривания его целлюлозолитическими микроорганизмами с последующим сбраживанием образовавшихся в среде сахаров дрожжами.

Таблица 8 – Образование биоэтанола из подсолнечного шрота в процессе совместного культивирования целлюлозолитических бактерий и дрожжей

Следовательно, значительная деградация целлюлозы может быть достигнута в смешанной культуре целлюлозолитических микроорганизмов и нецеллюлозолитических дрожжей Saccharomyces cereviseae, в которых дрожжи используют редуцирующий сахар, полученный путем микробной конверсии целлюлозы, и преобразовывают его в этанол. Этот результат отражает высокий целлюлолитический потенциал отобранных микробных штаммов.

Заключение

Таким образом, проведенные исследования по формированию коллекции целлюлозолитических штаммов аэробных микроорганизмов, перспективных для получения биоэтанола позволили установить следующие выводы:

1.Из почвенных образцов выделено 28 изолятов микроорганизмов, способных расти на среде с целлюлозой в качестве единственного источника углерода.

2. В результате двухступенчатого скрининга были отобраны 3 штамма микроорганизмов (Р-2, Р-4, Р-5), колонии которых обладали наибольшей зоной «гало» при окрашивании красителем конго красным и раствором Люголя, а также характеризующиеся убылью массы фильтра более чем на 18%.

3. Получен биоэтанол на среде, содержащей подсолнечный шрот помощью целлюлозолитических микроорганизмов и штамма Saccharomyces сerevisiae ИС-53.

Список использованных источников и литературы

Lynd L.R., Cushman J.H., Nichols R.J., Wyman C.E. Fuel ethanol from cellulosic biomass. Science. 1991. - № 251. – Р.318–1323.

Матковский П.Е., Яруллин Р.С., Старцева Г.П., Седов И.В. Биоэтанол: технологии получения из возобновляемого растительного сырья и области применения // Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология». - № 6 (86). – 2010. - С. 95-105.

Мокрушина Н.С., Тарасова Т.С., Дармов И.В. Биоконверсия древесных отходов методом компостирования с получением органического удобрения // Известия Самарского научного центра РАН. - 2009. - Т.11. - №1. - С.228-232.

Мокрушина Н.С., Тарасова Т.С., Дармов И.В. Выделение микромицетов, перспективных для разработки на их основе биопрепарата для ускоренной переработки древесных отходов в удобрение // Вестник Нижегородского университета им. Н.И.Лобачевского. - 2010, №2. - С.430-434.

Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Целлюлазы микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- Т.38.- №4. - С.355-373.

Осадчая А.И., Сафронова Л.А., Авдеева Л.В., Иляш В.М. Скрининг штаммов с высокой целлюлазной активностью // Микробиологичный журнал. – 2009. – Т.71. - № 5. – С.41-48.

Авдеева Л.В., Осадчая А.И., Хархота М.А. Целлюлазная активность бактерий рода Bacillus // Мiкробiологiя и бiотехнологiя. - 2011. - №2. - С.65-72.

Pratima G., Kalpana S., Avinash S. Isolation of Cellulose-Degrading Bacteria and Determination of Their Cellulolytic Potential // International Journal of Microbiology. – 2012. – P.1-3.

Панкратов Т. А., Дедыш С. Н., Заварзин Г. А. Ведущая роль представителей Actinobacteriaв процессах аэробной деструкции целлюлозы в сфагновых болотах // ДАН. - 2006. - Т.410. - № 4. - С.438 - 442.

Balamurugan A., Jayanthi R., Nepolean P., Vidhya R. Pallavi and R. Premkumar Studies on cellulose degrading bacteria in tea garden soils // African Journal of Plant Science. - 2011. - Vol 5 (1). - Р. 22-27.

Barman D., Saud Z.A., Habib M.R., Islam M.F., Hossain K., Yeasmin T. Isolation of Cellulytic Bacterial Strains from Soil for Effective and Efficient Bioconversion of Solid Waste // Life Sciences and Medicine Research.- Volume 2011. - Р.1-7.

Острикова Н.А., Коновалов С.А.Биосинтез комплекса целлюлозо­разрушающих ферментов смешанным культивированием микроорганизмов// Биотехнология. – 1986. –№3. – С.62–68.

Анкудимова Н.В., Баразненок В.А., Беккер Е.Г., Окунев О.Н. Целлюлазный комплекс Chaetomiumcellulyticum: выделение и свойства основных компонентов // Биохимия.- 1999. - Т.64. - В. 9. – С. 1267-1273.

Pratima Gupta, Kalpana Samant, and Avinash Sahu Isolation of Cellulose-Degrading Bacteria and Determination of their cellulolytic potential // International Journal of Microbiology. – 2012. – Vol. 2012. - P. 5.

Waghmare P. R., Patil S. M., Jadhav S. L., Byong-Hun Jeon. Utilization of agricultural waste biomass by cellulolytic isolate Enterobacter sp. Suk-bio // Govindwar agriculture and natural resources. - 52 (2018). – P. 399-406.

Saratale, G.D., Saratale, R.G., Oh, S.E. Production and characterization of multiple cellulolytic enzymes by isolated Streptomyces sp. // MDS Biomass Bioenergy. – 2012. -47. – Р. 302-315.

Sarkar, N., Ghosh, S.K., Bannerjee, S., Aikat, K. Bioethanol production from agricultural wastes: an overview // Renew. Energy. – 2012. -37. – Р. 19-27.

El-Dalatony, M.M., Kurade, M.B., Abou-Shanab, R.A.I., Kim, H., Salama, E.S., Jeon, B.H. Long-term production of bioethanol in repeated-batch fermentation of microalgal biomass using immobilized Saccharomyces cerevisiae // Bioresour. Technol.- 2016. -219. – Р. 98-105.